Laporan Praktikum Biokimia

Percobaan 1Protein: Reaksi Uji terhadap Asam Amino dan Penentuan Kadar Protein Secara Lowry

Nama: Muhamad Gidry AbdurrazakNIM: 11213016Kelompok: 4Tanggal Percobaan: 6 Februari 2015Tanggal Laporan: 20 Februari 2015Asisten: Nurwanti Fatnah / 20514007

LABORATORIUM BIOKIMIAPROGRAM STUDI KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG2015

1. Tujuana. Menentukan keberadaan asam amino tirosin dan triptofan dalam albumin dan gelatin menggunakan uji Millon dan Hopkins Coleb. Menentukan hasil reaksi sistin dengan Pb asetat dan NaOH 1 Nc. Menentukan hasil reaksi sistein dengan reaksi Nitroprussidad. Menentukan hasil uji Millon (endapan) dan Biuret (larutan filtrat) terhadap protein albumin setelah diendapkan dalam garam ammonium sulfat dan didekantasie. Menentukan pengaruh asam kuat (HCl), basa kuat (NaOH), asam lemah (buffer asetat pH 4,7) dan suhu tinggi dalam mendenaturasi proteinf. Menentukan kadar protein sampel dengan metode Lowry

2. Prinsip PercobaanAsam amino adalah molekul organik dengan massa molekul kecil yang mengandung paling sedikit satu gugus karboksil dan satu gugus amino. Berdasarkan sifat rantai sampingnya (rantai R), asam amino dibagi menjadi tujuh kelompok: alifatik, aromatik, hidroksilik, karboksilik, mengandung sulfur (S), imino, amino, dan amida. Rantai samping inilah yang dapat dimanfaatkan dalam analisis kandungan protein melalui berbagai uji, seperti Millon dan Hopkins - Cole.Uji Millon menggunakan reagen yang terdiri dari larutan merkuri dan ion merkuro dalam larutan asam nitrat. Uji Millon adalah uji spesifik untuk tirosin (Milio dan Loffredo, 1995:4). Uji Millon akan menghasilkan warna merah apabila terdapat tirosin dalam protein yang diuji. Warna merah ini adalah garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi.Uji Hopkins Cole menggunakan reagen yang mengandung asam glioksilat (CHO-COOH). Uji ini spesifik untuk asam amino triptofan (Milio dan Loffredo, 1995:4). Triptofan dapat berkondensasi dengan aldehid pada asam glioksilat dalam asam sulfat dan menghasilkan warna Violet.Sistin adalah asam amino yang mengandung sulfur dan terbentuk dari 2 asam amino sistein. Apabila asam amino yang mengandung sulfur bereaksi dengan Pb asetat, akan terbentuk endapan hitam.Reaksi Nitroprussida adalah reaksi yang digunakan untuk menentukan keberadaan asam amino sistein yang mengandung gugus sulfhidril (-SH) (Milio dan Loffredo, 1995:4). Gugus sulfuhidril akan bereaksi dengan nitroprussida dalam suasana ammonia berlebih membentuk kompleks berwarna merah.Protein dapat mengendap akibat mengandung garam-garam anorganik dalam konsentrasi tinggi, seperti ammonium sulfat, magnesium sulfat, dan natrium klorida (Aboazma, 2013:5). Hal ini terjadi karena kemampuan ion garam untuk terhidrasi sehingga berkompetisi dengan molekul protein dalam mengikat air. Dengan demikian, kelarutan protein pun akan berkurang. Namun bila protein diendapkan dengan garam-garam anorganik berikut tanpa perlakuan khusus seperti diaduk dengan magnetic stirrer dengan kecepatan konstan, protein yang ingin diendapkan dapat mengalami denaturasi (Sari, 2012)Protein dapat mengalami kerusakan struktur yang disebut dengan denaturasi. Protein yang terdenaturasi akan kehilangan sifat alaminya, sehingga protein-protein tertentu seperti enzim akan kehilangan fungsinya. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan protein terdenaturasi diantaranya interaksi dengan senyawa asam atau basa, suhu tinggi, dan pelarut organik.Denaturasi dapat diartikan sebagai perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul protein, tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Karena itu denaturasi dapat pula dikatakan sebagai suatu prosesterpecahnya ikatan hydrogen interaksi hidrofobik, ikatan garam,dan terbentuknya lipatan atau wiru molekul (Winarno, 1992; Triyono, 2010:3).

Ada beberapa metode untuk menentukan konsentrasi protein, salah satunya adalah metode Lowry. Metode Lowy pada awalnya hanya menggunakan satu reagen, yakni Folin-Ciocalteu. Namun pada perkembangannya, sensitifitas reagen ini mengalami peningkatan apabila digabungkan dengan reagen Biuret. Setelah protein diberi kedua reagen, absorbansi dari campuran protein-reagen yang sudah diinkubasi supaya bereaksi sempurna dicek pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 700 nanometer.

