7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

1/107

REPLIKASI, PERBAIKAN DAN

REKOMBINASI DNA

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

2/107

Mempertahankan sekuens DNA

Perubahan genetik kadang diperlukan, tapiumumnya lebih penting mempertahankansekuens genetik.

Perubahan permanen pada DNA disebutsebagai mutasi.

Bila mutasi terjadi pada posisi penting dalamsekuens DNA, dapat bersifat letal

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

3/107

Mutasi

Laju mutasi dalam sel sangat lamban.

Banyak mutasi bersifat sunyisulit dideteksi.

E.coli, kecepatan mutasi kl satu nukleotida per 10

9

nukleotida per generasi sel.

Tidak seluruh mutasi akan diekspresikan dalambentuk perubahan protein : Ada beberapa kodon

yang mengkode untuk asam amino yang sama !!

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

4/107

Mutasi

Pada organisme yang berasal dari nenekmoyang yang sama, diperkirakan laju mutasidigambarkan dalam unit evolutionary timeyaitu waktu yang dibutuhkan untukperubahan satu asam amino pada sekuensyang memuat residu 100 asam amino.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

5/107

Replikasi DNA

Akurasi pada replikasi sel penting.

Hal yang utama dalam proses replikasi danperbaikan DNA ada pasangan basa yangtetap. A selalu berpasangan dengan T, Gselalu berpasangan dengan C.

Pada setiap rantai DNA selalu dijumpai

pasangan basa komplementer pada rantaisatunya.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

6/107

Replikasi DNA

Setiap basa dari DNA berfungsi sebagai cetakanuntuk mengikat nukleotida bebas yangberkomplementer. Proses dibantu oleh enzim

yang DNA polymerase. Proses ini perlu DNAuntai tunggal.

Replikasi DNA terjadi secara semikonservatif

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

7/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

8/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

9/107

Replikasi DNA

Walau demikian proses replikasi DNA tidakberjalan semudah itu. Proses inimensyaratkan adanya 2 jenis DNApolymerase, 1 yang bekerja dari 5-3 dansatunya lagi yang bekerja dari 3-5.

Pada kenyataannya, di luar laboratorium, tidak

dijumpai DNA polymerase yang bekerja dari3-5.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

10/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

11/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

12/107

Replikasi DNA

Percobaan dengan 3H-timidin pada bakteria DNAyang sedang membelah diri menunjukan adanya

potongan DNA yang muncul sementara

fragmen Okazaki panjang 1000-2000 nt.Fragmen yang serupa walau lebih pendek (100-200) nt dijumpai pada eukariota.

Fragmen Okazaki ini hanya memanjang dari 5-3dan kemudian bersatu untuk membuat rantaiDNA panjang.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

13/107

Replikasi DNA

Jadi replikasi DNA tidak terjadi secara simetris. Pada rantaiyang satu terjadi sintesa yang terus-menerus dan disebutsebagai leading strand. Sedangkan rantai yang satu

disintesa secara diskontinu disebut sebagai laggingstrand.

Sintesa dari lagging strand berjalan dari arah kebalikanpertumbuhan rantai DNA. Potongan-potongan tersebut

baru disintesa setelah untai ganda DNA dipisah olehpembentukan leading strand.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

14/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

15/107

Replikasi DNA

Beberapa hal yang mengganggu prosespemasangan DNA komplementer:

1. Dengan perubahan struktur geometri helix,dapat terbentuk dua ikatan H antara G dan T

2. Kadang terdapat struktur tautomer yangjarang, sehingga C dapat berikatan dengan A

tanpa perubahan struktur geometri helix

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

16/107

Replikasi DNA

Mekanisme proof reading mengoreksi segerabila terjadi kesalahan pemasangan basa ditahap paling awal.

Mekanisme proof reading yang pertamadilakukan oleh DNA polymerase danberlangsung pada saat awal beberapa basa

ditambahkan ke rantai yang sedang tumbuh

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

17/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

18/107

Replikasi DNA

Mekanisme kedua adalah exonucleolytic proofreading,terjadi bila basa sudah terikat secara kovalen pada rantaiyang sedang tumbuh. DNA polymerase tidak dapat

memperpanjang rantai polinukleotida hanya denganmenghubungkan dua dNTP, tetapi membutuhkan basayang dipasangkan pada posisi 3-OH dari rantai primeruntuk menambahkan nukleotida. Molekul DNA yangmismatch tidak akan efektif berfungsi sebagai cetakan

karena polymerase tidak dapat memperpanjang rantaitsb.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

19/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

20/107

Replikasi DNA

Molekul DNA polymerase mengatasinya dengan caramempunyai tempat katalitik baik sebagai subunitterpisah atau tempat terpisah dari molekul polymerasetersebut. Eksonuklease ini (3-5 proofreading

exonuclease) akan memotong residu basa yang tidakdapat dipasangkan sampai mencapai terminus 3-OHyang dapat mensintesa DNA.

