RESPON PROLIFERASI LIMFOSIT PADA ORGAN LIMPA DAN … fileimmunomodulator belum digali. Penelitian...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

i

RESPON PROLIFERASI LIMFOSIT PADA ORGAN LIMPA DAN TIMUS MENCIT BALB/C YANG TERINFEKSI BAKTERI

Salmonella thypi PADA PEMBERIAN EKSTRAK MENIRAN MERAH (Phyllanthus urinaria)

TESIS

Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan

guna memperoleh gelar Magister Sains

Program Studi Biosains

Oleh

Ifandari NIM: S900809008

PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA 2011


commit to user

ii


commit to user

iii


commit to user

iv

PERNYATAAN ORININALITAS DAN PUBLIKASI TESIS

Saya menyatakan dengan sebenar – benarnya bahwa:

1. Tesis yang berjudul:“Respon Proliferasi Limfosit pada Organ Limpa dan Timus Mencit Balb/C yang Terinfeksi Bakteri Salmonella thypi pada Pemberian Ekstrak Meniran Merah (Phyllantus urinaria )“ ini adalah karya penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis dikutip dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah tesis ini dapat dibuktikan unsur – unsur jiplakan, maka saya bersedia Tesis beserta gelar MAGISTER saya dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang – undangan yang berlaku (UU No.20 Tahun 2003, Pasal 25 ayat 2 dan pasal 70).

2. Tesis ini merupakan hak milik Prodi Biosains PPs-UNS. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi Tesis pada Jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin Ketua Prodi Biosains PPs-UNS dan minimal satu kali publikasi menyertakan tim pembimbing sebagai Author. Apabila sekurang – kurangnya satu semester (6 bulan sejak pengesahan Tesis) saya tidak melakukan publikasi dari sebagian atau keseluruhan isi Tesis ini, maka Prodi Biosains PPs-UNS berhak mempubilkasikanya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosains PPs-UNS dan atau media yang ditunjuk. Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini, maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.

Surakarta, 23Agustus 2011 Mahasiswa

Ifandari S900809008


commit to user

v

RESPON PROLIFERASI LIMFOSIT PADA ORGAN LIMPA DAN TIMUS MENCIT BALB/C YANG TERINFEKSI BAKTERI

Salmonella thypi PADA PEMBERIAN EKSTRAK MENIRAN MERAH (Phyllanthus urinaria)

Ifandari, Suranto dan Y Nining Sri Wuryaningsih

Program Studi Magister Biosains, PPS-UNS Surakarta

Abstrak

Meniran merah merupakan salah satu anggota dalam genus Phyllanthus. Anggota dalam genus ini memiliki variasi karakter morfologi dimana beberapa diantaranya telah digunakan sebagai tanaman obat tradisional. Meniran merah digunakan dalam penelitian sebagai diuretik dan hipoglikemik. Akan tetapi kemanfaatan tanaman ini sebagaii immunomodulator belum digali. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui proliferasi limfosit pada organ Limpa dan Timus Mencit Balb/C yang diinfeksi bakteri Salmonella thypi akibat pemberian ekstrak meniran merah dan mengetahui pengaruh variasi dosis ekstrak meniran merah terhadap respon proliferasi limfosit.

Penelitian ini menggunakan rancangan the post test-only control group terhadap 48 ekor mencit Balb/C yang terbagi dalam 8 kelompok dan dilakukan selama 10 hari. Kelompok kontrol negatif, kontrol positif, kelompok perlakuan dengan variasi dosis masing-masing 3x 0,065 mg/hr, 3x 0,130 mg/hr dan 3x 0,260 mg/hr untuk tiap jenis ekstrak meniran merah dan hijau. Mencit diinfeksi pada hari ke-4 S. typhi dan hari ke-11 dikorbankan. Limfosit diisolasi dari organ limpa dan timus, kemudian dihitung jumlahnya dan viabilitas dalam berproliferasi dengan metode MTT assay. Data dianalisis dengan T test untuk melihat perbedaanya dan kurva estimasi untuk korelasinya.

Pemberian ekstrak meniran merah mampu menguatkan respon proliferasi limfosit ke arah lebih baik dengan meningkatkan proliferasi limfosit pada organ Limpa dan pada organ Timus menekan. Variasi penambahan dosis ekstrak meniran merah cenderung menguatkan respon proliferasi limfosit. Waktu inkubasi 48 jam merupakan waktu terbaik untuk pengamatan proliferasi limfosit. Kata kunci: Phyllanthus urinaria, Respon, Proliferasi, Limfosit,.


commit to user

vi

LYMPHOCYTE PROLIFERATION RESPONS ON SPLEEN AND THYMUS ORGANS OF MICE BALB/C INFECTED WITH Salmonella thypi

in Phyllanthus urinaria EXTRACT TREATMENTS

Ifandari, Suranto and Y Nining Sri Wuryaningsih Program Study of Biosains, Post Graduate Program

Sebelas Maret University of Surakarta

Abstract

Phyllanthus urinaria is one of the species in the genus of Phyllanthus, which has

variety of the morphologycal characters and ussually used as herb medicines traditionally. Now days, this plant has been intensivelly treated for laboratory experiment especially for diuretic and hipoglicemic. The aims of this study were to investigated the lymphocyte proliferation in spleen and thymus organs of mice Balb/C infected after treated by Salmonella thypi with P urinaria extract treatments. Beside the above, and studies effect dosage variety of P,urinaria extracts to the lymphocyte proliferation respons was also conducted.

The study designed with post test only control group to 48 Balb/C mice. The groups of experiment was 8 groups consist of control negative, control positive, groups of treatment with variety dosage 3x0,065 mg/day, 3x0,130 mg/day and 3x0,260 mg/day for P.urinaria and P.niruri. The experiment was doing 10 days with orally treatments, and Salmonella infection injected in mice at 4th. At day 11th day mice were killed and isolated the lymphocyte from spleen and Thymus. Lymphocyte were counted and cultured. The culture cell tested proliferation capability with MTT assay method.

The results showed, P.urinaria treatments has resulted increased lymphocyte proliferation on spleen but descreassion on the thymus organ therefore lymphocyte proliferation respons strongher on mice Balb/C. The best time for counting the proliferation lymphocyte cell as 48 hour.

Key Words: Phyllanthus urinaria, Response, Proliferation, Lymphocyte,


commit to user

vii

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ilmiyah ini dipersembahkan kepada

Almamater tercinta sebagai wujud peran sertaku dalam Ilmu Pengetahuan

Ayah Bundaku tercinta

Anak dan suamiku tercinta


commit to user

viii

KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur kehadirat Alloh SWT, atas limpahan rahmad

dan hidayah-Mu penulis dapat menyajikan tulisan tesis yang berjudul ”Respon

Proliferasi Limfosit pada organ Limpa dan Timus Mencit Balb/C yang terinfeksi Bakteri

Salmonella thypi pada Pemberian Meniran Merah (Phyllantus urinaria)“.

Dalam tulisan ini, disajikan pokok pokok bahasan yang meliputi efek dari

perlakuan ekstrak Meniran Merah secara in vivo dengan jumlah limfosit dari organ

limpa dan Timus, viabilitas sel untuk berproliferasi akibat perlakuan meniran merah

diperbandingkan dengan perlakuan meniran hijau dan keberhasilan kultur sel dengan

variasi lama waktu inkubasi.