3. Prosedur Kerja3.1 Uji MillonDua buah tabung reaksi diisi dengan 2% gelatin sebanyak 2 mL pada salah satu tabung, dan larutan albumin putih telur sebanyak 2 mL pada tabung lainnya. Kedua tabung diberi label sesuai larutan yang dikandungnya. Kedua tabung tersebut kemudian ditambahkan tiga tetes reagen Millon, setelah itu dipanaskan dengan cara menempatkan kedua tabung pada gelas kimia berisi air mendidih di atas penangas air. Kemudian hasil reaksi diamati dan dicatat. Larutan yang telah bereaksi dibuang ke dalam wadah berlabelkan Discharded Millons solutions. Kemudian tabung dicuci sampai bersih.

3.2 Uji Hopkins-ColeDua buah reaksi diisi dengan 2% gelatin sebanyak 2 mL pada salah satu tabung, dan larutan albumin putih telur sebanyak 2 mL pada tabung lainnya. Kedua tabung diberi label sesuai larutan yang dikandungnya. Kemudian seteah itu kedua tabung diberi reagen Hpokins Cole sebanyak 2 mL. Kedua tabung kemudian ditambahkan 30 tetes asam sulfat pekat melalui dinding tabung dengan memiringkan tabung dengan sudut 450. Kemudian hasil reaksi diamati dan dicatat. Larutan yang telah bereaksi dibuang ke dalam wadah berlabelkan Discharded Hopkins-Cole solutions. Kemudian tabung dicuci sampai bersih.

3.3 Uji SistinTabung reaksi diisi dengan sedikit sistin, dan dilarutkan dalam 5 mL NaOH 1 N. Larutan tersebut ditambahkan sedikit kristal Pb-asetat. Tabung reaksi tersebut dipanaskan dengan cara menempatkan tabung pada gelas kimia berisikan air yang telah mendidih.

3.4 Uji SisteinTabung reaksi diisi dengan kristal sistein hidroksida dan dilarutkan dalam 5 mL air. Larutan tersebut ditambahkan 0,5 mL larutan nitroprusida 1%, dan 0,5 mL NH4OH.

3.5 Pengendapan GaramSatu tabung reaksi diisi dengan 5 mL larutan albumin telur (1:5) dengan garam amonium sulfat serta aduk larutan hingga garam melarut. Larutan diisi lagi dengan garam amonium sulfat, dan diaduk sampai garam mengendap. Jika garam belum mengendap, ulangi terus langkah sebelumnya. Larutan yang telah jenuh disaring sehingga didapat endapan dan filtrat. Endapan diuji dengan reagen Millon dan filtrat diuji dengan reagen biuret.

3.6 Denaturasi ProteinTiga tabung disiapkan dan diberi nomor 1, 2, dan 3. Ketiga tabung diisi dengan larutan albumin seanyak 9 mL. Tabung 1 ditambahkan 1 mL HCL 0,1 M, tabung 2 ditambahkan NaOH 0,1 M, dan Tabung 3 ditambahkan 1 mL bufer asetat dengan 1 M pH 4,71. Ketiga tabung dipanaskan pada gelas kimia berisi air mendidih diatas penangas air. Hasilnya diamati dan dicatat. Tabung 1 dan 2 ditambahkan 10 mL bufer asetat dengan pH 4,7. Hasil yang didapat diamati dan dicatat.

3.7 Penentuan Kadar Protein Secara LowryTujuh tabung reaksi disiapkan dan diberi label 1, 2, 3, 4, 5, 6, dan 7. Tabung 1 diisi dengan aquades sebanyak 0,5 mL; tabung 2 diisi 0,1 mL larutan BSA standar ditambah aquades sebanyak 0,4 mL; tabung 3 diisi 0,2 mL larutan BSA standar ditambah aquades sebanyak 0,3 mL; tabung 4 diisi 0,3 mL larutan BSA standar ditambah aquades sebanyak 0,2 mL; tabung 5 diisi 0,4 mL larutan BSA standar ditambahkan aquades sebanyak 0,1 mL. Tabung 6 dan 7 diisi 0,5 larutan sampel protein. Seluruh pengisian larutan dilakukan menggunakan pipet berukuran 1 mL. Kemudian seluruh tabung diisi dengan reagen Biuret sebanyak 2 mL. Tiap tabung diinkubasi tepat selama 10 menit dimulai dari penambahan larutan Biuret. Setelah 10 menit, seluruh tabung ditambahkan 0,2 mL reagen Folin-Ciocalteu, dan dikocok menggunakan vortex. Setelah itu seluruh tabung diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 700 nm. Larutan tabung 1 dimasukkan kedalam kuvet untuk kemudian dimasukkan kedalam spektrofotometer. Tombol kalibrasi pada alat spektrofotometer kemudian ditekan agar larutan pada tabung 1 menjadi acuan seluruh tabung (blanko). Pengukuran absorbansi larutan tabung 2 sampai 8 dilakukan dengan cara membilas kuvet terlebih dahulu dengan aquades dan dengan larutan yang akan diukur secara bergantian. Kemudian kuvet dimasukkan larutan yang akan diukur, selanjutnya kuvet dibersihkan dengan tisu di bagian yang tidak boleh dipegang tangan sebelum dimasukkan kedalam spektrofotometer. Pengukuran absorbansi larutan dilakukan satu per satu. Hasil pengukuran dicatat.

