Sifat Dielektrik Dari Subpopulasi Leukosit Manusia

Sifat dielektrik dari Subpopulasi Leukosit Manusia Ditentukan oleh Electrorotation

sebagai Kriteria Pemisahan Sel

1 Pendahuluan

Studi dari subpopulasi leukosit sering menuntut pemisahan dan pemurnian mereka

Metode yang ada untuk mencapai ini memanfaatkan densitas sel (Boyum 1974) target

imunologi spesifik (Smeland et al 1992) atau interaksi ligan reseptor (Catur dan

Schlossman 1976) Metode ini sering tidak efisien dan membutuhkan beberapa langkah

persiapan yang melibatkan peralatan besar seperti sentrifugal magnet besar dan aliran

cytometers Jelas ada kebutuhan untuk perangkat menyortir baru yang memiliki

kemampuan untuk mengidentifikasi dan selektif memanipulasi sel melalui fenomena baru

yang dapat memperkenalkan kemampuan diskriminatif tambahan dan beradaptasi dengan

aplikasi otomatis dan mikofluida

Dielektroforesis (DEP) gerakan partikel yang disebabkan oleh interaksi antara

medan listrik AC seragam dan bidang-polarisasi induksi partikel telah menjadi subjek

studi ekstensif dalam beberapa tahun terakhir karena memiliki potensi pemisahan

noninvasif dan manipulasi sel biologis yang sesuai dengan karakteristik dielektrik mereka

di kedua mikro dan preparatif aplikasi (Washizu et al 1990 Becker et al 1994 Markx

et al 1994 Fuhr et al 1996 Gascoyne et al 1997 Huang et al 1997) Sebagai titik

awal untuk mengembangkan perangkat dielektroforesis untuk aplikasi hematologi sangat

penting untuk mengkarakterisasi perbedaan-perbedaan dalam sifat dielektrik dari individu

sub-populasi leukosit manusia Sejumlah makalah yang berkaitan dengan sifat dielektrik

darah seluruh manusia (Schwan 1983) eritrosit (Ballario et al 1984) dan T atau B-

limfosit telah dipublikasikan (Surowiec et al 1986 Ziervogel et al 1986 Bordi et al

1993 Beving et al 1994) Namun untuk yang terbaik dari pengetahuan kita analisis

komparatif dari sifat dielektrik subtipe leukosit manusia utama tidak tersedia Tujuan dari

penelitian ini adalah untuk mengetahui dan membandingkan dan kontras parameter

dielektrik dari subpopulasi unsur utama darah perifer yaitu T dan B-limfosit granulosit

dan monosit dan untuk mengetahui apakah atas dasar perbedaan parameter ini jenis sel

ini harus dipisahkan dengan metode dielektroforesis

Ketika sel terkena medan listrik berputar dalam media dengan sifat dielektrik yang

berbeda itu akan mulai berputar Analisis ini disebut electrorotation (ROT) dengan

model yang sesuai memungkinkan penentuan sifat listrik di- konstituen seluler bagi

individu utuh sel-sel yang layak (Arnold et al 1982 Fuhr et al 1990 Gimsa et al

1991a Houmllzel dan Lamprecht 1992 Huang et al 1992 Wang et al 1994) Dalam

artikel ini membran sel dan sifat dielektrik internal T dan B-limfosit monosit granulosit

dan ditandai dengan diskriminasi-sel gle sin- dalam rentang frekuensi 1 kHz sampai 120

MHz dengan pengukuran ROT dan dianalisis menggunakan shell tunggal model

dielektrik Scanning Electron Microcopy (SEM) digunakan untuk menentukan hubungan

antara leukosit sifat dielektrik diamati dan morfologi membran mereka Berdasarkan

parameter dielektrik ukuran dan karakteristik kepadatan ditemukan sel-sel ini

dsimpulkan bahwa subpopulasi leukosit harus dipisahkan oleh penyortir di-elektroforesis

2 Bahan dan Metode

21 Persiapan sel

Sampel darah periferal manusia diperoleh dari Buffy bags (Gulf Coast Regional Bank

Darah Houston TX) atau sukarelawan sehat dan normalSel dicuci dua kali dengan

larutan garam seimbang Hanks (HBSS) (Irvine Ilmiah Santa Ana CA) dan diencerkan

dengan dua sampai empat volume HBSS Granulosit T dan B-limfosit dan monosit

dipisahkan bertahap seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1

22 Granulosit

Setelah overlayering secara hati-hati empat bagian suspensi sel darah ke salah satu

bagian dari media Ficoll-Paque dengan kepadatan 1077 gml (Histopaque Sigma-

Aldrich Dorset Inggris) sel-sel disentrifugasi pada suhu kamar selama 30 menit pada