Nilai penting dari penelitian ini adalah menggali potensi meniran merah dalam

pemanfaatanya sebagai immunomodulator dengan membandingkanya dengan efek

imunomodulator pada pemberian meniran hijau. Dari penelitian ini ditemukan adanya

perbedaan respon proliferasi limfosit dari kedua jenis meniran sehingga dapat

memberikan masukan kepada peneliti bagaimana potensi dari meniran merah yang

perlu digali. Adapun kendala yang ada dalam penelitian ini adalah faktor fasilitas

penunjang seperti ketersediaan hewan coba dan fasilitas laboratorium hewan yang

masih kurang sehingga waktu penelitian harus mundur sehingga nantinya dapat

diperbaiki dengan pengaturan waktu yang sesuai.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dan keterbatasan dalam

penelitian maupun penulisan, walaupun telah diupayakan dengan sekuat tenaga untuk

dapat memberikan kesempurnaan. Oleh karena itu penulis berharap segala saran

yang bersifat membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi yang membutuhkan.


commit to user

ix

UCAPAN TERIMAKASIH

Ucapan terima kasih setulusnya kami sampaikan kepada:

1. Rektor Universitas Sebelas Maret Prof.Dr. Ravik Karsidi,M.S yang berkenan

menerima penulis sebagai Mahasiswa S2

2. Direktur Program Pasca sarjana Prof. Drs. Suranto,M.Sc.Ph.D atas fasilitas dan

ijinya dalam menepuh semua proses pembelajaran S2

3. Ketua Program Studi Biosain Dr. Sugiyarto, M.Si. atas segala fasilitas dan

arahanya dalam proses penelitian maupun pembelajaran

4. Prof. Drs. Suranto,M.Sc.Ph.D dan Dr. Y Nining Sri Wuryaningsih dr.Sp PK

selaku pembimbing atas segala curahan pemikiran dalam membimbing

Penelitian dan penulisan Tesis.

5. Dr.Edwi Mahajoeno atas bantuan informasi dan saran dalam penelitian dan

penulisan Tesis

6. Laboratorium LPPT UGM atas ijin penggunaan laboratorium sebagai tempat

penelitiam

7. Laboratorium Hewan Coba PAU Bioteknologi UGM atas bantuanya sebagaii

tempat pemeliharaan hewan.

8. Laboratorium Pusat sub lab Kimia atas ijin sebagai tempat penelitian

9. Seluruh teknisi LPPT UGM atas bimbingan teknis pelaksanaan penelitian

10. Tim penelitian Bapak Amar Ibhn Lash dan Bapak Pariyanto atas kerjasamanya

dalam penelitian

11. Teman – teman prodi Biosain angkatan 2009 atas semangat dan segala

bantuan dalam pelaksanaan penelitian ini

12. Dr. R.C Hidayat Soesilohadi, M.S yang telah memberikan bimbingan analisis

statistik.

13. Ibu Daning Nuriliani M.Kes atas diskusi keilmuan dan teknis penelitian

14. Dan semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu atas segala

bantuan dalam penelitian ini.


commit to user

x

DAFTAR ISI

Hal HALAMAN JUDUL.............................. ............................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING TESIS................................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI TESIS........................................................ iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS........................................................... iv

HALAMAN ABSTRAK............................................................................................ v

HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................................. vii

HALAMAN KATA PENGANTAR............................................................................ viii

HALAMAN UCAPAN TERIMAKASIH................................................................... ix

DAFTAR ISI........................................... ............................................................... x

DAFTAR TABEL................................... ............................................................... xi

DAFTAR GAMBAR............................... ............................................................... xii

DAFTAR SINGKATAN......................... ............................................................... xiii

Bab I Pendahuluan

a. Latarbelakang................... ..... .............................................................. 1

b. Rumusan masalah.................. ................................................................ 4

c. Tujuan penelitian..................... ................................................................ 4

d. Manfaat penelitian.................. ................................................................ 4

Bab II Tinjauan Pustaka dan Kerangka Konsep Penelitian

A. Tinjauan Pustaka

1. Meniran.................... ........ ................................................................ 5

2. Salmonella thypi............... ................................................................ 10

3. Demam Tifoid.................. ................................................................ 11

4. Sistem pertahanan tubuh.. ............................................................... 13

5. Immunomodulator............ ............................................................... 16

B. Kerangka penelitian................ ............................................................... 17

C. Hipotesa ................................. ............................................................... 17

Bab III Metodologi Penelitian

A. Waktu dan tempat penelitian.... ................................................................ 18

B. Rancangan penelitian.............. ................................................................ 18

C. Alat dan bahan penelitian........ ............................................................... 20

D. Prosedur penelitian................. ................................................................ 20


commit to user

xi

E. Analisis data ........................... ................................................................ 26

Bab IV Hasil dan Pembahasan

A. Hasil........................................................................................................... 27

B. Pembahasan........................... ................................................................ 48

Bab V Kesimpulan dan Saran

A. Kesimpulan............................ ................................................................ 61

B. Saran..................................... ............................................................... 61

DAFTAR PUSTAKA............................ ................................................................ 62

LAMPIRAN........................................ ................................................................ 67


commit to user

xii

DAFTAR TABEL

Hal

Tabel 1. Jumlah sel Limfosit mencit hasil isolasi organ Limpa……………………. 27

Tabel 2. Jumlah sel Limfosit mencit hasil isolasi organ Timus…………………….

31

Tabel 3. Nilai Kerapatan Optik Kultur Limfosit mencit hasil isolasi organ Limpa

36

Tabel 4. Nilai Kerapatan Optik Kultur Limfosit mencit hasil isolasi organ Timus 39

Tabel 5. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Meniran Hijau dan Merah…. 43

Tabel 6. Nilai Rf yang ada pada senyawa aktif pada Meniran Hijau dan Merah 44


commit to user

xiii

DAFTAR GAMBAR

Hal Gambar 1. Meniran Hijau (Phyllanthus niruri )………...................... ………….... 6

Gambar 2. Meniran Merah (Phyllanthus urinaria)……………………. ……………. 7

Gambar 3. Kerangka Penelitian……………………………………….. ……………… 17

Gambar 4. Alur penelitian………………………………………………………………. 19

Gambar 5. Jumlah sel limfosit hasil isolasi dari organ limpa dan simpangan bakunya…………………………………………………………………

28

Gambar 6. Pola Kecenderungan antara kenaikan dosis ekstrak Meniran Hijau P. niruri dengan jumlah Sel Limfosit pada organ Limpa……………

29

Gambar 7. Pola kecenderungan antara kenaikan dosis ekstrak Meniran Merah P. urinaria dengan jumlah Sel Limfosit pada organ Limpa…………..

29

Gambar 8. Jumlah sel hasil isolasi dari organ Timus dan simpangan bakunya……………………………………………………………………

32

Gambar 9. Pola kecenderungan jumlah limfosit Timus mencit terhadap dosis ekstrak meniran hijau P.niruri yang diberikan…………………………

33

Gambar 10. Pola kecenderungan jumlah limfosit Timus mencit terhadap dosis ekstrak meniran merah P.urinaria yang diberikan…………………….

33

Gambar 11. Limfosit dari limpa berproliferasi……………………………………….. 35

Gambar 12. Limfosit dari Timus berproliferasi……………………………………… 35

Gambar 13.Nilai Kerapatan Optik Kultur Limfosit hasil isolasi dari organ Limpa

38

Gambar 14.Nilai Kerapatan Optik Kultur Limfosit hasil isolasi dari organ Timus… 40

Gambar 15. Pemisahan senyawa aktif pada lempeng silica gel metode Kromatografi lapis Tipis…………………………………………………...

42

Gambar 16. Kultur limfosit dari Limpa pada inkubasi 24 jam………………………

45

Gambar 17. Kultur limfosit dari Timus pada Inkubasi 24 jam………………………

45

Gambar 18. Kultur limfosit dari Limpa pada inkubasi 48 jam……………………… 46

Gambar 19. Kultur limfosit dari Timus pada Inkubasi 48 jam…………………….