4. Data Pengamatan4.1 Uji Kualitatifa. Uji MillonProteinSebelum diberi reagen Millon + pemanasanSetelah diberi reagen Millon + pemanasan

AlbuminPutih keruh

Terbentuk endapan merah

Gelatin 2%Bening

Terbentuk endapan merah

b. Uji Hopkins ColeProteinSebelum diberi reagen Hopkins - Cole + H2SO4 pekatSetelah diberi reagen Hopkins - Cole + H2SO4 pekat

AlbuminPutih keruh

Terbentuk cincin ungu

Gelatin 2%Bening

Bening

c. SistinCampuran yang diujiSebelum dipanaskanSetelah dipanaskan

Sistin + 5 ml NaOH 1 N + Pb - asetatKehitaman

Terdapat endapan hitam

d. SisteinAsam amino yang diujikanSebelum diberi reagen Setelah diberi reagen nitroprussida + NH4OH

Kristal Sistein + 5 mL airBeningTerbentuk warna merah

e. Pengendapan Albumin oleh GaramHasil FiltrasiHasil Pengujian

Uji MillonUji Biuret

EndapanTerdapat warna merah

-

Larutan filtrat-Tidak berubah

f. Denaturasi ProteinTabung (Zat)Karakteristik

Sebelum dipanaskanSetelah dipanaskan ( + ditambahkan buffer asetat pH 4,7 untuk tabung 1 dan 2)

1 (Albumin + HCl 0,1 M)Berwarna putih susu

Terdapat endapan / gumpalan putih

2 (Albumin + NaOH 0,1 M)Berwarna putih susu

Terdapat endapan putih

3 (Albumin + buffer asetat pH 4,7)Berwarna putih susu

Endapan putih

4.2 Uji Kuantitatif dengan Lowrya. Rumus penentuan konsentrasi protein BSA dalam tabung:V1 M1 = V2 M2Keterangan:V1 : Volume BSA stok yang ditambahkan (dalam mL) M1 : Konsentrasi BSA stok yang ditambahkan (dalam g/mL) V2 : Volume larutan pada tabung (dalam mL)M2 : Konsentrasi BSA dalam larutan pada tabung (dalam g/mL)

Untuk tabung 1M2 = 0 (tidak ada BSA yang ditambahkan) Untuk tabung 20,1 x 200 = 0,5 x M2M2 = 40 Untuk tabung 30,2 x 200 = 0,5 x M2M2 = 80 Untuk tabung 40,3 x 200 = 0,5 x M2M2 = 120 Untuk tabung 50,4 x 200 = 0,5 x M2M2 = 160

b. Komposisi Larutan dalam tiap tabung Penambahan (ml)Nomor Tabung

1234567

Standar BSA (g/ml)-0,10,20,30,4--

Sampel protein-----0,50,5

H2O0,50,40,30,20,1--

Reagen Biuret2222222

Reagen Fenol0,20,20,20,20,20,20,2

Absorbansi0,0000,0220,0310,0370,0510,0230,02

c. Kurva Standar BSA (A700 vs Konsentrasi) dan Persamaan Kurva

y = 4,810-3 + 2,92510-4x

d. Konsentrasi Protein Sampel

Absorbansi sampel (ys) = 0,0225

Konsentrasi sampel (xs) :(0,0225) = 4,810-3 + 2,92510-4xs

xs = 60,51 g / mL

5. Pembahasan5.1 Uji Kualitatifa. Uji MillonUji Millon digunakan untuk mendeteksi adanya gugus hidroksi fenolik pada suatu protein. Pereaksi Millon terdiri atas larutan merkuri (Hg) dalam HNO3 atau asam nitrat. Apabila uji Millon positif, akan terbentuk endapan garam merkuri berwarna putih yang bila dipanaskan akan berwarna merah.Apabila uji Millon dilakukan terhadap asam amino tirosin, terbentuk endapan merah kecoklatan setelah dipanaskan. Hal ini dikarenakan gugus fenol pada tirosin bereaksi dengan merkuri dari reagen Millon membentuk kompleks merkuri. Tirosin sendiri merupakan asam amino yang mengandung gugus fenol (Nelson dan Cox, 2008:870). Dengan demikian, protein yang mengandung asam amino tirosin akan menghasilkan hasil positif apabila diuji oleh reagen Millon Adapun struktur dari tirosin ditunjukkan pada Gambar 4.1

Gambar 4.1 Struktur Tirosin

Sedangkan reaksi dari reagen Millon terhadap senyawa yang mengandung gugus fenol ditunjukkan pada Gambar 4.2

Gambar 4.2 Reaksi reagen Millon terhadap senyawa dengan gugus fenol

Gelatin mengandung asam amino yang memiliki gugus fenol, yakni tirosin. Hal ini terbukti karena saat ditambahkan reagen Millon dan dipanaskan gelatin membentuk endapan merah kecoklatan. Menurut Lewis dkk. (1950:27), albumin juga mengandung tirosin sebagai penyusunnya. Dengan demikian hasil uji Millon pada albumin pun akan positif mengandung endapan merah kecokatan.