300 x g Sel mononuklear darah perifer (PBMC) dikumpulkan dari antarmuka antara

HBSS dan Histopaque gradien setelah sentrifugasi dan kemudian digunakan untuk

persiapan T dan B-limfosit dan monosit Pelet sel yang berisi eritrosit dan granulosit

kemudian dipanen Eritrosit dalam fraksi pelet segaris di amonium klorida melisiskan

solusi (826 amonium klorida 1 potassium bikarbonat 0037 EDTA tetrasodium)

dan granulocytes murni diperoleh dengan mencuci dua kali dengan HBSS untuk

menghilangkan kotoran eritrosit

23 T-limfosit

Sel dari antarmuka HBSS-Histopaque dicuci tiga kali dengan HBSS dan trombosit

telah dihapus oleh sentrifugasi lembut (200 x g selama 10 menit) Setelah mencuci sel

resuspended dalam 30 ml RPMI 1640 ditambah dengan 10 serum janin sapi (FBS) 1

mM glutamin dan 20 mM HEPES (Life Technologies Gaithersburg MD)

Gambar 1 Prosedur Pemisahan Sel Darah yang Digunakan Dalam Penelitian Ini

Sel darah merah domba (SRBC) rosetting dicapai dengan sedikit modifikasi dari

metode yang dijelaskan oleh Jondal et al (1972) SRBCs (5 ml) (Colorado Serum Co

Denver CO) diinkubasi dengan 01 ml neuraminidase (Calbiochem La Jolla CA) pada

37deg C selama 30 menit untuk menghilangkan biaya permukaan eritrosit SRBCs direndam

dalam 45 ml HBSS disentrifugasi tanpa decanting supernatan dan disimpan pada 4deg C

sampai dibutuhkan Pelet SRBC kemudian ditarik dan ditambahkan ke PBMC dalam

proporsi 01 ml SRBCs per 50 juta PBMC Sel dicampur secara menyeluruh dan

disentrifugasi selama 5 menit pada 200 3 g untuk membentuk pelet yang lembut

Campuran kemudian diinkubasi semalam pada suhu 4 deg C

Sel-sel kemudian disuspensi oleh lembut goyang agar tidak memecah T-cell-eritrosit

rosettes Setelah suspensi sel dibawa ke 40 ml dengan media RPMI 10 ml dari 1077

Histopaque perlahan-lahan berlapis di bagian bawah tabung dan sel-sel disentrifugasi

selama 30 menit pada 300 x g B-limfosit dan monosit dikumpulkan pada antarmuka

HBSS-Histopaque dan T-cell-SRBC rosettes dipanen dari pelet sel di bagian bawah

Populasi T-limfosit itu pulih dari mawar dengan melisiskan para SRBCs dengan larutan

amonium klorida dan mencuci puing-puing SRBC dengan HBSS T-sel yang ditemukan

kemudian ditangguhkan dalam medium RPMI pada konsentrasi 106 sel ml

24 B-limfosit dan monosit

Fraksi-sel B dan monosit gabungan dikumpulkan dari antarmuka HBSS- Histopaque

selanjutnya diproses oleh Supermacs tinggi gradien sistem penyortiran magnetik

(Miltenyi Biotec Auburn CA) Pemisahan medium MACS dilakukan degassed Ca21

Mg21 free phosphate buffered saline (PBS) (Life Technologies) ditambah dengan 05

bovine serum albumin (Sigma Chemical St Louis MO) dan 2 mM EDTA (Sigma

Chemical) pada pH 72 Sel pertama dicuci dua kali dalam media pemisah MACS untuk

menghilangkan sel-sel mati dan puing-puing Langkah ini ditemukan menjadi penting

untuk mencapai pemisahan yang efisien karena menghilangkan potensi tidak hanya

untuk penggumpalan sel-sel yang layak dan mati selama langkah pemisahan berikutnya

tetapi juga untuk spesifik mengikat manik-manik magnetik untuk sel-sel mati Setelah

mencuci masing-masing 107 sel dihentikan pada 80 ml media MACS pemisahan dan

diinkubasi pada 4deg C selama 15 menit dengan 20 ml manik-manik magnetik CD19-

terkonjugasi (Miltenyi Biotec) Setelah inkubasi sel-sel dicuci disuspensi dalam 1 ml

MACS menengah dan melewati 30-mm nilon mesh (Miltenyi Biotec) untuk lebih

menghilangkan agregat selular Sebuah gradien magnet jenis VS1 kolom tinggi dipasang

di magnet Supermacs dan dicuci dengan 3 ml MACS media sebelum digunakan Suspensi

sel kemudian dilewatkan melalui kolom diikuti oleh empat aliquots 3-ml media MACS

untuk membasuh sel berlabel Fraksi sel yang melewati kolom tanpa mengikat terdiri

bergantian yang umum dari monosit Fraksi B-limfosit terikat pada kolom oleh

microbeads magnetik CD19 dipanen dengan menghapus kolom dari magnet dan

kemudian disiram dengan cepat beberapa kali dengan media MACS pemisahan

25 Arus cytometry

Kemurnian fraksi sel dipisahkan diselidiki menggunakan aliran BRYTE HS

cytometer sistem (Bio-Rad MICROSCIENCE Hercules CA) Sekitar 106 sel diambil

dari masing-masing fraksi sel dicuci dua kali dengan PBS yang mengandung 2 FBS

dan 01 natrium azida (Sigma Chemical CA) dan diresuspensi dalam 50 ml larutan

yang sama Sebuah alikuot reagen 20-ml (Becton Dickinson San Jose CA) yang

mengandung isothiocyanate fluorescein (FITC) atau phycoerythrin (PE) antibodi

monoklonal terkonjugasi yang ditujukan terhadap CD3 CD20 CD14 CD15 CD45 atau

(leukosit penanda) antigen atau appropriate control isotype (IgG1 mouse tikus IgG2a)