46

Gambar 20. Kultur limfosit dari Limpa pada inkubasi 72 jam………………………

47

Gambar 21. Kultur Limfosit dari Timus yang diinkubasi selama 72jam…………..

47


commit to user

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Hal Lampiran 1. Hitung Jumlah sel limfosit dari organ limpa……………………………. 65

Lampiran 2. Analisa T Test Sel Limfosit Hasil Isolasi dari Limpa………………….. 66

Lampiran 3. Hitung Jumlah sel limfosit dari organ Timus…………………………… 67

Lampiran 4. Analisa T Test Sel Limfosit Hasil Isolasi dari Timus………………….. 69

Lampiran 5. Analisa nilai kerapatan optic limfosit dari organ limpa……………….. 70

Lampiran 6 Tabel Nilai Signifikasi Hasil Uji T Test Nilai Kerapatan Optik Kultur limfosit Hasil Isolasi Organ Limpa Dengan waktu inkubasi 24 jam…………………..

71


72


72

Lampiran 9 Estimasi Kurva Pola Kecenderungan Besarnya Kerapatan Optik Dengan Besarnya Dosis Pada Waktu Inkubasi 48 Iam…………………….

73

Lampiran 10 Hasil Kerapatan Optik Kultur Limfosit dari Organ Timus,…………………… 76

Lampiran 11 Tabel Nilai Signifikasi Hasil Uji T Test Nilai Kerapatan Optik Kultur limfosit Hasil Isolasi Organ timus Dengan waktu inkubasi 24 jam………………….

77


78


78

Lampiran 14 Estimasi Kurva Pola Kecenderungan Besarnya Kerapatan Optik Dengan Besarnya Dosis Pada Waktu Inkubasi 48 Iam…………………..

79

Lampiran 15 Keterangan Kelaikan Etik……………………………………………….. 82

Lampiran 16 Surat Ijin penelitian……………………………………………………… 83

Lampiran 17 Biodata Mahasiswa……………………………………………………… 85


commit to user

xv

DAFTAR SINGKATAN

CFU : colony forming unit

DC : Dendritik cel

FBS Fetal Bovine serum

HIV : Human immunodeficiency virus

IFNγ : Interferon gamma

KLT Kromatografi lapis tipis

LPPT Laboratorium penelitian dan pengijian terpadu

M.H : Meniran Hijau

M.M : meniran Merah

SB : Simpangan Baku


commit to user

1

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar belakang Penelitian

Indonesia sebagai pemilik kekayaan plasma nutfah yang besar,

menyimpan keberagaman jenis tanaman obat. Tanaman obat merupakan

salah satu unsur penting dalam penanganan kesehatan. Jenis – jenis

tanaman obat telah digunakan oleh masyarakat tradisional dalam penanganan

kesehatan. Seiring dengan berubahnya pola hidup masyarakat yang kembali

ke alam, maka tanaman obat sekarang ini banyak digunakan kembali.

Seiring dengan perkembangan penelitian mengenai fitokimia, telah

diketemukan senyawa – senyawa aktif yang berpotensi sebagai obat.

Senyawa aktif dari tumbuhan dapat berperan sebagai anti bakteri, anti viral,

antiplasmodial, anti oksidan, antiinflamasi, anti alergi, anti kanker,

immunomodulator dan lain sebagainya. Kelompok senyawa aktif yang umum

dijumpai pada tanaman antara lain : kelompok Alkaloid, Terpenoid, Flavonoid,

Saponin, Polifenol, Vitamin, Polisakarida dan lain sebagainya. Penelitian

tentang kandungan fitokimia dari jenis – jenis tumbuhan masih sangat kecil

dibandingkan jumlah spesies tumbuhan yang ada, oleh karena itu diperlukan

penelitian yang menggali potensi spesies – spesies tumbuhan.

Penelitian tentang immunomodulator banyak dilakukan pada akhir –

akhir ini. Hal ini didorong oleh adanya sistem penyembuhan penyakit yang

meminimalkan penggunaan obat kimia dengan meningkatkan sistem imunitas

tubuh. Sistem imunitas yang meningkat dapat menanggulangi berbagai

macam jenis penyakit. Dengan menggunakan senyawa yang berperan

sebagai immunomodulator, efek negatif dari suatu pengobatan dapat

diminimalkan. Penggunaan senyawa immunomodulator sering digunakan


commit to user

2

sebagai pendamping pengobatan yang bersifat intensif (Radityawan,2005).

Jenis tumbuhan yang telah diteliti sebagai peningkat daya immunomodulator

salah satunya adalah Meniran Hijau. Penelitian mengenai manfaat Meniran

hijau telah banyak dilakukan. Jenis ini telah diteliti berperan sebagai anti

hepatotoksik, anti litik, anti hipersensitif, anti HIV, tuberkulosis (Radityawan,

2005) dan anti hepatitis B (Bagalkotkar et al. 2006) dan juga sebagai

immunomodulator (Ma’at, 1997).

Bentuk keragaman spesies yang terdapat dalam genus Phyllanthus,

membuat meniran ini dibagi menjadi beberapa spesies berdasarkan karakter

morfologi. Berdasarkan klasifikasi Hadad, Meniran dibedakan menjadi tiga

macam yaitu Meniran Merah, Meniran Kuning dan meniran Hijau (Hidayat dkk.

2008). Untuk Meniran merah dengan nama latin Phyllanthus urinaria dan

meniran Hijau dengan nama Phyllanthus niruri. Berdasarkan perbedaan

spesies dalam satu genus maka dimungkinkan ada perbedaan kandungan

fitokimianya.

Penelitian tentang manfaat meniran hijau telah banyak dilakukan, salah

satunya berperan sebagai immunomodulator. Berdasarkan penelitian Lestarini

(2008), Pemberian ekstrak Meniran Hijau diketahui mempunyai efek

peningkatan respons imun seluler terhadap mencit yang diinfeksi dengan

Bakteri S. thypmurium. Sedangkan bagaimana potensi Meniran Merah

sebagai immunomodulator belum banyak digali. Oleh karena itu, peneliti ingin

mengetahui potensi daya immunomodulator yang dimiliki meniran merah

dibandingkan meniran hijau dalam mengatasi infeksi bakteri S. typhi.

Demam tifoid atau sering disebut sebagai tifus, merupakan penyakit

pada saluran pencernaan. Penyakit ini disebabkan oleh bakteri Salmonella


commit to user

3

enterica serovar typhi atau sering disebut Salmonella typhi. Bakteri ini masuk

ke dalam tubuh melalui jalan oral dan menyebar setelah masuk pada sistem

pencernaan (Widoyono, 2008). Penyakit demam tifoid merupakan salah satu

penyakit yang banyak diderita masyarakat pada negara berkembang.

Menurut laporan WHO terdapat 5 negara berkembang yang tercatat

penderita demam tifoid besar adalah: Cina, India, Pakistan, Vietnam dan

Indonesia. Kasus demam tifoid diperkirakan mencapai 16 hingga 33 juta

pertahun di dunia. Dari jumlah kasus ini diperkirakan 600.000 penderita

mengalami kematian (Chatterjee,2010). Penyakit ini berkaitan secara

langsung dengan kebersihan makanan, air dan lingkungan Oleh karena itu,

penyakit ini frekuensinya tinggi pada negara berkembang. Hal ini berkaitan

dengan tingkat kebersihan lingkungan dan pola hidup masyarakat yang

kurang bersih.

