PendahuluanKeterbatasan asupan makanan dapat menyebabkan perubahan yang sangat parah dalam hematopoietik sumsum tulang (HBM). Perubahan tersebut meliputi hiposeluler, nekrosis dan modifikasi matriks ekstraseluler. Perubahan HBM yang dapat diamati seperti penurunan eritrosit dan leukosit dimana hal tersebut mencerminkan gangguan hematologikal. Penelitian sebelumnya menggunakan model hewan menunjukkan bahwa berat badan hewan berpengaruh secara signifikan terhadap penyembuhan kondilus mandibula yang patah. Pengaruh berat badan terhadap penyembuhannya disebabkan oleh katabolisme tubuh dimana proses ini berguna untuk proses perbaikan sel tubuh selain itu juga dipengaruhi oleh kesulitan dalam mengunyah makanan sehingga nutrisi yang masuk hanya sedikit. Sumsum tulang pada mandibular dibentuk oleh sel-sel osteoprogenitor dan sel hematopoietik, sehingga selama proses perkembangan temporomandibular joint (TMJ) pada manusia sel hematopoietik berperan penting. Pada hewan berseluler tinggi dan frekuensi jaringan lemak yang rendah, yang diamati adalah pada ruang-ruang kecil sumsum dari tulang tengkorak pada tikus dewasa.

Sumsum tulang di kondilus mandibula manusia paling sering digunakan untuk analisis oleh magnetic resonance imaging (MRI) meskipun jumlah HBM di TMJ sangat terbatas yang berguna untuk mendeteksi disfungsi TMJ seperti osteoarthritis. Ada beberapa penelitian yang menganalisis HBM pada TMJ, batasan penelitiannya adalah proses embryological terutama mengenai pembentukan TMJ. Informasi tentang regenerasi proses HBM dan pengaruh kekurangan gizi pada proses ini dapat menjelaskan beberapa aspek perubahan hematologikal selama penelitian berlangsung. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggambarkan modifikasi histologis HBM dalam TMJ dengan kondilus mandibula yang patah pada tikus yang dipelihara dan untuk membandingkan temuan ini dengan penelitian lain yang diamati pada tikus malnutrisi yang asupan proteinnya dibatasi. Tujuan peneliti adalah untuk mengamati morfologi perubahan sinyal HBM malnutrisi selama fase yang berbeda pada penyembuhan patah tulang.

Bahan dan metode.

Pemeliharaan hewan dan kelompok-kelompok eksperimental

Tiga puluh tikus laki-laki Wistar (usia 5 dan 7 bulan, rata-rata berat 200 g), dikarantina 15 hari sebelum penelitian. Sampel dibagi secara acak menjadi dua kelompok. Kelompok pertama (a) kelompok yang tidak mengalami malnutrisi dan kelompok kedua (b) kelompok yang mengalami malnutrisi (diet rendah protein). Hewan-hewan tersebut diletakkan pada kandang yang berbeda untuk masing-masing hewan yang diberi air minum dan makanan yang rendah protein (yang masih sesuai standar). Air minum dan makanan diukur secara mingguan. Kondisi lingkungan bersuhu 20-22oC, kelembaban relatif 505%, siklus 12 jam cahaya/hari

Diet Rendah Protein dan Pemantauan Gizi Buruk

Hewan-hewan kelompok diet di dietkan dengan mengurangi asupan protein dan meningkatkan asupan karbohidrat, sedangkan asupan viamin dan mineral tetap. Hewan-hewan menerima diet selama 30 hari sebelum fraktur mandibula. Malnutrisi ditunjukkan dengan adanya menurunnya berat badan hewan uji serta ditunjukkan dengan tes protein dan serum albumin. Dalam hal ini, darah dikumpulkan untuk selanjutnya diperiksa protein darahnya.

Fraktur Kondilus Mandibula

Semua hewan dibius dengan injeksi intraperitoneal ketamin dan xilazine. Tujuannya adalah sebagai akses bedah kondilus mandibula kanan. Pada proses ini mandibula kondilus dietakkan dengan mosquito- (Halsted) forsep. Lalu dijahit pada akhir operasi menggunakan nilon.