Mekanisme proofreading ini tidak dijumpai pada RNA

polymerase karena kesalahan pada RNA ini tidak akanditeruskan kepada generasi berikutnya.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

21/107

Replikasi DNA

Kesalahan pada sintesa RNA sekitar 100.000 kali lebihsering dibandingkan dengan kesalahan pada replikasiDNA

Mekanisme proof reading ini hanya terjadi bila replikasiDNA berjalan dari arah 5-3. Bila berjalan sebaliknya,ujung 5 akan mengaktivasi triphosphate sehinggakesalahan tidak dapat dihidrolisa.

Walau dengan mekanisme diatas, kadang replikasi DNA

juga masih mengalami kesalahan. Untuk itu terdapatproses yang disebut sebagai strand-directed mismatchrepair.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

22/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

23/107

Replikasi DNA

Pada saat replikasi, leading strand hanyamembutuhkan primer awal pada saatdimulainya proses replikasi, DNA polymerase

selanjutnya dapat melaksanakan fungsinyasecara kontinu.

Pada lagging strand, sebaliknya selalu

dibutuhkan primer baru setiap DNApolymerase menyelesaikan satu fragmenOkazaki.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

24/107

Replikasi DNA

Untuk itu DNA polymerase membutuhkanmekanisme khusus yang memakai enzimDNA primase. DNA primase ini memakairNTP untuk mensintesa rantai pendek RNAprimer pada lagging strand. Pada eukariotaprimer ini kurang lebih panjangnya 10

nukleotida dan dibuat pada interval 100-200nukleotida pada lagging strand

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

25/107

Replikasi DNA

Primer RNA mempunyai basa nukleotida yang dipasangkansecara baik dan mempunyai gugus 3-OH pada ujungnyasehingga dapat diperpanjang oleh DNA polymeraseuntuk membentuk fragmen Okazaki.

Proses pembentukan fragmen Okazaki akan berhenti bilauntai fragmen bertemu dengan primer RNA dari fragmenujung 5. Pada saat itu terdapat proses yang membuangprimer RNA dan menggantinya dengan DNA.

Selanjutnya kedua potongan DNA tadi disatukan denganenzim DNA ligase

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

26/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

27/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

28/107

Replikasi DNA

Kondisi normal DNA double helixharusdibuka untuk replikasi.

Struktur double helix DNA sangat kuat dan

stabil sehingga dibutuhkan suhu mendekatititik didih untuk memisahkan kedua untaiDNA pada tabung reaksi (proses denaturatingPCR!!). Untuk itu diperlukan dua protein,

yaitu DNA helicase dan single-strand DNA-binding protein

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

29/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

30/107

Replikasi DNA

DNA helicase pertama kali diisolasi sebagai protein yangmenghidrolisa ATP bila berikatan dengan DNA untaitunggal. Hidrolisa dari ATP akan merubah bentuk

molekul protein sehingga memungkinkan proteinmelakukan proses mekanik. Helicase menggunakanprinsip ini pada DNA untai tunggal. Bila helicase dalamproses menemukan struktur double helix, prosesmekanik ini akan berlanjut dan memecah struktur helix

tersebut dengan laju sampai 1000 nukleotida per detik

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

31/107

Replikasi DNA

Proses merombak struktur helix inimembutuhkan dua helicase yang bekerjasama (karena kedua untai DNA mempunyaipolaritas yang berbeda, helicase yang bekerja

juga harus berbeda). Pada sel eukariotadijumpai ternyata helicase yang bekerja pada

lagging strand mempunyai peran yangdominan.

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

32/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

33/107

Replikasi DNA

Single-strand DNA-binding protein (SSB) kadang disebutjuga sebagai helix-destabilizing protein, akan mengikatdan memaparkan untai tunggal DNA tanpa menutup

basanya sehingga DNA tadi dapat tetap berfungsisebagai cetakan. Protein ini tidak dapat membukastruktur helix, tetapi berfungsi untuk menstabilkanstruktur untai tunggal hasil kerja helicase. Protein ini jugaberfungsi untuk menstabilkan dan meluruskan regio dari

DNA untai tunggal pada lagging strand sehingga bisadicegah terbentuknya struktur jepit rambut (hair-pin)

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

34/107

7/26/2019 Replikasi Dan Perbaikan DNA

35/107