Gambar 4.3 Kandungan asam amino pada gelatin (dikutip dari www.pbgelatins.com)

b. Uji Hopkins - ColeUji Hopkins-Cole merupakan uji untuk menentukan inti indol pada asam amino. Indol adalah struktur kimia berupa cincin benzen yang terikat pada ikatan C-2 dan C-3 dari pirol (Hart dkk., 2010: 403). Uji Hopkins Cole menggunakan senyawa aldehid seperti asam glioksilat. Reaksi positif adanya inti indol asam amino pada uji Hopkins Cole ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna ungu / violet pada sampel percobaan. Reagen Hopkins-Cole mengkondensasi inti indol dengan asam glioksilat dengan bantuan asam kuat seperti asam sulfat, sehingga terbentuk 2 fasa dengan cincin ungu yang terletak pada permukaan bidang batas kedua fasa tersebut.Asam amino yang memiliki inti indol adalah triptofan. Protein yang mengandung inti indol adalah protein dengan triptofan sebagai salah satu asam amino penyusunnya. Protein dengan karakteristik tersebut akan memberikan hasil positif dengan uji Hopkins Cole. Adapun persamaan reaksi dari uji Hopkins Cole dengan triptofan ditunjukkan dengan Gambar 4.4

Gambar 4.4 Persamaan reaksi uji Hopkins Cole dengan triptofanUji protein albumin dengan Hopkins Cole pada percobaan ini menghasilkan lapisan cincin ungu antara 2 fasa yang terbentuk. Hal ini menunjukkan bahwa albumin mengandung inti indol berupa triptofan. Hal ini sesuai dengan literatur (Lewis dkk., 1950: 27). Uji protein gelatin dengan Hopkins Cole tidak menghasilkan perubahan apapun. Hal ini menunjukkan bahwa gelatin tidak mengandung inti indol seperti pada albumin. Adapun kandungan asam amino gelatin dapat dilihat pada Gambar 4.3.

c. Uji Sulfur pada sistinUji yang dilakukan pada sistin dalam percobaan kali ini adalah uji sulfur. Uji ini dapat dilakukan dengan menambahkan basa kuat yang disusul dengan timbal asetat pada sampel protein. Fungsi basa kuat sendiri adalah untuk melepaskan sulfur yang dikandung protein menjadi ion sulfida. Sedangkan timbal asetat diberikan agar timbal bereaksi dengan ion sulfida. Uji sulfur positif apabila terbentuk endapat timbal sulfida (PbS) yang berwarna kehitaman. Sistin sendiri sebenarnya terbentuk dari 2 molekul asam amino sistein dengan reaksi jembatan disulfida.

Uji sulfur yang dilakukan pada sistin dalam percobaan kali ini menghasilkan warna kehitaman dan endapan berwarna kehitaman setelah dipanaskan. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa sistin memang mengandung sulfur (Butz dan du Vigneaud, 1932: 136). Sistin sendiri terbentuk dari dua molekul asam amino sistein yang terhubung dengan jembatan disulfida.

Gambar 4.5 Reaksi pembentukan sistin dari 2 molekul sistein

d. Uji Nitroprussida pada sisteinUji yang dilakukan pada sistein dalam percobaan kali ini adalah uji Nitroprussida dengan reagen nitroprussida 1 % dan NH4OH. Fungsi dari NH4OH adalah sumber NH4+ sebagai kation untuk kompleks merah yang akan terbentuk menggantikan ion natrium dari reagen nitroprussida. Ion nitroprussida sendiri akan berikatan pada asam amino yang mengandung gugus sulfhidril dengan mensubstitusi hidrogen pada gugus sulfhidril tersebut. Reaksi nitroprussida secara umum dapat dituliskan seperti pada Gambar 4.6

[Fe3+(CN)5NO]2- + NH3 + RSH NH4+ + [Fe2+ (CN3NOSR]2 Warna salmon Warna merahGambar 4.6 Reaksi Nitroprussida

Reaksi Nitroprussida yang dilakukan pada sistein yang dilakukan pada percobaan kali ini menghasilkan warna merah. Hal ini sesuai dengan literatur yang menunjukkan kalau sistein memang memiliki gugus sulfhidril bebas (Junaidi, 2008). Adapun struktur kimia dari sistein dapat dilihat di Gambar 4.5 sebelumnya.