Euthanasia dan Pengolahan Jaringan

Sebanyak 3 hewan per kelompok eksperimen dimatikan (euthanasia) pada jam ke 24, dan hari ke 7, 15, 30, dan 90. Setelah itu kepala diputus dan diberi formalin selama 24 jam. Selanjutnya diambil bagian hemiheads sebelah kiri pada TMJ nonfraktur, lalu dicuci dengan air dan direndam dalam EDTA 10%, ph 7.4 suhu 8o C selama 2 bulan untuk deklasifikasi. Sealnjutnya diperiksa histologinya, yaaitu dengan pemberian hematoxylin eosin (HE) dan dengan noda lain untuk visualisasi sel darah dan serat retikuler.

Analisis Histologis

Dalam analisis histologis, diamati daerah artikular pada kondilus mandibular dan tulang temporal, serta sumsum tulang dibawah mikroskop cahaya. hematopoietic bone marrow (HBM) pada daerah subkondral kondilus mandibula dan daerah superior fibrikartilago di tulang temporal dianalisis oleh dua patolog tanpa mengidentifikasi periode eksperimental. Para ahli patologi menggambarkan konstituen dari matriks ekstraselular dalam ruang sumsum, dan tingkat selularitas berdasarkan morfologi dan sifat histokimia. Sebuah analisis semikuantitatif dilakukan untuk parameter ini. TMJs tiga hewan bergizi baik tanpa fraktur dan pada usia yang sama sebagai kontrol yang selanjutnya dilakukan langkah-langkah metodologi yang sama.

Pengukuran Seluler Nuclei

Inti sel dikuantifikasi untuk memperoleh data obyektif tentang cellularity dari HBM. Inti dihitung oleh salah satu patolog tanpa mengidentifikasi eksperimental kelompok. Software morfometri dan sistem digital yang digunakan untuk mendigitalkan gambar histologis, dan pemeriksa elektronik menandai semua inti yang terlihat disajikan dalam ruang sumsum tulang. Semua jarak HBM pada kondilus mandibula diidentifikasi di HE-bernoda bagian histologis yang diukur pada 400X pembesaran. Karena jumlah ruang HBM berbeda antara kelompok, jumlah mikroskopis bidang adalah variabel. 15 hari pasca-fraktur kelompok eksperimen tidak dihitung karena tidak adanya HBM (lihat Hasil). Data diserahkan untuk uji statistik. Selain membandingkan kelompok uji, data 24h dan 90 hari percobaan periode juga dibandingkan dengan nilai kontrol.

Analisis Statistik

Analisis statistik dilakukan dengan SPSS (Statistik Paket Ilmu Sosial) software untuk jumlah inti sel. Mann-Whitney test digunakan untuk memverifikasi statistik perbedaan antar kelompok. Friedman test digunakan untuk statistik analisis antara periode eksperimental, Perbedaan dianggap signifikan secara statistik ketika nilai P adalah kurang dari 0,05.

HasilBerat badan dan tes biokimia

Nilai-nilai berat badan, serum total protein, dan albumin serum MG menunjukkan pengurangan besar dalam kenaikan berat badan, serum total protein,dan albumin serum dalam berkaitan dengan FG. Menganalisis setiap periode percobaan, pengurangan terbesar dalam nilai-nilai ini adalah untuk MG pada 15 hari setelah fraktur. Selain itu, pada 7 dan 15 hari tambahan berat badan negatif dalam kelompok ini. FG tidak menunjukkan nilai negatif untuk pertambahan bobot badan. MG menunjukkan tingkat yang lebih rendah dari serum total protein dan albumin serum dari FG dari pertama sampai terakhir periode eksperimental (data setiap periode eksperimental tidak ditunjukkan). Analisis histologis Tabel 2 dan Tabel 3 mengandung tingkat celullarity, jenis populasi sel, matriks ekstraselular, dan luas ruang sumsum tulang untuk masing-masing kelompok dan eksperimental periode, masing-masing untuk kondilus mandibula dan tulang temporal.