Usaha penanggulangan dari penyakit demam tifoid dilakukan dengan

pemberian antibiotik dan vaksinasi. Penggunaan antibiotik paling luas

digunakan untuk menganggulangi penyakit ini. Di Indonesia, antibiotik yang

digunakan untuk pengobatan penyakit ini adalah Kloramfenikol (Widoyono,

2008). Akan tetapi penggunaan antibiotik ini tidak bisa digunakan dalam

jangka relatif panjang karena menimbulkan resistensi (Triadmodjo, 1989).

Selain penggunan antibiotik, dilakukan pula pencegahan dengan penggunaan

vaksin (Azze et al, 2003). Dengan penggunaan meniran hijau sebagai

penanggulangan deman tifoid mampu memberikan solusi dari permasalahan

ini. Meniran hijau dan merah masih dalam genus yang sama, apakah respon

yang ditimbulkan sama atau tidak dalam mengatasi penyakit demam tifoid.


commit to user

4

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang telah diuraikan sebelumnya,

maka peneliti merumuskan permasalahan sebagai berikut :

1. Bagaimanakah respon proliferasi limfosit pada organ Limpa dan Timus

mencit Balb/C yang terinfeksi bakteri Salmonella thypi akibat pemberian

ekstrak Meniran merah (Phyllanthus urinaria)

2. Bagaimanakah pengaruh variasi penambahan dosis ekstrak meniran

merah terhadap respon proliferasi limfosit tubuh mencit Balb/C yang

terinfeksi bakteri S. thypi

C. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk:

1. Mengetahui respon proliferasi limfosit pada organ Limpa dan Timus Mencit

Balb/C yang diinfeksi bakteri Salmonella thypi dengan pemberian ekstrak

meniran merah (Phyllanthus urinaria) .

2. Mengetahui pengaruh variasi penambahan dosis ekstrak meniran merah

terhadap respon proliferasi limfosit tubuh mencit Balb/C yang diinfeksi

bakteri S. thypi

D. Manfaat Penelitian

Penelitian ini memiliki kemanfaatan baik secara teoritis maupun praktis.

Kemanfaatan secara teoritis diharapkan: memberikan informasi tentang efek

immunomodulator ekstrak meniran Merah.

Kemanfaatan secara praktis diharapkan : pemberian ekstrak meniran merah

dapat digunakan sebagai obat tradisional untuk meningkatkan daya

immunomodulator untuk penyakit demam tifoid maupun infeksi penyakit lain.


commit to user

5


commit to user

5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN KERANGKA KONSEP PENELITIAN

A. Tinjauan Pustaka

1. Meniran

Tumbuhan Meniran merupakan salah satu tumbuhan obat yang

berbentuk herba dan tumbuh secara liar. Tumbuhan ini memiliki karakter

morfologis berbeda. Dari perbedaan karakter morfologinya, meniran

diklasifikasikan menjadi tiga macam yaitu Meniran Merah, Meniran Kuning

dan Meniran Hijau. Dari ketiga jenis meniran tersebut, meniran hijau dan

merah saja yang sering dijumpai disekitar kita. Oleh karena itu, meniran

hijau dan merah yang dipilih dalam penelitian ini.

a. Taksonomi

Tumbuhan Meniran dalam nama latinnya Phyllanthus spp memiliki

kedudukan dalam system taksonomi menurut Tjitrosoepomo (1989)

adalah:

Kingdom : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Euphorbiales

Familia : Euphorbiaceae

Genus : Phyllanthus

Spesies : Phyllanthus niruri L., Phyllanthus urinaria Lin.

Meniran memiliki variasi warna batang, meniran hijau dengan

nama latin Phyllanthus niruri L dan meniran merah dengan nama latin

Phyllanthus urinaria Lin. Perbedaan warna batang pada kedua jenis ini


commit to user

6

merupakan salah satu pembeda menurut klasifikasi yang dibuat oleh

Hadad dkk pada tahun 1993 (Hidayat dkk, 2008).

b. Deskripsi Morfologi

Meniran secara umum berbentuk tumbuhan terna dengan

tinggi antara 50 - 100 cm. Tumbuhan ini berumah satu dan bunganya

berkelamin tunggal. Tumbuhan ini memiliki daun majemuk dengan

helaian berbentuk bulat lonjong. Bunga mempunyai antera memecah

secara horizontal. Buah bertekstur licin, menempel pada bawah tangkai

anak daun. Bunga berukuran kecil berwarna putih dan letaknya sama

dengan munculnya buah. Batang dan tangkai daun berwarna sama.

Meniran mempunyai variasi karakter morfologi yang besar. Terutama

warna batang dan cabang. (Hidayat dkk. 2008). Pada meniran hijau

warna batang dan cabang hijau (Gambar 1), sedangkan pada meniran

merah berwarna merah (Gambar 2).

Gambar 1. Meniran Hiaju (Phyllanthus niruri L.)


commit to user

7

Gambar 2. Meniran Merah (Phyllanthus urinaria Lin).

Secara umum kedua meniran memiliki struktur histologi yang

sama. Struktur primer akar memiliki pola jaringan pembuluh diark. Pola

ikatan pembuluh pada batang, cabang dan daun adalah kolateral.

Bentuk kristal prisma dan druse terdapat di batang muda. Tipe jalan

daun kedua species ini adalah unilakunar. Epidermis daun memiliki

papila. Kedua spesies ini memiliki dua tipe stomata yaitu parasitik dan

anisositik. Kristal druse pada daun dapat ditemukan pada jaringan

palisade. Perbedaan yang ditemukan dari kedua species meniran

terdapat pada : bentuk batang muda, bentuk cabang, bentuk dan

penyebaran kristal, serta ada tidaknya trikoma pada tepi daun (Qonit,

2010).

Meniran hijau memiliki warna batang dan tangkai daun hijau

dengan bentuk sayatan batang muda bulat. Jenis ini tidak memiliki

bentuk Kristal polyhedral. Bentuk sayatan cabang berbentuk bulat

berlekuk tiga. Kristal druse pada daun dapat ditemukan hanya pada


commit to user

8

jaringan palisade. Jenis ini tidak memiliki trikoma uniseluler (Qonit,

2010).

Meniran merah memiliki warna batang dan tangkai daun merah

walaupun kadang agak kehijauan. Sayatan batang muda berbentuk

persegi lima . Jenis ini memiliki bentuk kristal polihedral. Bentuk

sayatan cabang berbentuk pipih bersayap. Meniran merah memiliki

kristal druse pada jaringan palisade dan tulang daun. Pada tepi daun

meniran merah dapat ditemukan trikoma uniseluler (Qonit, 2010).

c. Kandungan Kimia

Kandungan kimia Meniran yang telah diteliti adalah kandungan

kimia Meniran hijau, sedangkan untuk kandungan kimia Meniran merah

belum diteliti. Kandungan kimia meniran Hijau berupa kelompok Lignan,

Terpen, Flavanoid, Lipid, Benzoid, Alkaloid, Steroid, Alcanes dan

senyawa lain seperti Vitamin C, Tannin, Saponin (Bagalkotkar et al.

2006).

d. Habitat

Meniran dapat kita temui pada tempat terbuka. Tumbuhan ini

dapat hidup baik pada dataran rendah maupun tinggi. Selama ini

tumbuhan ini tumbuh secara liar dan belum dibudidayakan. Hal ini

dikarenakan tumbuhan ini cepat tumbuh dan berkembangbiak. Meniran

memiliki daerah distribusi yang luas, meliputi Asia, Australia, Amerika,

dan Afrika ( Unader et al dalam Hidayat dkk. 2008)


commit to user

9

Meniran hijau banyak ditemukan pada lahan yang agak teduh.