e. Pengendapan albumin oleh garamPercobaan pengendapan protein albumin oleh garam pada praktikum ini menggunakan garam ammonium sulfat. Garam ammonium sulfat sendiri merupakan garam anorganik dengan kelarutan yang tinggi, kekuatan ionik besar, namun tidak menyebabkan denaturasi ireversibel pada protein seperti garam-garam logam berat. Penjenuhan larutan protein albumin dengan penambahan ammonium sulfat pada percobaan ini menyebabkan pengendapan protein albumin. Hal ini disebabkan oleh persaingan antara protein albumin dan ammonium sulfat dalam berikatan dengan molekul air. Persaingan dengan garam ammonium sulfat ini akan membuat kelarutan protein makin berkurang (mengalami dehidrasi). Sebagai akibatnya, interaksi antarmolekul protein menjadi lebih kuat daripada interaksi antara pelarut (air) dan zat terlarut (protein albumin). Hal ini menyebabkan molekul-molekul protein mengental dengan membentuk interaksi hidrofobik antara satu dengan lainnya (salting-out). Interaksi ini ini terjadi secara maksimal apabila protein berada pada titik isoelektriknya. Menurut Triyono (2010: 5), Pada titik isoelektrik protein akan berikatan antara muatannya sendiri membentuk lipatan ke dalam sehingga terjadi pengendapan yang relatif cepat. Kemudian setelah larutan didekantasi, endapan diuji menggunakan reagen Millon. Uji Millon pada endapan memberikan hasil positif dengan terbentuknya warna merah pada endapan setelah ditambah reagen Millon. Dengan demikian, terbukti bahwa endapan tersebut adalah protein albumin. Hal ini didasarkan pada hasil percobaan uji Millon yang dilakukan sebelumnya yang menyatakan bahwa albumin akan menghasilkan uji positif bila diberikan reagen Millon.Larutan filtrat hasil dekantasi kemudian diuji dengan reagen biuret. Uji biuret sendiri merupakan uji protein untuk mengetahui keberadaan ikatan peptida pada protein. Uji biuret menggunakan NaOH dan CuSO4 sebagai reagen. Uji biuret akan positif apabila larutan jadi berwarna ungu akibat senyawa kompleks yang dibentuk oleh Cu2+ pada reagen biuret. Hasil uji biuret terhadap larutan filtrat adalah negatif. Hal ini dimungkinkan terjadi apabila tidak ada protein pada larutan filtrat, karena ikatan peptida terdapat pada semua protein (Hart, 2010: 505). Kesimpulan yang dapat ditarik adalah seluruh protein albumin mengendap dan tersaring pada proses dekantasi. Hal ini dimungkinkan terjadi apabila larutan sudah sangat jenuh dengan penambahan ammonium sulfat sehingga seluruh albumin mengendap.

f. Denaturasi ProteinPercobaan denaturasi protein ini menggunakan penambahan asam kuat HCl 0,1 M, basa kuat NaOH 0,1 M, dan asam lemah buffer asetat dengan pH 4,7 1 M pada 3 tabung berbeda yang diisi oleh protein albumin. Selain itu digunakan juga pemanasan. Pada tabung reaksi yang berisi albumin dan ditambah HCl, larutan berubah warna menjadi putih susu. Hal yang yang sama juga terjadi pada tabung berisi protein yang ditambahkan dengan NaOH 0,1 M dan buffer asetat pH 4,7. Ketiganya menunjukkan peristiwa yang mirip, yakni denaturasi protein.Pada tabung dengan penambahan HCl yang terjadi adalah denaturasi protein akibat terputusnya ikatan elektrostatik pada jembatan garam yang membentuk struktur tersier albumin. Ion H+ dari HCl akan bereaksi dengan gugus -COO- pada salah satu asam amino penyokong jembatan garam dan ion klor akan menyerang gugus -NH3+ pada asam amino satunya. Hal inilah yang menyebabkan ikatan jembatan garam pada protein putus dan merusak struktur tersier protein. Adapun reaksi pemutusan jembatan garam protein oleh HCl diilustrasikan pada Gambar 4.7

Gambar 4.7 Reaksi pemutusan jembatan garam protein oleh HCl

Pada tabung dengan penambahan NaOH yang terjadi kurang lebih mirip dengan denaturasi protein yang disebabkan HCl, yakni dengan terputusnya jembatan garam. Perbedaannya adalah ion OH- dari NaOH akan bereaksi dengan gugus -NH3+ pada salah satu asam amino penyokong jembatan garam dan ion Na akan menyerang gugus -COO- pada asam amino satunya.

Pada tabung dengan penambahan buffer asetat pH 4,7 yang terjadi mirip dengan denaturasi protein pada tabung dengan penambahan HCl. Ion H+ menyerang gugus -COO- pada satu asam amino penyokong jembatan garam dan ion CH3COO- menyerang gugus -NH3+ Hanya saja karena buffer asetat merupakan asam lemah, maka buffer asetat hanya terionisasi sebagian. Sehingga perusakan jembatan garam yang dilakukan oleh buffer asetat tidak sebanyak HCl. Hal ini memungkinkan keberadaan protein albumin yang belum terdenaturasi menjadi lebih besar.

Langkah selanjutnya adalah memanaskan tabung berisi protein yang sudah diberi asam kuat, basa kuat maupun buffer asetat dengan pH 4,7 di penangas air. Setelah 15 menit, ketiga tabung didinginkan pada suhu ruang. Pemanasan sendiri dilakukan untuk mempercepat denaturasi. Hal ini dimungkinkan terjadi karena panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar dengan cara menaikkan energi kinetik molekul penyusun protein. Akibatnya, molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Selain itu, pemanasan juga dilakukan untuk memicu koagulasi. Protein yang dipanaskan pada suhu 50 0C dapat mengalami koagulasi (Ningtyas:2012).