kemudian ditambahkan ke sel dan diinkubasi selama 30 menit pada 4deg C dalam gelap Sel

dicuci lagi dengan PBS FBS penyangga dan diresuspensi dalam 1 ml 1

paraformaldehyde untuk aliran berturut-turut subcytometry analisis Untuk akuisisi data

kami menggunakan modus amplifikasi linear untuk menentukan maju-pencar (FCS) dan

sisi-pencar (SSC) parameter dan amplifikasi logaritmik untuk fluoresensi 1 (FL1 5 FITC)

dan fluoresensi 2 (FL2 5 PE) parameter

26 Pengukuran Electrorotation

Percobaan ROT dilakukan dengan menggunakan ruang yang terdiri dari preneneo O-

ring (15 x 1 mm) ditempel dengan lilin pada substrat kaca yang didukung emas

polinomial berbagai elektroda dengan jarak ujung-ujung 400 mm seperti yang dijelaskan

sebelumnya ( huang dan Pethig 1991 Huang et al 1992 Wang et al 1994) Sebuah

medan putar didirikan dengan energi empat elektroda polinomial dengan tegangan

sinusoidal sebesar 09 V (rms) dalam fase quadrature Sel dihentikan dalam 85 (b b)

sukrosa 03 (b b) penyangga dextrose konduktivitas 56 mS m sebelum rotasi Untuk

setiap percobaan ROT 200 ml suspensi sel dipipet ke O-ring dan kaca penutup yang

lembut ditekan melalui pusat untuk membentuk penuh baik disegel ruang Setelah sel

telah menetap putaran sel utuh dipilih untuk studi dan penjepit Laser (Sel Robotika

Inc Albuquerque NM) digunakan untuk tarik ke pusat ruang Pengukuran ROT

kemudian dibuat selama rentang frekuensi 1 kHz sampai 120 MHz pada empat poin per

dekade secara manual waktu tingkat rotasi sel pada setiap frekuensi dengan stopwatch

Dua penentuan terpisah terbuat dari setiap tingkat ROT Ukuran sel diukur dari gambar

sel pada monitor TV dan dikalibrasi terhadap tahap micrometer Sebuah metode optimasi

parameter kuadrat kemudian digunakan agar sesuai dengan single-shell dielectric model

dengan spektrum ROT dan menurunkan kapasitansi membran dan spesifik konduktivitas

internal dan permitivitas untuk setiap sel seperti yang dijelaskan sebelumnya (Gimsa et

al 1991a Wang et al 1994 Gascoyne et al 1995) Spektrum ROT selama lebih dari 30

sel individu masing-masing monosit subpopulasi leukosit diukur

27 Scanning electron microscopy

Foto-foto scanning electron microscopy (SEM) itu diambil dari Kenneth Dunner Jr

di Fasilitas Mikroskop Resolusi Tinggi University of Texas MD Anderson Cancer

Center T dan B-limfosit monosit dan fraksi sel granulosit disentrifugasi pada 300 g 3

selama 10 menit dalam 15 ml tabung polypropylene kerucut (Becton Dickinson Labware

Lincoln Park NJ) Setelah supernatan dibuang pelet sel yang resuspended di 875

solusi sukrosa selama 15 menit Sel-sel kemudian dicuci tetap kritis-titik kering dilapisi

dengan Au Pd dan belajar pada model Hitachi S520 mikroskop elektron seperti yang

dijelaskan sebelumnya (Wang et al 1994)

3 Hasil dan Diskusi

31 Mengetik imunologi subpopulasi leukosit

Untuk menentukan kemurnian subpopulasi leukosit yang diperoleh prosedur

pemisahan kami diilustrasikan pada Gambar 1 dan dijelaskan di atas sel diberi label

dengan baik FITC atau PE-conjugated CD15 CD3 CD20 CD14 atau dan dianalisis

dengan aliran cytometer Komposisi fraksi masing-masing sel kemudian dibandingkan

dengan yang mulai PBMC campuran Tabel 1 merangkum komposisi ditemukan populasi

sel sebelum dan setelah pemurnian Sel mononuklear dari awal Ficoll-Paque langkah

gradien mengandung rata-rata 55 T-limfosit 75 B-limfosit dan 15 monosit

Populasi leukosit dipisahkan menunjukkan kemurnian rata-rata 98 (90 -99) untuk

granulosit 90 (86 -95) untuk T-limfosit 95 (90 -99) untuk B-limfomaphocytes

dan 89 (86 -95) untuk monosit Kemurnian tinggi masing-masing populasi sel

memungkinkan kita untuk mengukur sifat dielektrik mereka dengan ROT tanpa perlu

metode identifikasi sel tambahan

Tabel 1 Persentase subpopulasi leukosit sebelum dan setelah pemurnian sebagaimana