Jenis ini mendominasi pada lingkungan sekitar rumah, kebun dan tepi

jalan, akan tetapi pada lingkungan persawahan dan ladang sangat

sedikit keberadaannya. Meniran merah banyak ditemukan pada lahan

terbuka yang langsung terpapar sinar matahari seperti sawah dan

ladang, walaupun kadang dijumpai disekitar rumah dan kebun dengan

jumlah yang relative kecil.

e. Kegunaan

Meniran hijau dapat berguna sebagai anti viral jenis infeksi virus

morbili, influenza, bronkhitis, rhinovirus, pneumonia dan bahkan virus

HIV dapat dihambat replikasinya dengan ekstrak tumbuhan ini (Naik and

Juvekar. 2003). Menurut penelitian Maat (1997), ekstrak meniran hijau

mempengaruhi fungsi dan aktivitas komponen sistem imun. Hasil yang

sama pada penelitian yang dilakukan oleh Lestarini (2008). Pemberian

ekstrak Meniran Hijau diketahui mempunyai efek peningkatan respons

imun seluler terhadap mencit yang diinfeksi dengan Bakteri S.

thypmurium. Penyakit gangguan pencernaan seperti kondisi dispepsia,

kolik, diare dan disentri meniran hijau dapat digunakan (Khatoon et al.

2006). Selain itu, ekstrak meniran hijau yang diberikan ke sel

mononuklear, dapat menurunkan viabilitas sel tumor (Chodijah, 2003).

Manfaat meniran merah yang telah diteliti adalah bersifat

diuretic, hopoglikemik, mempengaruhi apoptosis sel kanker paru – paru

(Huang et al. 2004) dan anti viral herpes simplek (Yang et al, 2007),

sedangkan kegunaan sebagai immunomodulator belum diteliti.


commit to user

10

2. Salmonella thypi

a. Taksonomi

Salmonella thypi dalam kedudukan pada system taksonomi

menurut Kauffman and Edwards (1952) (dalam Pelczar and Chan 1988)

digolongkan dalam:

Kingdom: Eubacteria

Phylum: Proteobacteria

Class: Gammaproteobacteria

Order: Enterobacteriales

Family: Enterobacteriaceae

Genus: Salmonella

Species: Salmonella enteriditis

Dalam satu spesies Salmonella enteriditis, terdapat beberapa

serotipe yaitu Salmonella enteriditis bioserotipe paratyphi A atau S.

paratyphi A, Salmonella enteriditis bioserotipe paratyphi B atau S.

paratyphi B, Salmonella enteriditis bioserotipe paratyphi C atau S.

paratyphi C (Kresno,1996).

b. Deskripsi Morfologi

Salmonella typhii merupakan bakteri gram negatif, baciliform,

pendek, fakultatif anaerob intraseluler yang dapat hidup bahkan

berkembang biak dalam makrofag, tahan terhadap enzim-enzim

lisosom, mempunyai kemampuan untuk mencegah fusi phagosome-

lysosome sehingga sulit dibunuh. Salmonella bersifat motil dengan

peritrichous flagella dan mempunyai faktor virulensi utama yang berupa


commit to user

11

lipopolisakarida (LPS) yang dapat menstimulasi respons imun pada

inang (Bauman,2006: Talaro, 2008).

c. Biologi Salmonella thypi

Salmonella bersifat motil dan patogenik. Bakteri ini mempunyai

karateristik memfermentasikan glukosa dan tidak memproduksi laktosa,

sukrosa dan indol. Bakteri ini hidup optimum pada rentang suhu 350C –

370C, pH 3.8 – 9,5. S. thypi hidup pada air, atau media lain seperti

makanan Sebagian besar Salmonella memproduksi gas H2S dan

mereduksi nitrat. Salmonella tahan terhadap bahan kimia tertentu

seperti brilliant green, sodium tetrathionat dan sodium dioksilat, yang

menghambat bakteri lain sehingga senyawa tersebut sering

ditambahkan pada media untuk mengkultur Salmonella (Pelczar and

Chan,1988).

3. Penyakit Demam Tifoid

a. Agen pernyebab

Demam Tifoid atau sering disebut Tifus merupakan penyakit

infeksi pada usus halus yang disebabkan oleh bakteri Salmonella typhi.

Bakteri ini masuk ke dalam tubuh manusia melalui makanan dan air

yang tercemar (Widoyono, 2008). Penyebaran penyakit ini berkaitan erat

dengan kebersihan lingkungan dan makanan.

Masa inkubasi penyakit ini 8 sampai 48 jam. Sebagian bakteri ini

dapat dimusnahkan oleh asam lambung tetapi masih ada yang masuk

ke usus halus dan mencapai jaringan limfoid dan bersarang di jaringan

tersebut, selain itu bakteri ini juga bersarang di limpa, hati dan bagian-


commit to user

12

bagian lain system retikulo endotelial. Endotoksin atau racun dari S.

typhi berperan dalam proses inflamasi lokal pada jaringan tempat bakteri

tersebut berkembang biak. S.typhi dan endotoksinnya merangsang

sintesis, pelepasan zat pirogen dan leukosit pada jaringan yang

meradang, sehingga terjadi demam (Bauman, 2006).

Gejala-gejala yang muncul bervariasi, dalam minggu pertama

sama dengan penyakit infeksi akut pada umumnya yaitu demam, sakit

kepala, pusing, nyeri otot, anoreksia, mual, muntah,hilang nafsu makan,

diare, perasaan tidak enak pada perut, batuk dan peningkatan suhu

badan. Dalam minggu kedua gejala-gejala menjadi lebih jelas berupa

demam, perforasi dinding usus dan peritonitis (Bauman, 2006).

b. Mekanisme penyerangan

Mekanisme penyerangan S. thypi berlangsung dalam beberapa

stadium. Pada stadium awal bersifat asimtomatik. Pada fase ini bakteri

tersebar pada system retikulo endhotelial dan mengivasi makrofag.

Sedang pada minggu kedua mulai terbentuk bintik merah, abdominal

pain dan spenomegaly. Pada minggu ketiga mulai terjadi inflamasi usus

halus yang akut dan kadang terjadi perforasi dan haemoragi. Pada hari

7 – 14 terjadi poliferasi dan penyebaran bakteri dari aliran darah menuju

system retikulo endotelial pada hati, limpa, sumsum tulang dan empedu

(Bauman, 2006)

d. Penanggulangan penyakit

Penaggulangan demam tifoid banyak dilakukan dengan

penggunaaan antibiotic. Jenis antibiotic yang paling banyak digunakan

di Indonesia yaitu Kloramfenikol (Widoyono, 2008).


commit to user

13

Selain pada pengobatan, tahap penanggulangan juga dilakukan

pada taraf pencegahan. Pencegahan dilakukan dengan kebersihan

lingkungan dan juga kebersihan dari makanan.

4. Sistem pertahanan Tubuh.

Tubuh organisme khususnya manusia mempunyai suatu

mekanisme kekebalan atau imunitas. System ini menjamin tubuh dari

kerusakan yang disebabkan oleh pathogen. System pertahanan tubuh

dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan fungsinya.

a. Respon Imun Non-spesifik

Respon Imun non-spesifik merupakan bentuk respon yang dapat

dilakukan oleh system imun tubuh walaupun belum pernah terpapar

benda asing sebelumnya. System respon ini merupakan bawaan

(innate) dalam tubuh (Bellanti, 1993). Bentuk respon ini bersifat sama

tanpa pembedaan jenis antigen yang masuk. Sifat imunitas ini

merupakan bawaan langsung tubuh tanpa rekayasa sebelumnya.

Bentuk dari respon ini dapat berupa proses fagositosis dan reaksi

inflamasi. Fagositosis merupakan suatu proses penghancuran antigen

dengan cara menelan dalam sel fagosit. Sel yang berperan dalam

proses ini antara lain: makrofag, neutrofil dan monosit (Kresno, 1996).