Koagulasi adalah suatu keadaan dimana protein tidak lagi terdispersi sebagai suatu koloid karena unit ikatan yang terbentuk cukup banyak. Koagulasi dapat juga diartikan sebagai salah satu kerusakan protein yang terjadi akibat pemanasan dan terjadi penggumpalan serta pengerasan pada protein karena menyerap air pada proses tersebut (Makfoeld,2008; Ningtyas, 2012)

Pada pemanasan kepada ketiga tabung setelah ditambahkan masing masing pereaksi, hanya tabung yang diberi buffer asetat pH 4,7 1 M yang mengalami koagulasi ketika sudah didinginkan pada suhu kamar. Sedangkan pada tabung yang ditambahkan HCl dan NaOH harus ditambahkan buffer asetat pH 4,7 1 M sebanyak 10 mL baru terkoagulasi. Hal ini disebabkan karena titik isoelektrik albumin sama dengan pH buffer asetat yang digunakan, yakni 4,7. Titik isoelektrik protein adalah pH dimana muatan total protein akibat penambahan proton atau kehilangan muatan oleh reaksi asam-basa. Koagulasi hanya terjadi ketika protein berada di titik isoelektriknya, sedangkan pada suhu diatas 50 0C pun protein masih dapat larut pada pH di titik luar isoelektrik tersebut (Purwaningsih,2007; Ningtyas:2012). Larutan buffer asetat pH 4,7 1 M dalam jumlah relatif banyak pun harus ditambahkan supaya albumin dapat terkoagulasi pula pada tabung yang ditambah HCl dan NaOH. Tujuan penambahan buffer tersebut adalah mengubah suasana pH yang tadinya sangat asam / basa supaya mendekati titik isoelektrik albumin.

5.2 Uji Kuantitatif dengan LowryMetode Lowry merupakan metode penentuan kadar protein pada suatu sampel reagen Folin-Ciocalteu. Sampel yang mengandung asam amino tirosin dan triptofan akan menghasilkan warna biru yang muncul akibat tungsten dan molibdenum yang muncul sebagai hasil reduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat pada reagen Folin Ciocalteu ketika ditambahkan reagen tersebut. Metode Lowry ini pun dilengkapi dengan penggunaan reagen biuret untuk meningkatkan reduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat. Penambahan ini akan meningkatkan sensitifitas terhadap spektrofotometer. Absorbansi dari warna-warna yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 700 nm. Metode ini sensitif untuk protein konsentrasi rendah bila dibandingkan dengan metode biuret semata (Soeharsono, 2006).Percobaan penentuan kadar protein dengan metode Lowry ini dimulai denga mempersiapkan larutan standar dengan konsentrasi yang naik secara berurutan dan dengan rentang yang sempit pada beberapa tabung. Pengaturan konsentrasi ini dapat dilakukan dengan mengencerkan larutan stok berkonsentrasi awal relatif besar dibanding yang diinginkan menggunakan air sesuai konsentrasi protein standar yang diinginkan pada tiap tabung. Tabung yang hanya berisi air dan protein sampel pun disiapkan. Setiap tabung dikondisikan supaya memiliki volume larutan yang sama. Kemudian saat ditambahkan reagen biuret, waktu inkubasi tiap sangat diperhatikan agar tepat 10 menit dengan suhu kamar. Hal ini dilakukan untuk memastikan larutan protein yang ditambahkan reagen biuret benar-benar homogen. Setelah itu baru ditambahkan reagen Folin Ciocalteu. Setelah penambahan reagen ini pun tiap tabung diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dengan alasan yang sama dengan inkubasi setelah penambahan biuret. Setelah melalui prosedur tersebut masing-masing tabung dicek absorbansinya.Setelah dapat data absorbansi, dibuatlah kurva konsentrasi protein standar terhadap absorbansi (absis (x): konsentrasi, ordinat (y): absorbansi). Setelah kurva terbentuk, didapatlah persamaan kurva konsentrasi terhadap absorbansi. Dengan memasukkan nilai absorbansi protein sampel sebagai nilai ordinat, nilai konsentrasi protein sampel pun bisa didapat. Protein sampel yang didapat memiliki absorbansi 0,0225. Dengan persamaan kurva yang didapat: y = 4,810-3 + 2,92510-4x, didapatkan bahwa konsentrasi protein sampel adalah 60,51 g / mL. 6. Kesimpulana. Dalam albumin dan gelatin, terdapat asam amino tirosin yang mengandung gugus fenol. Hal ini dapat dibuktikan dengan hasil uji Millon yang positif untuk kedua protein tersebutb. Hasil reaksi sistin dengan NaOH 1 N dan Pb-Asetat adalah terbentuknya endapan kelabu Pb-S akibat putusnya ikatan sulfida pada protein. Putusnya ikatan sulfida ini disebabkan oleh NaOH 1 Nc. Hasil reaksi Nitroprussida pada sistein adalah terbentuknya warna merah. Warna merah ini disebabkan oleh natrium nitroprussida yang bereaksi dengan gugus SH pada sisteind. Hasil Uji Millon pada endapan yang berhasil disaring dari larutan albumin telur yang diberi garam ammonium sulfat sampai jenuh adalah positif. Adapun hasil uji biuret pada larutan filtratnya adalah negatif. Hasil ini menunjukkan bahwa protein telah mengendap seluruhnyae. Hasil percobaan menunjukkan bahwa asam kuat (HCl) , basa kuat (NaOH), dan asam lemah (buffer asetat pH 4,7) dapat mendenaturasi protein. Selain itu pemanasan pada protein dapat menyebabkan terjadinya koagulasi.f. Dari hasil perhitungan dengan persamaan kurva standar, didapatkan konsentrasi protein sampel sebesar 60,51 g / mL

