1.1 PENDAHULUAN

Produk biologi sangat penting untuk banyak aplikasi termasuk biotransformasi, diagnostik,

penelitian dan pengembangan, dan dalam makanan, farmasi, dan industri kosmetik. Untuk

aplikasi tertentu, produk biologi dapat digunakan sebagai ekstrak kasar dengan pemurnian

sedikit atau tidak ada. Namun, biasanya biopharmaceuticals membutuhkan kemurnian yang

tinggi, membuat pengolahan hilir merupakan komponen penting dari proses keseluruhan. Dari

sudut pandang peraturan, proses produksi sendiri mendefinisikan produk biofarmasi definisi

render yang tepat yang efektif dan pengolahan hilir efisien langkah awal penting dalam proses

pembangunan. Saat ini, protein adalah biopharmaceuticals paling penting. Sejarah

perkembangan mereka sebagai produk industri akan kembali lebih dari setengah abad. Darah

fraksinasi plasma adalah skala pertama biofarmasi industri dengan produksi tahunan saat ini di

100 - skala ton [1, 2]. Pengendapan dengan pelarut organik telah dan terus menjadi alat

pemurnian utama dalam plasma fraksinasi, meskipun, baru-baru ini, proses pemisahan

kromatografi juga telah telah diintegrasikan ke dalam industri ini. Anti - racun dan anti antibodi

lainnya – racun diambil dari sumber hewani adalah contoh tambahan biopharmaceuticals awal,

juga dimurnikan dengan kombinasi presipitasi, filtrasi dan kromatografi. Sebaliknya, saat ini

hampir seluruh biopharmaceuticals secara eksklusif diproduksi oleh teknologi rekombinan

DNA. Kromatografi dan filtrasi membran yang berfungsi sebagai alat utama untuk pemurnian

dalam produk ini.

Gambar 1.1 menunjukkan bahwa pada tahun 2006 terdapat berbagai biopharmaceuticals.

Sekitar satu - ketiga adalah antibodi atau fragmen antibodi [3], hampir 20% adalah

erythropoietins, dan 14% adalah insulin. Sisanya adalah enzim, faktor pertumbuhan dan sitokin

[3]. Meskipun banyak non - protein biomolekul seperti plasmid, virus atau polisakarida yang

kompleks saat ini sedang dikembangkan, ada kemungkinan bahwa protein akan terus

mendominasi sebagai biopharmaceuticals. Protein ditoleransi dengan baik, dapat menjadi

sangat kuat, dan sering dimiliki setengah kehidupan yang panjang setelah administrasi,

membuat mereka menjadi yang efektif. Beberapa sifat ini juga membuat protein yang

berpotensi berguna dalam kosmetik, meskipun aplikasi di bidang ini yang rumit dalam sebagian

oleh AS dan kerangka hukum Eropa yang tidak memungkinkan penggunaan senyawa

farmakologis aktif dalam kosmetik. Saat ini hanya sedikit protein yang digunakan di daerah ini.

Yang paling menonjol adalah toksin botulinum, Botox ®, digunakan untuk perawatan kulit [4].

1

Ini dan yang sejenis senyawa yang secara eksklusif dikelola oleh dokter dan dengan demikian

tidak dianggap sebagai kosmetik.

Gambar 1.1 Biopharmaceuticals pada tahun 2006. Sekitar 160 protein terapi telah

mendapatkan persetujuan di Amerika Serikat dan Uni Eropa. Data dari La Merie Business

Intelligence (www.lamerie.com).

1.2 Bioproduk dan kontaminasinya

Bab ini memberikan gambaran tentang kimia dan sifat biofisik protein dan kontaminan

utamanya seperti DNA dan endotoksin. Penjelasan rinci tentang kimia protein dan DNA berada

di luar cakupan ini .

1.2.1 Biomolekul: kimia dan strukturnya

1.2.1.1 Protein

Protein merupakan biopolimer amfoter kelas besar dengan massa molekul mulai dari 5

sampai 20 000 kDa, yang didasarkan pada asam amino sebagai blok-blok bangunan. Ada variasi

besar dalam struktur dan sifat dalam kelas ini. Insulin, misalnya, peptida dengan massa molekul

5808 Da, memiliki struktur yang relatif sederhana dan jelas. Di sisi lain, glikoprotein multimerik

besar dengan massa molekul 20000 kDa, memiliki struktur yang sangat kompleks yang terdiri

dari hingga 80 subunit, yang masing-masing 250 kDa massa. Kebanyakan protein memiliki

massa molekul yang baik, biasanya antara 15 dan 200 kDa. Protein umumnya adalah molekul

2

yang lebih kompak, namun cukup fleksibel untuk mengalami perubahan konformasi substansial

dalam lingkungan yang berbeda, di interfase, setelah mengikat substrat atau setelah adsorpsi

pada permukaan.