Makrofag merupakan sel fagosit mononuclear yang utama di

jaringan dalam proses fagositosis. Makrofag diproduksi di sumsum

tulang belakang dari sel induk mieloid yang mengalami proliferasi dan

dilepaskan ke dalam darah sesudah atau satu periode melalui fase

monoblas-fase promonosit-fase monosit. Monosit yang telah


commit to user

14

meninggalkan sirkulasi darah akan mengalami perubahan-perubahan

untuk kemudian menetap di jaringan sebagai makrofag (Bellanti, 1993).

Neutrofil merupakan granulosit dalam aliran darah. Sel ini dapat

bergerak menuju daerah inflamasi. Rangsang yang menggerakan

neutrofil adanya kemotaktik yang dikeluarkan oleh komplemen atau

limfosit teraktivasi. Sel ini berfungsi untuk memfagositosis antigen

(Bellanti, 1993).

b. Respon Imun spesifik

Respon imun spesifik merupakan bentuk respon tubuh yang dapat

mengenali jenis antigen. Respon ini hanya terjadi bila sebelumnya telah

terpapar dengan jenis antigen tertentu. Respon imun spesifik ini

diperankan oleh sel – sel limfosit (Bellanti, 1993).

Sel limfosit mampu mengenali setiap jenis antigen baik secara

intraseluler maupun ekstraseluler. Sel limfosit dibedakan menjadi dua

yaitu sel limfosit T dan sel Limfosit B. Pembedaan ini berdasarkan

fungsinya. Sel limfosit T bertanggungjawab pada respon imun seluler

dan limfosit B bertanggungjawab terhadap respon imun humoral

(Bellanti, 1993).

Limfosit T mempunyai peran utama dalam mengontrol dan

mengatasi infeksi intraseluler pathogen dengan memproduksi sitokin.

Limfosit T dapat memediasi secara langsung proses pelisisan sel yang

terinfeksi. Infeksi Salmonella dapat memberikan penghambatan

terhadap pembentukan sel Dendritik (DC). Sel Dendritik ini berperan

secara langsung dalam proliferasi Limfosit T. Jika limfosit T terganggu,

maka aktivasi limfosit B juga terganggu (Velden et al.2005).


commit to user

15

Walaupun respon imun dibedakan menjadi spesifik dan non

spesifik, akan tetapi kedua bentuk respon imun ini saling melengkapi

dan bekerja secara sinergis. Bentuk dari kerjasama ini akan

membangun system imun tubuh yang optimal (Kresno, 1996).

c. Organ Limfoid

Sistem pertahanan tubuh dibangun oleh jaringan dan organ.

Organ – organ yang berperan dalam memproduksi sel limfosit adalah

organ limfoid. Organ limfoid dibagi menjadi dua yaitu organ limfoid

primer dan sekunder. Organ limfoid primer adalah Timus dan sumsum

tulang, sedangkan organ limfoid sekunder adalah Limpa dan Limfonodi.

Timus sebagai organ limfoid primer berperan dalam pematangan sel

limfosit T. Limfosit T yang terbentuk kemudian bermigrasi ke jaringan

limfoid sekunder. Organ limpa berperan sebagai tempat pertemuan

limfosit dengan antigen (Velden et al.2005). Contoh antigen yang dapat

diamati pada organ limpa adalah koloni bakteri. Hasil penelitian

Sunarno (2007) , jumlah koloni bakteri S. thypimurium pada organ

limpa dapat dihitung dan pengaruh pemberian meniran hijau terhadap

koloni bakteri dapat dilihat.

5. Immunomodulator

Immunomodulator merupakan rangkaian reaksi tubuh untuk

memperbaiki diri dari serangan pathogen. Pathogen yang menyerang dapat

berupa virus, bakteri, protozoa, jamur dan antigen lain. Kemampuan ini

dipegang sepenuhnya oleh sistem pertahanan tubuh baik secara seluler

maupun humoral. Proses yang diperankan oleh sistem pertahanan tubuh


commit to user

16

dapat bekerja bila terdapat rangsang yang berupa antigen asing. Daya

immunomodulator pada tubuh organism dapat berlangsung cepat atau juga

lambat. Kecepatan kerja dari immunomodulator tergantung dari keadaan

tubuh organism dan juga ketersediaan senyawa tertentu yang berguna

sebagai imunostimulan. Respon immunologis terhadap antigen dipacu oleh

terlepasnya senyawa sitokin dalam darah. Adanya sitokin dalam darah

dipengaruhi oleh respon imun seluler yaitu limfosit. Respon proliferasi

limfosit mempengaruhi kecepatan pengeluaran sitokin, Kecepatan

pengeluaran sitokin merupakan indicator daya immunomodulator (Spelman

et al, 2006). Jadi, respon proliferasi limfosit secara tidak langsung sebagai

indicator daya immunomodulator.

Stimulasi pengeluaran sitokin dapat dipacu oleh beberapa senyawa

aktif. Jenis – jenis senyawa aktif banyak ditemukan pada tumbuhan.

Penelitian mengenai flavanoid telah memberikan keterangan bahwa

senyawa ini mampu sebagai immunostimulator dan antioksidan (Saraf et al

2007).


commit to user

17

B. Kerangka Penelitian

Gambar 3. Kerangka Penelitian

C. Hipotesis

Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah:

1. Respon proliferasi limfosit pada organ Limpa dan Timus pada mencit

Balb/C yang diinfeksi bakteri Salmonella thypi dipengaruhi oleh

pemberian ekstrak meniran Merah.

2. Respon proliferasi limfosit dipengaruhi oleh variasi penambahan dosis

pemberian ekstrak meniran merah.

Meniran Hijau (Phyllanthus niruri )

Meningkatkan Daya Immunomodulator

Meniran Merah (Phyllanthus urinaria)

Belum ada penelitian mengenai efek Daya Immunomodulator

Mencit yang diinfeksi Salmonella thypi

Proliferasi Limfosit Perlakuan Phyllanthus urinaria Lin

Meniran Berdasarkan perbedaan karakter morfologi

Daya Immunomodulator setelah pemberian ekstrak dengan indicator proliferasi limfositnya sehingga meningkatkan respon imun seluler

Proliferasi Limfosit Perlakuan Phyllanthus niruri L

Diperbandingkan

Kesimpulan


commit to user

18


commit to user

18

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian laboratorik yang meliputi penelitian

respon proliferasi limfosit secara in vivo dan in vitro. Adapun metode penelitian

yang digunakan akan diuraikan dibawah ini.

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakasanakan mulai bulan Januari sampai dengan April

2011 . Adapun tempat penelitian dilakukan pada laboratorium Pusat sub unit

Kimia UNS, Laboratorium PAU Bioteknologi UGM dan Laboratorium LPPT

UGM.