ditentukan oleh aliran cytometer

Cell type Before After

T-Lymphocytes (CD31) 555 6 112 897 6 29

B-Lymphocytes (CD201) 72 6 20 948 6 51

Monocytes (CD141) 156 6 58 889 6 57

Granulocytes (CD151) mdash 978 6 23

32 Spektrum ROT dan sel sifat dielektrik

Spektrum ROT typical dinormalisasi terhadap kuadrat dari tegangan yang diberikan

untuk sel tersuspensi dalam sukrosa media dekstrosa isotonik konduktivitas 56 mS m

ditunjukkan pada Gambar2 Sel dipamerkan rotasi antifield pada frekuensi menjadi-

rendah 6 MHz dan di atas rotasi cofield ini terjadi Puncak antifield biasanya terjadi

pada frekuensi 200 kHz untuk monosit 300 kHz untuk granulosit dan 350 kHz untuk T

dan B-limfosit sedangkan puncak cofield terjadi pada frekuensi 40 MHz untuk semua

populasi leukosit

Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa sel parameter-parameter dielektrik

termasuk kapasitansi membran tertentu konduktivitas intern dan permitivitas intern bisa

berasal dari spektrum electrorotation lainnya dengan prosedur optimasi menggunakan

satu model dielectric shell(Wang et al 1994) Ringkasan sarana dan standar deviasi

untuk setiap parameter yang berasal dari pengukuran ROT diberikan pada Tabel 2 untuk

T dan B-limfositmonosit dan granulosit Di antara populasi sel tersebut monosit

dipamerkan terbesar kapasitansi membran berarti sedangkan T-limfosit memiliki terkecil

Dibandingkan dengan T-limfosit B-limfosit dipamerkan membran kapasitansi yang lebih

besar daya konduksi internal dan nilai-nilai permitivitas internal

Data mengungkapkan kapasitansi membran berarti dan berarti jari-jari sel untuk sub-

populasi leukosit dipelajari ditunjukkan pada Gambar 3 Ini menunjukkan bahwa

monosit dan granulocytes secara fisik lebih besar dari limfosit dan untuk alasan ini dapat

dengan mudah dibedakan secara visual Untuk monosit dan granulosit perbedaan

membran kapasitansi signifikan pada tingkat kepercayaan p lt 10-5 meskipun dua jenis sel

ini memiliki ukuran yang sama B- dan T-limfosit dipamerkan tumpang tindih terbesar di

kapasitansi dan ukuran karakteristik Meskipun ukuran mereka mirip B-limfosit memiliki

sedikit lebih besar berarti membran kapasitansi (plt10-3) dibandingkan T-limfosit Sebuah

analisis t-test untuk ukuran sel dan membran kapasitansi parameter diberikan dalam Tabel

3

Penting untuk dicatat bahwa model single-shell yang digunakan di sini untuk

menganalisis spektrum ROT adalah perkiraan sel struktural dan komposisinya rumit

Sebagai contoh setiap sel memiliki nukleus yang tidak diperhitungkan dalam model

single-shell Konsekuensi dari menggunakan model sederhana yang jelas dalam Gambar

2 di mana tampaknya ada penyimpangan sistematis antara spektrum dipasang dan

pengukuran eksperimental dalam rentang frekuensi 1-10 MHz Meskipun model tiga-

shell dapat memberikan lebih cocok (misalnya Fuhr et al 1985 Gimsa et al 1991b)

banyak parameter dari model yang lebih rumit tidak dapat ditentukan dengan andal dari

spektrum yang diukur (Gascoyne et al 1995) Model single-shell memadai

mencerminkan fitur utama dari struktur sel dan memberikan penilaian yang akurat dari

membran sifat dielektrik yang kita yang paling tertarik di sini Karena kita menggunakan

single model kulit pendekatan parameter dielektrik ditunjukkan pada Tabel 3 adalah

nilai-nilai yang berlaku efektif untuk kondisi eksperimental kami Media menangguhkan

dapat mempengaruhi parameter ini dan sel-sel dapat merespon secara berbeda dalam

media dengan konsentrasi ion yang berbeda secara signifikan

Gambar 2Khas ROT spektrum untuk darah perifer T limfosit manusia (∆) B-

limfosit () monosit () dan granulosit () dalam suspensi sukrosa isotonik

konduktivitas 56 mS m Kurva kontinyu menunjukkan cocok terbaik dari model

dielectric single-shell (- - - untuk T-limfosit untuk B-limfosit - - untuk monosit dan

mdash untuk granulocyes)