Protein adalah molekul-molekul yang sangat terstruktur dan struktur nya umumnya

berkaitan dengan fungsi biologisnya. Struktur ini dibagi menjadi empat tingkatan yang berbeda:

primer, sekunder, tersier, dan kuarterner. Struktur primer ditentukan oleh urutan asam amino,

struktur sekunder oleh lipatan rantai polipeptida dan struktur tersier didefinisikan oleh

gabungan beberapa domain struktur sekunder. Yang terakhir, struktur kuaterner didefinisikan

oleh gabungan beberapa rantai polipeptida yang terlipat. Hasil akhir adalah supra struktur tiga

– dimensi yang kompleks yang dihubungkan oleh berbagai interaksi intra- dan antarmolekul.

Seringkali unsur non - asam amino dimasukkan ke dalam protein.

Struktur Primer: Blok-blok bangunan protein adalah asam amino. Selama biosintesis,

mengikuti transkripsi dan translasi, molekul-molekul ini dihubungkan bersama-sama melalui

ikatan peptida untuk membentuk rantai polipeptida dalam urutan yang unik yang ditentukan

oleh kode genetik. Struktur umum asam amino dan pembentukan ikatan peptida ditunjukkan

pada Gambar 1.2.

Urutan asam amino yang diatur dalam rantai polipeptida disebut protein 'primer

struktur’. Perhatikan bahwa meskipun asam amino merupakan molekul kiral dengan L - dan D -

isomer, hanya L-isomer yang ditemukan dalam protein alami. 20 asam amino alami ditemukan

dalam protein tercantum dalam Tabel 1.1 . Pada protein yang khas, rata-rata massa molekul

komponen asam amino adalah 109 Da. Dengan demikian, perkiraan massa molekul protein

dapat dengan mudah diperkirakan dari jumlah asam amino dalam rantai polipeptida

Ikatan peptida terbentuk ketika asam amino yang dihubungkan bersama-sama memiliki

karakter ikatan ganda parsial. Struktur ini membatasi rotasi dalam rantai peptida yang

mungkin membuat rotasi bebas hanya dalam dua dari tiga obligasi. Sebagai akibatnya, struktur

unik yang terbentuk tergantung pada urutan tertentu dari asam amino. Konformasi tertentu

3

tidak diperbolehkan karena rotasi terbatas, sementara yang lain secara aktif diperkenankan

karena untuk pembentukan ikatan hidrogen dan interaksi intramolekul lainnya. Rantai

samping asam amino dapat bermuatan, polar, atau hidrofobik (lihat Tabel 1.1), sehingga

menentukan sifat biofisik protein.

4

Kelompok-kelompok bermuatan adalah asam dan basa mempunyai kekuatan atau

pKa yang berbeda-beda.Dengan demikian, kelompok-kelompok ini akan menentukan muatan

protein rantai samping hidrofobik, di sisi lain,juga menentukan karakter hidrofobik struktur

utama, yang memainkan peran penting dalam menentukan pola lipat dari rantai polipeptida.

Asam amino sistein dan prolin memainkan peran tertentu. Molekul sistein bebas dapat

menjalani reaksi oksidasi untuk membentuk ikatan disulfi atau jembatan yang menghasilkan

sistin seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.3.

5

Ketika sistein membentuk bagian dari sebuah rantai polipeptida, jembatan ini bisa sebaga

intramolekul (dalam rantai polipeptida yang sama) atau antarmolekul untuk menghubungkan

rantai polipeptida yang berbeda. Di satu sisi, jembatan ini berkontribusi pada stabilisasi

struktur protein dan jembatan lainnya dapat membantu untuk membentuk formasi struktur

protein multimeric ikatan secara kovalen.

Pembentukan jembatan disulfida umumnya reversibel. Ikatan -ikatan yang terbentuk pada

keadaan oksidasi bisa dirusak dengan kondisi reduksi sehingga terjadi destabilisasi struktur

lipatan protein dan pembentukan asosiasi pengganggu. Sifat ini digunakan, misalnya,dalam

metode analisis pemisahan resolusi tinggi seperti elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS -

PAGE) yang sering dilakukan di bawah kondisi reduksi.

Prolin juga memainkan peran khusus dalam struktur protein yang terdefinisi. Prolin adalah

suatu asam imino siklik dan bisa dalam bentuk cis dan trans. Pada gilirannya, bentuk-bentuk

ini menularkan konformasi dari rantai polipeptida. Dalam penyelesaiannya, bentuk isomerik

ini berada dalam kesetimbangan. Namun, dalam polipeptida, yang interkonversi dari bentuk

isomerik ini sering lambat dan dapat menjadi langkah yang membatasi tingkat pembentukan

struktur protein terlipat.

Struktur Sekunder

Rantai polipeptida ditemukan dalam protein tidak untuk membentuk knot atau cincin dan

bukan merupakan β bercabang. Namun, rantai ini dapat membentuk α heliks,lembar-lembar β

, dan loop-loop yang mendefinisikan struktur sekunder protein.