KONTROL TMJ

Permukaan articular di dalam kondilus mandibular dijadikan kontrol TMJ yang memiliki karakteristik tulang rawan articular, dengan lapisan atas yang terdiri dari jaringan ikat berserat dan lapisan selanjutnya merupakan sel-sel yang dapat berdiferensiasi dan dapat dibedakan menjadi chondrocytes hipertrofik.

Daerah subchondral terbentuk dari tulang kompak dengan rongga sumsum. HBM mengandung erythroid yang berasal dari sel myeloid . Sinusoid merupakan sel yang memiliki jumlah eritrosit yang banyak. Erythroblasts, metamyelocytes, dan granulosit matang merupakan sel yang tersebar diseluruh sumsum tanpa terjadi pembentukan cluster.

Tidak terdapat adiposity atau jaringan lemak. Serat retikuler dan beberapa sel mesenchymal yang menyerupai sel-sel tulang dalam matriks ekstraseluler. Baris osteoblast Nampak jelas berada di wiliyah peritrabecular, serta osteoklas yang berada di sum-sum dekat dengan wilayah hipertrofi.

Dalam tulang temporal, terdapat permukaan articular yang dibentuk oleh jaringan ikat fibrosa yang lebih luas di fossa glenoid. Dalam tulang temporal HBM dapat diamati ruang sumsum besar dengan cellularity tinggi. Dalam hal ini dapat membedakan megacaryocytes yang tersebar diseluruh ruang, serta sel-sel erythroid yang membentuk cluster di sumsum perifer.

Granulosit matang, terutama eosinophil dan neutrophil, terlihat di ruang perivascular. Sel-sel lemak terisolasi menyerupai adiposit juga dapat diamati. Jaringan serat retikuler yang diamati juga terlihat lebih jelas, membentuk microscapes yang terisi sel. Pada tulang kondilus mandibula garis osteoblast tidak terlihat.

Gambar 1 24 JAM

Temuan histologis yang serupa di FG dan MG, pada condylar fraktur jelas terdapat dalam bagian histologi. Permukaan articular di kondilus mandibular dan dalam tulang temporal yang diawetkan. Pada ruang HBM terlihat jelas bagian yang retak di kondilus dan pada tulang temporal. Erythroblast dan myeoblast terlihat dalam kondilus mandibular dari FG.Matriks ekstraseluler menggambarkan degenerasi basofil dengan beberapa tanda-tanda reticular jaringan serat. Tidak terdapat tanda-tanda terjadinya kematian pigmen hemosiderin. Cellularity dari MG secara signfikan lebih rendah bila dibandingkan dengan orang dari FG dan kontrol.Keterangan : FG : menunjukkan jaringan padat dengan serat retikuler, myeoblast dengan degenerasi yang dekat dengan sinusoid. Selain itu juga menunjukkan cellularity eritoblast dan myeloblast, dengan sel mast berlimpah dan ruang sinusoid yang besar dengan eritrosit.

MG : cellularity rendah, dan osteoblast yang terputus-putus.

7 hariPada kondilus mandibula, HBM terdapat pada kalus, menunjukkan cellularity tinggi pada ruang sumsum baik di FG dan MG (Tabel 2 dan Tabel 4). Erythroblasts, myeloblast, granulosit matur, dan megacariocytes diamati terletak dekat dengan sinusoid, terutama pada FG (Gambar 1D). Sel mast tersebar di seluruh sumsum (Gambar 1F). Garis ganda osteoblas dan beberapa osteoklas juga terlihat. Tidak ada tanda-tanda nekrosis dalam matriks ekstraselular, yang dibentuk oleh jaringan serat reticular (Gambar 1E). Dalam tulang pre-mandibular dan proses condylar, HBM menunjukkan aspek morfologi mirip dengan sebelumnya, dengan degenerasi dan nekrosis. Kecenderungan ini terutama terlihat di MG. Dalam HBM tulang temporal, ada degenerasi basophilic dengan hiposelularitas pada kedua kelompok (Tabel 3), mirip dengan yang diamati pada periode 24 jam. Matriks ekstraseluler dari HBM diubah,bdengan tidak adanya atau disorganisasi dari jaringan serat reticular (Gambar 2D).