7. Daftar PustakaAboazma, M. Souad.2013.Protein Chemistry [Power Point Slides].Tersedia: http://www1.mans.edu.eg/FacMed/english/dept/biochemistry/pdf/PROTEIN.pdf (4 Februari 2015)Butz, Lewis W. dan Vincent du Vigneaud.1932.The Formation of a Homologue of Cystine by the Decomposition of Methionine with Sulfuric Acid. Journal of Biological Chemistry vol 135 (42).Hart, David J. dkk.2010. Organic Chemistry: a Short Course. Belmont: Brooks/Cole Cengage Learning.Junaidi, Eka.2008.Pengaruh Suhu, Ion Klorida dan Ion Sulfida pada Korosi Cu-37Zn dalam Medium Netral [online]. Tesis Mahasiswa di Digital Library Institut Teknologi Bandung. Tersedia: http://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/ (19 Februari 2015 Lewis, J. C. dkk.1950.Amino Acid Composition of Egg Proteins. Journal of Biological Chemistry vol. 23 (35).Milio, Frank R. Dan William M. Loffredo.1995.Qualitative Testing for Amino Acid and Proteins.Pennsylvania: Chemical Education Resources .IncNelson, David L. dan Michael M. Cox.2008. Lehninger: Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman Company.Ningtyas, Jumiati.2012. Denaturasi, Koagulasi dan proses Browning Non Enzimatis [makalah online].Tersedia:http://www.academia.edu/8728268/Denaturasi_Koagulasi_dan_proses_Browning_Non (19 Fbruari 2015)Sari, Diah Kartika.2012. Lipase Isolat Lokal pada Sintesis Biodiesel [online].Tersedia: http://eprints.unsri.ac.id/195/3/makalah_DiahkartikaUnsri.pdf (11 Februari2015)Soeharsono. 2006. Biokimia. Yogyakarta: Gadjah Mada UniversityTriyono, Agus.2010. Mempelajari Pengaruh Penambahan Beberapa Asam padaProses Isolasi Protein terhadap Tepung Protein IsolatKacang Hijau (Phaseolus radiatus L.) [online]. Makalah pada Seminar Rekayasa Kimia dan Proses Universitas Diponegoro Semarang. Tersedia: http://eprints.undip.ac.id/27996/1/C-10.pdf (19 Februari 2015)

Lampiran: Soal dan Jawaban

Soal Uji MillonApa yang terjadi jika garam merkuri ditambahkan ke dalam protein? Mengapa larutan albumin terkoagulasi? Larutan protein dengan karakterisasi apa yang akan memberikan uji negatif? Mengapa?Jawab:Apabila garam merkuri ditambahkan ke dalam protein, yang akan terjadi adalah protein akan terdenaturasi. Karena larutan garam merkuri yang ionik akan merusak jembatan garam pada protein. Ion merkuri yang bermuatan positif dan pasangannya yang bermuatan negatif (seperti nitrat) akan bertukar pasangan ion dengan ion positif dan negatif pada jembatan garam protein. Selain itu garam merkuri sebagai salah satu garam logam berat juga mampu merusak ikatan sulfida. Pada umumnya, protein yang ditambahkan garam merkuri akan menghasilkan garam merkuri-protein yang tidak larut (mengendap) berwarna putih yang bila dipanaskan akan berwarna merah apabila protein mengandung asam amino tirosin. Albumin terkoagulasi karena pada uji Millon ini larutan yang telah ditambahkan reagen harus dipanaskan di penangas air dengan air mendidih (>100 0C). Larutan albumin yang berada pada suhu 50 0C ke atas akan mengalami koagulasi.Karakteristik larutan protein yang memberi uji negatif pada Millon adalah protein-protein yang tidak mengandung asam amino tirosin sebagai penyusunnya. Karena hanyatirosinlah asam amino yang mengandunggugus fenol. Sedangkan warna merah pada uji Millon yang positif merupakan konsekuensi dari gugus fenol yang bereaksi dengan ion merkuri.

Soal Uji Hopkins ColeAsam amino apakah yang tidak memberikan uji positif dan mengapa?Jawab:Asam amino yang tidak memberikan uji positif pada uji Hopkins Cole adalah semua asam amino kecuali triptofan. Karena hanya triptofanlah asam amino yang mengandung gugus indol pada rantai sampingnya. Adapun cincin ungu dari uji Hopkins Cole merupakan konsekuensi dari kondensasi inti indol oleh asam glioksilat dibantu dengan asam kuat

Soal Reaksi SistinApa warna endapan? Senyawa apa yang mengedap?Jawab:Warna endapan adalah hitam. Endapan tersebut merupakan endapan Timbal (II) sulfida atau PbS

Soal Nitroprussida1. Apakah warna hasil percobaan? Apakah warna tersebut stabil?2. Apakah sistin akan memberikan uji positif? Mengapa?3. Gugus apa dari sistein yang memberikan hasil positif dengan nitroprussida?