B. Rancangan Penelitian

Rancangan yang dipakai dalam penelitian ini adalah rancangan the

post test-only control groups . Subjek penelitian diambil dari populasi mencit

Galur Balb/C dengan jenis kelamin jantan, berat badan 20 – 30 gr/ekor, aktif

dan berumur 6 – 10 minggu. Pemilihan individu sebagai kelompok

perlakuan dilakukan secara acak dari dalam satu populasi. Jumlah sampel

48 ekor mencit dengan 8 perlakuan dan 6 ulangan. Delapan perlakuan terdiri

dari Kontrol negative, Kontrol positif, Ekstrak meniran merah dengan tiga

variasi dosis dan Ekstrak meniran hijau dengan tiga variasi dosis. Variasi

dosis yang dipakai dalam penelitian ini adalah: 3x0,065mg/hari,

3x0,130mg/hari dan 3x0,260mg/hari.


commit to user

19

Gambar. 4 Alur Penelitian

Keterangan Gambar 4 :

H1: kelompok perlakuan 1 (pemberian ekstrak meniran Hijau 3 x 0,065mg/hari)

H2: kelompok perlakuan 2 (pemberian ekstrak meniran Hijau 3 x 0,130 mg/hari)

H3: kelompok perlakuan 3 (pemberian ekstrak meniran Hijau 3 x 0,260 mg/hari)

M1: kelompok perlakuan 1 (pemberian ekstrak meniran Merah 3 x 0,065 mg/hari)



Kontrol negative: tanpa pemberian ekstrak maupun infeksi bakteri

Kontrol positif : Diinfeksi bakteri dan diberikan pelarut ekstrak

PH1:Proliferasi limfosit kelompok perlakuan meniran hijau 1

PH2: Proliferasi limfosit kelompok perlakuan meniran hijau 2

PH3: Proliferasi limfosit kelompok perlakuan meniran hijau 3

PM1: Proliferasi limfosit kelompok perlakuan meniran merah 1



PK-: Proliferasi limfositv kelompok perlakuan control negatif

PK+: Proliferasi limfositv kelompok perlakuan control positif

Mencit Balb/C

Diinfeksi S thypi hari ke -4

Pemberian ekstrak hari ke 1 - 10

Tanpa perlakuan

Pemberian pelarut ekstrak hari ke 1 -10

Dengan perlakuan

Dipelihara 10 hari

P M1 P M2 P M3

Dikorbankan hari ke-11 diisolasi limfositnya dan dihitung jumlahnya

P K+ P K -

Dikultur dengan variasi waktu inkubasi 24, 48 dan 72 jam

P H1 P H2 P H3


commit to user

20

C. Alat dan Bahan Penelitian

Alat – alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: tabung reaksi,

shiringe,kandang pemeliharaan mencit,cawan petri,timbangan

analitik,seperangkat alat ekstraksi sokhetasi,sonde lambung, spuit , kaca

objek, mikroskop cahaya, seperangkat alat bedah steril, inkubator CO2 5%,

laminar air flow, pipet eppendorf, sentrifugasi, microplate 96 well dasar rata,

MTT assay, Eliza reader, Filter 0,2, Hemocytometer, bejana pengembang ,

dan pipa kapiler.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:hewan uji mencit,

pellet, lempeng silica gel GF254, ekstrak meniran merah, ekstrak meniran

hijau, medium trypticase soy broth, strain bakteri Salmonella thypi, NaCl

isotonic, akuabides steril dan sampel berupa limfosit yang diambil dari

kelenjar timus, dan limpa.

Reagen yang digunakan adalah: alkohol 70%, methanol 90%, asam

asetat 3%, Phosphate Buffered Saline(PBS), RPMI medium 1640, Penstrep,

Fungasol, NaHC03, Hepes, CHCl3, ethyl asetat, Toluen, Diethylamina,

Methanol, n-heksan dan sebagai bahan penyemprot uap ammonia,

dragendrof, anisaldehid dan FeCl3.

D. Prosedur Penelitian

1. Penyiapan inokulum

Inokula bakteri strain Salmonella thypi didapatkan dari

laboratorium PAU Pangan dan Gizi UGM. Jumlah koloni yang diperlukan

untuk proses infeksi adalah 105 CFU. Bakteri dihitung jumlah koloninya

sebelum diinokulasi pada mediun garam fisiologis. Inokula bakteri dalam

medium diletakkan pada botol kaca dan dibawa dengan thermafreezer.


commit to user

21

Peneliti dan teknisi menggunakan alat pelindung diri berupa jas lab,

sarung tangan karet dan masker.

2. Penyiapan hewan uji

Hewan uji merupakan mencit galur BaLB/C yang berumur 4 – 7

minggu dengan jenis kelamin jantan, aktif dan berat badan antara 20 – 30

gr/ekor. Sebanyak 48 ekor dengan setiap perlakuan 5 ulangan. Dasar dari

perulangan menurut WHO dengan jumlah minimal 5 ekor ulangan tiap

perlakuan. Mencit didapatkan dari Unit bidang praklinis UGM, sedangkan

perlakuan penelitian pada laboratorium hewan coba PAU Bioteknologi.

Mencit diletakkan pada kandang dengan jumlah maksimal 5 ekor per

kandang. Pengelompokan didasarkan pada jenis perlakuan. Untuk

kelompok control diletakkan pada bagian rak terpisah. Ruangan penelitian

terpisah dengan hewan uji lain dan tertutup. Mencit dipelihara dan diberi

makan pellet dan diberi minum secara reserve osmosis secara ad libitum.

Sebelum perlakuan dilakukan aklimatisasi selama 7 hari.

3. Pembuatan Ekstrak meniran

Tumbuhan meniran hijau didapatkan dari BPTO Tawangmanggu.

Tumbuhan meniran kemudian diekstraksi dengan metode Sohxetasi.

Pelarut yang digunakan adalah etanol 70 %. Sedangkan meniran merah

didapatkan di daerah Ngemplak, Boyolali. Tumbuhan tersebut kemudian

di ekstraksi dengan metode Sohxletasi dengan pelarut etanol 70%.

Ekstrak berupa pasta dan dicairkan dengan CMCMA 0,25%

(LPPT UGM) dengan konsentrasi sesuai dosis. Untuk pemberian ekstrak

per mencit sebanyak 0,5 mL untuk tiap dosisnya.


commit to user

22

4. Analisis Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis.

Senyawa kimia hasil ekstraksi dianalisis dengan metode

kromatografi lapis tipis (KLT). Masing-masing ekstrak ditotolkan pada

lempeng KLT dengan fase diam berupa gel GF254 dan dielusi dengan

menggunakan fase gerak.

Fase gerak berupa CHCl3 : Ethyl asetat (6:4) untuk mengelusi

senyawa Flavonoid, Toluen: Ethyl asetat: diethylamina (7:2:1) untuk

mengelusi senyawa Alkaloid, n-heksan dan etilasetat (3:7) untuk

mengelusi senyawa Tanin ,CHCl3: Metanol: air (6:3:1) untuk mengelusi

senyawa saponin dan Ethylasetat: Metanol: Air (10: 1,5:1) untuk

mengelusi senyawa fenol dalam bejana pengembang. Setelah ekstrak

meniran ditotolkan pada lempeng silic gel KLT, kemudian ditandai dengan

pensil untuk titik startnya. Setelah itu, lempeng dimasukkan ke bejana

pengembang yang berisi fase gerak dan ditunggu sampai fase gerak

mencapai sisi atas lempeng. Waktu yang dibutuhkan sekitar 20 – 30

menit. Lempeng KLT kemudian diangkat dari bejana pengembang dan

dilakukan penyemprotan dalam lemari asam.

Senyawa penyemprot untuk mendeteksi senyawa Flavonoid

adalah uap ammonia, senyawa Alkaloid adalah Dragendrof, Saponin

adalah Anisaldehid, Tanin dan Fenol dengan FeCl3 . Setelah disemprot,

lempeng dikeringkan dan dilihat pada lampu UV dan visible, setelah itu

didokumentasikan. Hasil yang diperoleh merupakan spot dengan warna

tertentu, setelah itu diukur jarak dan dihitung nilai Rf-nya.


commit to user

23

Jenis senyawa penyusun diidentifikasi berdasarkan pada nilai Rf

(retardation faktor) yang terbentuk pada kromatogram. Nilai Rf

dirumuskan :

Rf = Jarak gerakan zat terlarut

Jarak gerakan pelarut

5. Perlakuan pada Hewan uji

Mencit diberi makan dan minum dengan cukup. Sebelum

perlakuan dilakukan aklimatisasi selama 7 hari. Setelah itu baru dilakukan

perlakuan pemberian ekstrak.