15 hari

Kalus tulang lebih besar dan persatuan fragmen tulang hampir terbentuk di FG. Pembentukan tulang pada MG tertunda. Osteoklas dalam jumlah tinggi muncul di daerah peritrabecular tulang baru, yang menunjukkan banyak pembuluh darah ruang diisi dengan eritrosit. Pada kedua kelompok, sumsum dalam proses condylar terdiri terutama dari jaringan fibrosa dan tulang sel, terutama osteoblas. Erythroblasts yang kadang-kadang terlihat di beberapa ruang tanpa adanya kharasteristik jaringan haematopoietic (Tabel 2). Pada tulang temporal karakteristik degenerasi diamatis sebelumnya (Tabel 3). 30 hariKalus tulang banyak terlihat di condylar dan gabungan tersebut di FG. Cakram artikular tebal dan diposisikan di wilayah artikular, tapi tidak diamati di MG. Dalam kelompok ini, kalus terbentuk tetapi kondilus tidak menunjukkan reposisi di fossa artikular, dan cakram artikular yang terkilir tidak ada. HBM condylar FG menunjukkan peningkatan diskrit di cellularity (Tabel 4) yakni erythroblasts, metamyelobasts, dan granulosit mature terutama eosinofil (Gambar 1G dan tabel 2). Plasma sel serta megacaryocytes juga diamati. Sel mirip dengan makrofag juga nampak pada periode 7 hari juga terlihat pada fase ini (Gambar 1G). Jaringan serat retikuler ditemukan pada (Gambar 1H). Ada perbedaan statistik antara cellularity FG dan MG (Tabel 4). Sementara tulang pada kedua kelompok tidak menunjukkan modifikasi di permukaan artikular. HBM dalam hal ini tulang mirip dengan yang pada periode sebelumnya, dengan degenerasi intens dan beberapa tanda-tanda regenerasi matriks ekstraseluler baik dalam FG dan MG (Angka 2E, 2F, dan tabel 2).

90 hari

Dalam FG, kepala kondilus diposisikan di fossa glenoid dengan disc artikular di sela wilayah ini. Bone callus berada di fase remodeling. Di MG, disk artikular dan Permukaan artikular dari kondilus tidak terlihat. HBM di kondilus mandibula dari FG terdiri dari erythroblasts, granulosit matang, dan sel mast (Gambar 1J) didistribusikan dalam sumsum besar (Gambar 1K). Makrofag tersebar minim pada matriks. Ruang sinusoid besar dengan eritrosit juga diamati. Tidak ada statistik perbedaan yang signifikan antara kelompok sebagai salam cellularity (Tabel 4). HBM tulang temporal FG menunjukkan tinggi cellularity (Gambar 2G dan Tabel 3). Dalam kelompok ini, beberapa makrofag dan sel mast terlihat (Gambar 2G). Secara umum, HBM dari FG dalam hal ini memiliki aspek normal yang menyerupai control. Di sisi lain, tulang temporal MG menunjukkan HBM dengan matriks basophilic amorf (Gambar 2I), dengan ruang yang mirip dengan lemak kecil (Gambar 2H). Sel hematologi memiliki aspek degeneratif tetapi eritrosit terlihat pada ruang sinusoid.