33 Morfologi permukaan sel

Dalam karya sebelumnya kami menunjukkan bahwa kapasitansi membran sel

berkorelasi dengan luas membran sel yang berhubungan dengan ciri-ciri morfologi yang

kaya membran- termasuk lipatan ruffles dan mikrovili (Wang et al 1994) Untuk

melihat apakah hubungan ini juga ada untuk leukosit morfologi permukaan mereka

diperiksa dengan mikroskop elektron Gambar 4 menunjukkan pemindaian mikrograf

elektron untuk T dan B-limfosit monosit dan granulosit masing-masing Morfologi

permukaan jenis sel darah yang berbeda dapat dilihat cukup berbeda

Digambarkan dalam Gambar 4 a dan b adalah T manusia dan phocytes B-limfoma

Ini adalah sel-sel bulat 6 -9 mm T-limfosit menunjukkan permukaan yang halus dengan

beberapa proyeksi mulai 005-02 mm Di sisi lain B-limfosit muncul didominasi vilous

menunjukkan lebih mikrovili dari T-sel Villi yang 01 mm dan jangkauan panjang 01-06

mm Observasi ini setuju dengan laporan sebelumnya yang menyebabkan penggunaan

fitur permukaan sebagai kriteria untuk membedakan antara T dan B-limfosit oleh SEM

tanpa identitas logika imun (Bentwich et al 1973 Polliack et al 1974) Namun dalam

perjanjian dengan pengamatan oleh Bentwich et al (1973) dan Polliack et al (1974)

10 dari sel-sel dalam fraksi T-sel dan sel-B kami ditemukan memiliki fitur permukaan

yang sama yang terdiri dari jumlah menengah mikrovili Sel-sel tersebut tidak dapat

diidentifikasi oleh SEM tanpa tes imunologi paralel

Tabel 2 Parameter dielektrik sel darah

Cell type Number Radius (mm) Cmem (mFm2) sint (Sm) laquoint

T-lymphocytes 91 329 6 035 105 6 31 065 6 015 1039 6 245

B-lymphocytes 49 329 6 026 126 6 35 073 6 018 1544 6 399

Monocytes 43 463 6 036 153 6 43 056 6 010 1268 6 352

Granulocytes 33 471 6 023 110 6 32 060 6 013 1509 6 393

Monosit ditunjukkan pada Gambar 4 c adalah berdiameter8 -14 mm dan

permukaannya ditutupi dengan berkembang dengan baik dan berbasis luas ruffles dan

profil ridge seperti dengan adanya umum mikrovili Kebanyakan ruffles yang 01 mm

tebal dan 05-1 mm tinggi dan memiliki panjang antara setengah mikrometer dan puluhan

mikrometer Granulosit ditunjukkan pada Gambar 4d Mereka adalah tentang ukuran

yang sama seperti monosit Membran granulosit memiliki kedua proyeksi permukaan dan

melintangridge seperti profil dan ruffles Tidak seperti pada permukaan monosit ruffles

pada granulosit adalah kali sempit dan kadang terpolarisasi ke arah salah satu ujung sel

Seperti dibuktikan dalam Gambar 4 sel-sel individu dalam satu dimurnikan jenis

leukosit dapat menunjukkan morfologi permukaan yang berbeda Perbedaan-perbedaan

ini mungkin terkait dengan perbedaan sub-populasi dalam tipe sel tunggal (misalnya

neutrofil eosinofil dan basofil dalam granulosit atau CD41 sel CD81 di T-limfosit)

Heterogeneity tercermin dalam deviasi standar yang relatif besar nilai kapasitansi

membran diturunkan untuk jenis yang leukosit berbeda-beda (Tabel 2)

Gambar 3 Maksud dan standar deviasi dari spesifik kapasitansi membran dan ukuran untuk

manusia T-limfosit (∆) B-limfosit () monosit () dan granulosit ()

T manusia dan B-limfosit monosit dan cytes granulomatosa berbeda dalam asal

penampilan dan fungsi bantuan untuk mempertahankan tubuh terhadap zat asing melalui

berbagai mekanisme termasuk fagositosis produksi enzim sitotoksik dan antibodi

(Rifkind et al 1986) T-sel yang mengatur fungsi sel-B dengan membantu atau men-

dukung menekan sintesis antibodi berpartisipasi dalam imunitas diperantarai sel dan

dapat terlibat dalam interaksi sel-sel lain sedangkan fungsi utama sel-B adalah sindroma

thesize dan mengeluarkan antibodi (Rifkind et al 1986) Ini bisa menjadi alasan

mengapa B-sel dipamerkan lebih mikrovili dari istirahat yang paling T-sel karena

mikrovili umumnya dianggap sebagai perangkat untuk meningkatkan total luas

permukaan dan dengan demikian untuk memfasilitasi transportasi metabolit (Motta et al

1977) Meskipun ada beberapa perbedaan penting fungsi utama dari granulosit terutama

terdiri dari neutrofil dan monosit adalah untuk menghilangkan partikel asing dengan

cytosis phago- (Reich et al 1993) Untuk mencapai sukses penghancuran tipe

fagositosis sel-sel harus mencapai lokasi dari zat asing mengikatnya menelan itu dan

setelah serangkaian langkah-langkah metabolisme mencerna atau menghancurkannya

(Rifkind et al 1986) Cell membrane ruffles biasanya muncul paling di permukaan sel