Jawab:1. Hasil percobaan menghasilkan warna merah yang tidak stabil. Warna tersebut tidak stabil karena ketika diberikan amonium sulfat, warna larutan menjadi ungu dan kemudian menjadi merah yang apabila didiamkan lebih lama lagi akan menjadi kuning.2. Positif. Karena nitroprussida bereaksi dengan gugus sulfhidril pada sistein dalam ammonia. Hasil positif akan ditunjukkan oleh perubahan menjadi warna merah yang berasal dari reaksi gugus SH pada sistein dengan nitroprussida dalam amoniak.3. Gugus sulfhidril.

Soal Pengendapan dengan GaramTerangkan hasil yang diperoleh!

Jawab:Hasil penyaringan albumin yang diendapkan dengan garam ammonium sulfat diuji dengan reagen Millon. Hasil dari uji tersebut adalah positif karena mengandung endapan merah bata. Dengan demikian, hasil penyaringan tersebut terbukti merupakan albumin (karena albumin mengandung tirosin)

Uji Biuret dilakukan pada larutan filtrat albumin yang diendapkan dengan garam ammonium sulfat. Hasilnya adalah negatif karena protein albumin telah mengendap sempurna.

Soal Denaturasi Protein1. Sifat fisik protein apakah yang mempengaruhi kelarutan pada protein pada percobaan ini?2. Perubahan sifat kimia apakah yang berhubungan dengan denaturasi telur?

Jawab:1. Sifat fisik yang mempengaruhi kelarutan protein adalah titik isoelektriknya. Pada titik ini protein mencapai titik kelarutan terendah, sehingga dapat terendapkan atau terkoagulasi2. Perubahan sifat kimiawi yang berhubungan dengan denaturasi telur adalah ikatan kimia pada struktur protein. Ikatan kimia yang tadinya membentuk struktur sekunder sampai kuartener seperti ikatan sulfida, ikatan hidrogen, jembatan garam dan ikatan hidrofobik akan putus akibat denaturasi protein

Soal Lowry1. Buatlah kurva standar (A700nm vs ug protein) dan tentukan konsentrasi protein suatu larutan yang diberikan!2. Apa kebaikan dan kelemahan metode Lowry ini?3. Berikan sedikitnya dua metode lain (secara spektofotometri) yang biasa digunakan untuk menetukan konsentrasi protein selain metode Lowry. Berikan penjelasan mengenai metode-metode tersebut berikut kelebihan dan kekuranganya dibandingkan dengan metode Lowry!

Jawab :1.

kurva standar (A700nm vs ug protein)Persamaan kurva: y = 4,810-3 + 2,92510-4xAbsorbansi sampel (ys) = 0,0225

Konsentrasi sampel (xs) :(0,0225) = 4,810-3 + 2,92510-4xs

xs = 60,51 g / mL

2. Kelebihan: Lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret Memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar sampai pada konsentrasi 0.01 mg/mL.

Kelemahan: Lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.

3. Metode Lain:a) Metode Dumas

Prinsip UmumSampel dengan massa tertentu dipanaskan dalam tangas pada suhu tinggi (sekitar 900 C)dengan adanya oksigen. Cara ini akan melepaskan C O3. H3O dan Ng. Gas C 03 dan H3Odipisahkan dengan melewatkan gas pada kolom khusus untuk menyerapnya. Kandungannitrogen kemudian dihitung dengan melewatkan sisa gas melalui kolom dengan detektorkonduktivitas termal pada ujungnya. Kolom ini akan membantu memisahkan nitrogen darisisa C O3 dan H3O. Alat dikalibrasi dengan senyawa analis yang murni dan telah diketahuijumlah nitrogennya. seperti EDTA (= 9.59 % N). Dengan demikian sinyal dari detektor dapatdikonversi menjadi kadar nitrogen. Dengan metode Kjeldahl diperlukan konversi nitrogendalam sampel menjadi kadar protein. tergantung susunan asam amino protein.

Keuntungano Jauh lebih cepat dari pada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per pengukuran. dibandingkan dengan 1-2 jam pada Kjeldahl).0 Metode ini tidak menggunakan senyawa kimia atau katalis toksik.0 Banyak sampel dapat diukur secara otomatis.o Mudah digunakan.

Kerugian0 Mahal.0 Tidak memberikan ukuran protein sesungguhnya. karena tidak semua nitrogen dalammakanan berasal dari protein.o Protein yang berbeda membutuhkan faktor koreksi yang berbeda karena susunan asamamino yang berbeda.0 Ukuran sampel yang kecil menyulitkan mendapatkan sampel yang representatif.

2. 2 Pengukuran langsung pada 280 nm.

Prinsip UmumTryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya uV pada 280 mn. Kandungan tryptophandan tyrosine berbagai protein umunmya konstan sehingga serapan larutan protein pada 280nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya.

KeuntunganSederhana untuk dilakukan, non-destruktif, dan tidak dibutuhkan reagen khusus.

KerugianAsam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm, sehingga mengganggu pengukuran protein jika ada dalam kadar yang bermakna.