Pemberian ekstrak Meniran Hijau sesuai dosis selama 10 hari.

Dengan dosis 3 x dosis perlakuan per hari dalam volume 0,5 cc. Dosis

perlakuan baik Meniran Hijau maupun Meniran Merah adalah 3x0,065

mg/hari, 3x0,130mg/hari dan 3x0,260mg/hari. Mencit diberi ekstrak

meniran dengan cara ekstrak dimasukkan ke dalam sonde lambung

dengan ukuran jarum 2,5. Selanjutnya, hewan dipegang dengan tangan

kiri (dihindari leher jangan sampai tercekik). Setelah dalam kondisi hewan

terfiksir dengan benar dan tenang, dimasukkan sonde lambung sampai

mendekati lambung atau bila seluruh jarum spuit masuk, ekstrak

disuntikkan. Beberapa saat setelah penyuntikan, hewan diamati sampai

beraktivitas kembali (Standart LPPT UGM).

Proses penginfeksian dilakukan oleh teknisi dengan alat pelindung

diri lengkap dan lingkungan aseptic. Mencit diberi ekstrak meniran mulai

hari 1 sampai hari ke 10. Pada hari ke-4, mencit diinfeksi bakteri

Salmonella typhi. Cara penginfeksian Bakteri Sallmonella thypi pada

mencit dilakukan dalam keadaan mencit teranesthesi. Mencit sebelum


commit to user

24

infeksi dianasthesi dengan Ketamin dengan dosis 10ml/kg BB sebanyak

0,1mL/ekor. Setelah mencit teranesthesi dengan sempurna, Mencit

diinfeksi dengan bakteri Salmonella thypi secara intraperitoneal. Jumlah

bakteri yang diinokulasi adalah 105/0,5 cc per ekor (Standard LPPT

UGM).

Pada hari ke-11, mencit dikorbankan. Proses terminasi dengan

cara Mencit dikorbankan dengan narkose ether secara over dosis.

Awalnya, Mencit yang akan dikorbankan dimasukkan ke dalam stoples,

kemudian ditutup rapat. Selanjutnya, 10–20 ml ether dituang kedalam

kapas dan dimasukkan ke dalam stoples yang telah dihuni mencit

tersebut Dua sampai 5 menit kemudian, dilakukan pengamatan terhadap

nafas, dan denyut jantung. Apabila mencit sudah tidak bernafas, tutup

toples dibuka, hewan diletakkan di tempat nekropsi. Sebelum dilakukan

pembedahan, dilakukan pengamatan kembali terhadap denyut jantung

dan nafas untuk memastikan hewan telah benar-benar mati (Standard

LPPT UGM). Setelah mencit diyakini mati kemudian direntangkan pada

bak bedah dengan posisi terlentang. Kulit bagian perut dibuka dan

dibersihkan selubung peritoneumnya dengan alcohol 70%. Kelenjar limpa

yang berada disisi kiri atas dengan bentuk memanjang berwarna merah,

diambil dengan cara mencari ujungnya dan digunting. Limpa dibersihkan

dari selubung pengikatnya. Kelenjar timus yang berada diatas dada juga

diambil dan diperlakukan yang sama dengan limpa. Limpa dan timus

diletakkan dalam cawan petri diameter 50 mm yang berisi 5 mL RPMI.


commit to user

25

6. Uji Proliferasi Limfosit

Langkah pertama merupakan isolasi limfosit dari organ limfoid

yaitu : timus dan limfa. Isolasi limfosit menggunakan medium RPMI.

Media RPMI dipompakan ke dalam organ sehingga limfosit ikut keluar

bersama media. Suspensi sel dimasukkan dalam tabung sentrifus 10 mL

dan disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Pelet yang

didapat, disuspensikan ke dalam 2 mL Tris Buffered Ammonium Chloride

untuk melisiskan eritrosit. Sel dicampur hingga homogen dan didiamkan

pada suhu ruang selama 2 menit. Ditambahkan 1 mL FBS pada dasar

tabung, campur, sentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 5 menit dan

supernatan dibuang. Pelet dicuci 2 kali dengan RPMI dan dilakukan

proses seperti awal hingga didapatkan beningan dan sel limfosit

disuspensikan dengan medium komplit. Sebelum dikultur, limfosit

dihitung jumlahnya dengan hemositometer dengan pewarnaan biru tripan.

Rumus yang dipakai adalah:

N = A × FP × 104sel/mL

Keterangan : N = jumlah sel limfosit/mL, A = Jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang FP = Faktor pengenceran

Pengujian yang kedua adalah aktivitas limfosit atau disebut

viabilitas sel limfosit. Untuk proses uji aktivitas limfosit sel ditepatkan

jumlahnya menjadi 1,5 x 106 sel/mL. Uji Aktivitas limfosit dilakukan dalam

sumuran-sumuran mikroplate 96-wells sesuai dengan masing-masing

kelompok perlakuan dan diinkubasi selama 24, 48 dan 72 jam dalam

inkubator dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37°C. Suspensi sel yang

telah ditepatkan jumlanya, kemudian diambil sebanyak 100µL untuk tiap 1


commit to user

26

sumuran(well). Untuk tiap kelompok perlakuan dengan 2 replikasi. Tiap

sumuran kemudian ditambahkan Phytohaemaglutinin (PHA) dengan

konsentrasi akhir 50µL/mL sebanyak 10 µL/sumuran sebelum

diinkubasikan. Setelah diinkubasi selama 24 jam, Kultur limfosit difoto

setelah itu masing-masing sumuran ditambahkan larutan MTT dengan

konsentrasi akhir 5 mg/mL sebanyak 10µL. Kultur kemudian diinkubasi

lagi selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan

MTT membentuk warna ungu. Reaksi dengan MTT dihentikan dengan

menambah reagen stopper yaitu larutan SDS 10% dalam asam klorida

0,01N sebanyak 100µL pada tiap sumuran. Hasilnya dibaca dengan

ELISA Reader dengan panjang gelombang 550 nm 24 jam setelah reaksi

Stopper. Proses yang sama dilakukan untuk waktu inkubasi 48 jam dan

72 jam.

E. Cara Pengolahan dan Analisis Data

Data yang diperoleh dilakukan editing, coding dan entry dalam file

komputer. Setelah dilakukan clearing, data dianalisis secara statistik

dengan bantuan program SPSS versi 12. Analisis deskriptif menampilkan

nilai rerata dan simpangan baku dari variabel tergantung (jumlah limfosit

aktif). Hasil dibuat dalam bentuk grafik error bar. Uji statistic yang

digunakan adalah Independent T Test dan estimasi kurva untuk melihat

pola kencenderungan dari perlakuan.


commit to user

61

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat diambil kesimpulan:

1. Pemberian ekstrak meniran merah berpengaruh lebih baik terhadap respon

proliferasi limfosit dengan meningkatkan proliferasi limfosit pada organ Limpa

dan pada organ Timus menekan mendekati proliferasi limfosit keadaan

sehat.

2. Pemberian penambahan dosis ekstrak meniran merah cenderung

menguatkan respon proliferasi limfosit.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut isolasi senyawa flavonoid dan saponin

dari meniran merah dari segi kuantitas dan fungsinya dalam peningkatan daya

immunomodulator.

2. Perlu dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksisistas akibat perlakuan

meniran merah

3. Perlu dilakukan penelitian fitofarmaka dari meniran merah.

RESPON PROLIFERASI LIMFOSIT PADA ORGAN LIMPA DAN … fileimmunomodulator belum digali. Penelitian...

Documents

Transcript of RESPON PROLIFERASI LIMFOSIT PADA ORGAN LIMPA DAN … fileimmunomodulator belum digali. Penelitian...