Mereka telah diamati untuk mengembangkan setinggi-tingginya dalam beberapa menit

dan kemudian cenderung untuk bermigrasi dari permukaan menuju sel interior dan

mengepung dan menelan quanta lingkungan cair ketika mereka bergerak (Motta et al

1977) Hal ini tidak mengherankan karena itu bahwa permukaan granuocytes dan

monosit umumnya memiliki lebih banyak ruffles

Tabel 3 T-test untuk sarana kapasitansi membran dan ukuran sel antara sub-populasi

leukosit dipasangkan

Cmem T-lymphocytes B-lymphocytes Monocytes

Membrane capacitance B-lymphocyte

37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)

Cell sizeB-lymphocytes Monocytes

01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)

Granulocytes 216 (p 10210) 236 (p 10210) 12 (p 5 02)

Seperti yang telah dibahas penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa

morfologi permukaan sel memainkan peran penting dalam sel pertambangan mencegah-

kapasitansi membran spesifik Hal ini karena kapasitansi membran tertentu tergantung

pada total permukaan membran dari sel dan daerah ini meningkat dengan meningkatnya

kekayaan dalam fitur morfologi permukaan sel (Wang et al 1994) SEM gambar

mengungkapkan bahwa sebagian besar B-limfosit memiliki fitur permukaan lebih dari T-

limfosit sesuai dengan analisis dielectric yang menunjukkan bahwa kapasitansi brane

anggota mereka juga sedikit lebih besar Monosit memiliki kepadatan terbesar lipatan dan

ruffles dari empat populasi leukosit diperiksa dan sekali lagi dalam perjanjian dengan

model daerah membran kapasitansi kapasitansi membran mereka adalah yang terbesar

dari jenis sel Satu-satunya pengecualian untuk aturan ini adalah granulosit yang struktur

permukaan lebih rumit daripada limfosit sedangkan kapasitansi membran khusus mereka

yang lebih kecil

Tiga penjelasan yang mungkin bisa menjelaskan perbedaan dalam nilai-nilai

kapasitansi membran spesifik diamati untuk jenis sel yang berbeda yaitu perbedaan di

daerah membran ketebalan atau komposisi (Wang et al 1994) Tampaknya karena itu

bahwa ketebalan membran atau komposisi granulosit dapat berkontribusi lebih banyak

untuk perbedaan kapasitansi membran mereka daripada adalah kasus untuk sub-populasi

leukosit lainnya Untuk meringkas sub-populasi leukocyte manusia memiliki fungsi-

fungsi yang berbeda imunologi yang mungkin berhubungan dengan perbedaan morfologi

leukosit Perbedaan morfologi pada gilirannya menjelaskan perilaku dielektrik

diferensial sel

33 Penyortir sel darah dielektroforesis

Dalam aplikasi biologi dan medis pemurnian subpopulasi sel dari campuran sel

kompleks sering membentuk titik awal untuk protokol penelitian dan dasar untuk

pengobatan klinis dan protokol diagnostik Dalam kasus darah manusia pemisahan

subclass fungsional sangat penting untuk pengujian imunologi (Kurnick et al 1979)

subpopulasi sel dimurnikan dengan tinggi memungkinkan studi sinyal antara sel-sel darah

(Stout 1993) yang dinyatakan tidak mungkin Saat ini diterapkan menyortir teknologi

paling sering mengeksploitasi perbedaan densitas sel (Boyum 1974) target imunologi

spesifik (Smeland et al 1992) atau interaksi ligan reseptor (Catur dan Schlossman

1976) Dibandingkan dengan metode pemisahan lainnya ini menawarkan keuntungan

besar bahwa modifikasi sel dengan noda atau antibodi atau dengan kepatuhan terhadap

bahan asing yang tidak perlu sehingga potensi kerusakan sel atau aktivasi oleh probe ini

dihindari Sebagai tambahan perangkat menyortir dielektroforesis setuju untuk

miniaturisasi dan integrasi ke dalam sistem yang lengkap diri yang terkandung

mikofluida untuk otomatis menyortir dan aplikasi analysis Penyortir sel dielektroforesis

menggunakan perbedaan kekuatan DEP untuk membedakan antara dan mendorong

pemisahan jenis sel yang berbeda (Becker et al 1994 1995 Markx et al 1994

Gascoyne et al 1996 1997 Huang et al 1997) Seperti yang ditunjukkan sebelumnya

(Wang et al 1995) pasukan DEP yang berbeda hasil dari perbedaan antara Re (FCM)

(komponen yang nyata dari FCM faktor Clausius-Mossotti) nilai dari jenis sel yang

berbedaUntuk menganalisis kekuatan dielektroforesis bertindakatas subpopulasi sel

darah kita menghitung dependensi frekuensi rata-rata Re (FCM) (Gambar 5) untuk T dan