Diskusi

Penelitian ini difokuskan pada proses regenerasi HBM di kondilus mandibula yang retak dan tulang temporal yang baik (kelompok FG) dan tikus kekurangan gizi (MG group). Kesamaan penting dan perbedaan yang diamati antara kedua kelompok, terutama pada tahap selanjutnya dari perbaikan tulang, serta seperti antara kondilus mandibula dan tulang temporal. Kemiripan yang diamati antara kelompok dalam tahap awal perbaikan fraktur. Baik di kondilus mandibula dan tulang temporal, degenerasi dan hiposelularitas diamati pada 24 jam. Dalam kondilus mandibula degenerasi ini bisa dikaitkan dengan iskemia pada tulang retak. Pengaruh malnutrisi di haematopoietic yang jaringan MG tidak terlihat dalam percobaan . Di sisi lain, di rahang bawah kondilus, hypercellularity terlihat waktu dalam 7 hari pada kedua kelompok, mungkin dikarenakan inflamasi yang intens. Selanjutnya pada hari ke 15, HBM telah digantikan oleh jaringan fibrosa atau nonhematopoeitic baik kondilus mandibula dan tulang temporal. Namun, perbedaan penting terjadi pada 30 dan 90 hari setelah fraktur. FG menunjukkan pemulihan seluleritas di kondilus mandibula, dengan rasio M:E yang normal terutama pada tulang baru yang terbentuk. Recovery ini tidak diamati pada MG, yang menunjukkan tingginya degenerasi basophilic dalam matriks ekstraselular dan hiposelularitas. Dalam kelompok ini, HBM yang tidak digantikan oleh jaringan fibrosa dan dilakukan pengamatan pada kosongnya ruang sumsum tulang. Temuan ini dapat dikaitkan dengan gizi buruk pada HBM, sebagaimana penurunan tulang dalam analisis histopatologi. Dalam literatur, studi eksperimental telah menunjukkan pengaruh yang kuat dari gizi buruk pada tulang paha dan tulang dada HBM, seperti berkurang jumlah sel darah, diferensiasi sel gangguan myeloid, perubahan komponen matriks ekstraselular, dan eritropoiesis yang tidak efektif. Dalam penelitian ini, hewan dewasa yang digunakan memiliki ruang HBM yang signifikan berkurang dibandingkan dengan hewan muda pada tulang panjang dan dalam tengkorak. Binatang dalam penelitian ini menunjukkan bahwa kondilus mandibula dan penyembuhan HBM tidak dipengaruhi oleh usia. Selain itu terdapat interaksi antara tulang mandibula kondilus dan jaringan hematopoietik dengan embriologi dalam pembentukan HBM. Selain itu, osteogenesis dan hematopoiesis sangat berkaitan.Regenerasi HBM diamati pada kondilus mandibula tapi tidak diamati pada tulang temporal. HBM dalam tulang ini menunjukkan degenerasi pada 24 jam setelah fraktur, dan sampai 30 hari pada FG dan MG. Dalam FG, 90 hari HBM menunjukkan pemulihan seluleritas, terutama pada erythroblasts dan myeloblast. Pada MG, degenerasi HBM basophilic tulang temporal bertahan selama periode percobaan. Pada hari ke 90, hewan dari kelompok ini menunjukkan karakteristik morfologi yang sama pada tulang tengkoraknya, hal ini merupakan efek dari gizi buruk kronis ,tidak adanya fungsi artikular karena fraktur, gangguan gerakan artikular TMJ, dan pembentukan tulang tanpa stimulus.Penyelidikan lebih lanjut perlu dilakukan untuk menjelaskan histologis tulang temporal. Regenerasi HBM telah dipelajari dalam sumsum tulang pasien transplantasi. Beberapa langkah dari proses ini meliputi proliferasi sel endotel, invasi sel progenitor dan batang sel, diferensiasi erythroid sekitar sel-sel lemak yang dipulihkan, pemulihan megakaryopoiesis, pembentukan jaringan retikuler, dan diferensiasi myeloid terutama eosinofil dan neutrofil. Dalam penelitian ini dilakukan langkah dominasi diferensiasi erythroid untuk menjaga ratio M: E. Namun, diferensiasi megakaryocyte tidak terjadi pada MG. Efek malnutrisi dilihat pengaruhnya dalam anatomi HBM kondilus mandibula dan tulang temporal. Termasuk juga tidak adanya sel-sel lemak, tingginya jumlah makrofag dan sel mast pada TMJ, rendahnya jumlah megaryocytes di kondilus mandibula, dan tidak adanya jaringan reticular, terjadi pada kondilus mandibula dan tulang temporal.Kesimpulannya, malnutrisi berpengaruh kuat pada regenerasi HBM pada fraktur kondilus mandibula. Usia tidak mempengaruhi kapasitas regenerasi HBM pada kondilus mandibula namun perlu pertahanan gizi. Diperlukan penyelidikan lebih lanjut mengenai perbedaan morfologi dan regenerasi HBM antara kondilus mandibula dan tulang temporal.Gambar A : kontrol

Gambar B dan C : 24 jam setelah fraktur

Gambar D sampai F : hari ke-7

Gambar G sampai I : hari ke-30

Gambar J sampai L : hari ke-90

Gambar 2

4