B-limfosit monosit granulosit dan di suspending media dari 10 mS m berdasarkan

rata-rata nilai parameter dielektrik mereka berasal dari pengukuran ROT

Gambar 4 Scanning mikrograf elektron untuk leukosit manusia (A) T-limfosit (B) B-

limfosit (C) Monosit (D) Granulosit Bar panjang sesuai dengan 20 mm

Perhitungan ini menunjukkan bahwa perbedaan terbesar di Re (FCM) antara sub-

populasi leukosit yang berbeda terjadi dekat dengan frekuensi DEP cross-over mereka

(frekuensi di mana perubahan gaya arah DEP) Untuk diskriminasi maksimal pemisah

dielektroforesis karena itu sering beroperasi dekat dengan frekuensi ketika Re (FCM)

mendekati nol dan di mana kekuatan DEP yang paling sensitif terhadap sifat dielektrik

selular Frekuensi yang diprediksi DEP cross-over untuk B- dan T-limfosit monosit

granulosit dan dalam kondisi yang sama ditandai pada sumbu frekuensi Gambar 5 T dan

B-limfosit cytes granulomatosa dan monosit dipamerkan negatif ke positif kekuatan

DEP transisi pada frekuensi 60 kHz 50 kHz 40 kHz dan 30 kHz masing-masing

dalam kondisi kami Frekuensi ini cukup berbeda menunjukkan bahwa pemisahan jenis

sel leukosit yang berbeda dengan dielectrophoresis harus layak

Gambar 5 Simulasi dependensi frekuensi Re (FCM) yang berasal dari Specta ROT untuk T-

limfosit (- - -) B-limfosit () monosit (- -) dan granulosit (------) di menangguhkan suatu

media 10 mS m Diukur frekuensi cross-over DEP ditunjukkan oleh simbol

Dua pendekatan telah dibuktikan untuk pemisahan dielektroforesis yaitu retensi DEP

dan DEP-medan aliran fraksinasi (DEP- FFF) Untuk retensi DEP Gascoyne et al (1997)

berasal frekuensi pemisahan optimum dan didefinisikan faktor keterpisahan Smax yang

mencerminkan perbedaan yang diharapkan dalam DEP yang dialami oleh kedua tipe sel

yang dipisahkan Jelas faktor Smax tergantung pada ukuran sel dan sifatdielectric Tabel

4 menggambarkan penerapan analisis terhadap sub-populasi leukosit Nilai Smax terbesar

terjadi antara T-limfosit dan monosit sulting ulang dari perbedaan besar untuk jari-jari sel

dan kapasitansi brane-anggota dari dua jenis sel tersebut Di sisi lain T dan B-limfosit

memiliki nilai Smax terkecil karena perbedaan yang relatif kecil di jari-jari dan membran

mereka kapasitansi menunjukkan bahwa perpisahan mereka sejalan lebih sulit

Tabel 4 Sel faktor terpisah (Gascoyne et al 1997) Parameter skala oleh 3107


B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167

Granulocyte 148 128 80

Gascoyne et al (1997) hal-hal lainnya menunjukkan bahwa metode retensi DEP bisa

diskriminatif jenis sel inate dengan nilai-nilai Smax serendah 10 menunjukkan bahwa

pemisahan sub-populasi leukosit mungkin dengan metode ini kecuali untuk campuran T

dan B-limfosit dan monosit dan granulosit Teknik DEP-FFF telah terbukti sangat sensitif

terhadap sel sifat dielektrik ketika Re (FCM) mendekati nol (Huang et al 1997) Kami

sedang menjajaki penerapan metode ini untuk memisahkan sub-populasi leukosit

berbeda itu akan mulai berputar Analisis ini disebut electrorotation (ROT) dengan

model yang sesuai memungkinkan penentuan sifat listrik di- konstituen seluler bagi

individu utuh sel-sel yang layak (Arnold et al 1982 Fuhr et al 1990 Gimsa et al

1991a Houmllzel dan Lamprecht 1992 Huang et al 1992 Wang et al 1994) Dalam

artikel ini membran sel dan sifat dielektrik internal T dan B-limfosit monosit granulosit

dan ditandai dengan diskriminasi-sel gle sin- dalam rentang frekuensi 1 kHz sampai 120

MHz dengan pengukuran ROT dan dianalisis menggunakan shell tunggal model

dielektrik Scanning Electron Microcopy (SEM) digunakan untuk menentukan hubungan

antara leukosit sifat dielektrik diamati dan morfologi membran mereka Berdasarkan

parameter dielektrik ukuran dan karakteristik kepadatan ditemukan sel-sel ini

dsimpulkan bahwa subpopulasi leukosit harus dipisahkan oleh penyortir di-elektroforesis

2 Bahan dan Metode

21 Persiapan sel

Sampel darah periferal manusia diperoleh dari Buffy bags (Gulf Coast Regional Bank

Darah Houston TX) atau sukarelawan sehat dan normalSel dicuci dua kali dengan

larutan garam seimbang Hanks (HBSS) (Irvine Ilmiah Santa Ana CA) dan diencerkan

dengan dua sampai empat volume HBSS Granulosit T dan B-limfosit dan monosit

dipisahkan bertahap seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1

22 Granulosit

Setelah overlayering secara hati-hati empat bagian suspensi sel darah ke salah satu

bagian dari media Ficoll-Paque dengan kepadatan 1077 gml (Histopaque Sigma-

Aldrich Dorset Inggris) sel-sel disentrifugasi pada suhu kamar selama 30 menit pada

300 x g Sel mononuklear darah perifer (PBMC) dikumpulkan dari antarmuka antara

HBSS dan Histopaque gradien setelah sentrifugasi dan kemudian digunakan untuk

persiapan T dan B-limfosit dan monosit Pelet sel yang berisi eritrosit dan granulosit

kemudian dipanen Eritrosit dalam fraksi pelet segaris di amonium klorida melisiskan

solusi (826 amonium klorida 1 potassium bikarbonat 0037 EDTA tetrasodium)

dan granulocytes murni diperoleh dengan mencuci dua kali dengan HBSS untuk

menghilangkan kotoran eritrosit

23 T-limfosit

Sel dari antarmuka HBSS-Histopaque dicuci tiga kali dengan HBSS dan trombosit












































25 Arus cytometry













































3 Hasil dan Diskusi

















T-Lymphocytes (CD31) 555 6 112 897 6 29

B-Lymphocytes (CD201) 72 6 20 948 6 51

Monocytes (CD141) 156 6 58 889 6 57









populasi leukosit



















3










































T-lymphocytes 91 329 6 035 105 6 31 065 6 015 1039 6 245

B-lymphocytes 49 329 6 026 126 6 35 073 6 018 1544 6 399

Monocytes 43 463 6 036 153 6 43 056 6 010 1268 6 352

Granulocytes 33 471 6 023 110 6 32 060 6 013 1509 6 393










































37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)


01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)














yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167



















































25 Arus cytometry













































3 Hasil dan Diskusi

















T-Lymphocytes (CD31) 555 6 112 897 6 29

B-Lymphocytes (CD201) 72 6 20 948 6 51

Monocytes (CD141) 156 6 58 889 6 57









populasi leukosit



















3










































T-lymphocytes 91 329 6 035 105 6 31 065 6 015 1039 6 245

B-lymphocytes 49 329 6 026 126 6 35 073 6 018 1544 6 399

Monocytes 43 463 6 036 153 6 43 056 6 010 1268 6 352

Granulocytes 33 471 6 023 110 6 32 060 6 013 1509 6 393










































37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)


01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)














yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167































3 Hasil dan Diskusi

















T-Lymphocytes (CD31) 555 6 112 897 6 29

B-Lymphocytes (CD201) 72 6 20 948 6 51

Monocytes (CD141) 156 6 58 889 6 57









populasi leukosit



















3










































T-lymphocytes 91 329 6 035 105 6 31 065 6 015 1039 6 245

B-lymphocytes 49 329 6 026 126 6 35 073 6 018 1544 6 399

Monocytes 43 463 6 036 153 6 43 056 6 010 1268 6 352

Granulocytes 33 471 6 023 110 6 32 060 6 013 1509 6 393










































37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)


01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)














yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167


















T-Lymphocytes (CD31) 555 6 112 897 6 29

B-Lymphocytes (CD201) 72 6 20 948 6 51

Monocytes (CD141) 156 6 58 889 6 57









populasi leukosit



















3










































T-lymphocytes 91 329 6 035 105 6 31 065 6 015 1039 6 245

B-lymphocytes 49 329 6 026 126 6 35 073 6 018 1544 6 399

Monocytes 43 463 6 036 153 6 43 056 6 010 1268 6 352

Granulocytes 33 471 6 023 110 6 32 060 6 013 1509 6 393










































37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)


01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)














yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167

















3










































T-lymphocytes 91 329 6 035 105 6 31 065 6 015 1039 6 245

B-lymphocytes 49 329 6 026 126 6 35 073 6 018 1544 6 399

Monocytes 43 463 6 036 153 6 43 056 6 010 1268 6 352

Granulocytes 33 471 6 023 110 6 32 060 6 013 1509 6 393










































37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)


01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)














yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167


































T-lymphocytes 91 329 6 035 105 6 31 065 6 015 1039 6 245

B-lymphocytes 49 329 6 026 126 6 35 073 6 018 1544 6 399

Monocytes 43 463 6 036 153 6 43 056 6 010 1268 6 352

Granulocytes 33 471 6 023 110 6 32 060 6 013 1509 6 393










































37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)


01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)














yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167



































37 (p 5 3 3 1024)

Monocytes Gran

73 (p 10210)08 (p 5 05)

33 (p 5 2 3 1023)22 (p 5 3 3 1022) 49 (p 5 6

3 1026)


01 (p 5 09)204 (p 10210) 197 (p 10210)














yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167




















yang lebih kecil









diferensial sel





















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167



















































B-lymphocytes 33

Monocyte 200 167








Sifat Dielektrik Dari Subpopulasi Leukosit Manusia

Documents

Transcript of Sifat Dielektrik Dari Subpopulasi Leukosit Manusia