α - heliks terdiri dari susunan spiral rantai polipeptida yang terdiri dari 3,6 residu asam

amino per giliran. Helix distabilkan oleh ikatan hidrogen intramolekul dan hidrofobik,

amphipathic atau hidrofilik, tergantung pada urutan tertentu asam amino dalam struktur

primer. Contoh heliks tersebut diberikan pada Gambar 1.4.

6

Dalam setiap kasus karakter α - helix dapat diprediksi dengan menempatkan

masing-masing residu asam amino dalam sebuah spiral pada interval 100 derajat sehingga

akan ada 3,6 residu per giliran. Seperti yang terlihat pada Gambar 1.4, untuk sintase sitrat,

residu hidrofobik dominan dan terdistribusi secara merata sehingga -helixα tersebut akan

menjadi hidrofobik. Dalam kasus terakhir, troponin C, residu yang bermuatan tidak hanya

dominan tetapi juga merata sehingga dihasilkan helix yang akan menjadi hidrofilik.

Sehingga, pada residu alkohol hidrofobik dehidrogenase bermuatan didistribusikan secara

tidak merata yang menghasilkan helix amphipathic yang salah satu sisinya hidrofilik dan

hidrofobik di sisi lain.

Lembar β adalah elemen struktur sekunder yang sangat stabil yang juga terjadi

sebagai akibat dari ikatan hidrogen. Meskipun satu ikatan hidrogen membentuk suatu

energi bebas dari ikatan ( Δ G) hanya sekitar 1 kJ mol-1, sejumlah besar dari ikatan tersebut

di lembar β membuat nya sangat stabil. Lembaran β memiliki struktur planar, yang bisa

paralel, anti - paralel, atau campuran tergantung pada keselarasan arah dari rantai

polipeptida yang membentuk struktur. Pembentukan lembaran β sering diamati selama

proses agregasi protein yang ireversibel. Karena adanya kekuatan antarmolekul yang kuat

dalam struktur ini, agen pendenaturasi yang kuat diperlukan untuk mengganggu hasil

agregat. Urea, pemutus ikatan hidrogen yang kuat, dapat digunakan untuk tujuan ini.

Namun, konsentrasi urea yang tinggi dibutuhkan untuk mengganggu ikatan hidrogen yang

akan mengakibatkan destabilisasi lengkap dan berlangsung pada seluruh

struktur protein.Protein amiloid dan serat mengandung sejumlah besar lembar β- yang

menjelaskan sebagian sifat-sifat kelas protein agregasi .

7

Loops adalah bagian protein yang sangat flexibel dan sering terhubung elemen

struktrur sekunder lain dengan satu sama lain. Sebagai contoh, loop sering menghubungkan

bagian dari rantai polipeptida yang membentuk anti - daerah paralel lembaran atauβ

membentuk hubungan antara berbagai α heliks dan domain lembar β. Beberapa. Loops

juga memainkan peran penting dalam fusi artifisial protein yang berbeda seperti dalam

kasus antibodi rantai tunggal. Antibodi artifisial ini dihubungkan dengan loop yang

mengkontribusi secara signifikan untuk stabilitas protein.

Jumlah relatif dari elemen struktur sekunder yang ada dalam sebuah kaleng protein

dapat diukur dengan metode spektroskopi antara lain circular dichroism (CD) dan

spektroskopi infra merah. Pada panjang gelombang tertentu perbedaan antara

absorbansi kiri sirkuler terpolarisasi (AL) dan absorbansi kanan sirkuler terpolarisasi (AR)

cahaya adalah :

AΔ = Al- Ar

Scan panjang gelombang yang digunakan untuk menampilkan isi dari struktur sekunder

dari protein dan merupakan ukuran penting dari integritas. Hal ini sering digunakan untuk

konfirmasi struktur asli protein (Gambar 1.6).

(ATR FT - IR) spektroskopi juga digunakan untuk mempelajari perubahan konformasi 3D -

struktur protein dalam situ. Perubahan pada elemen struktur sekunder dapat dinilai

8

dengan ATR FT – IR bahkan dalam suspensi dan larutan keruh. amida I di wilayah spektral

1600-1700 cm - 1 digunakan untuk mengevaluasi perubahan struktural .

Struktur tersier

Struktur tersier dibentuk ketika elemen-elemen dari struktur sekunder (helix,

lembar-lembar dan loop) dilipat bersama-sama dalam 3 tatanan dimensional. Interaksi

hidrofobik dan jembatan disulfida bertanggung jawab secara dasar dalam stabilisasi

struktur tersier yang digunakan sebagai petunjuk oleh kumpulan amfipatik (helix ke ikatan

4helix ). Pada struktur ini residu hidrofobik terikat secara sukar pada inti, terlindung dari

pengepungan lingkungan cair, ketika bagian polar dan residu tetap yang bermuatan

terlindung pada permukaannya.

Struktur kuartener

Struktur kuartener ditetapkan ketika 2 atau lebih rantai polipeptida diasosiasikan

dalam bentuk superstruktur, yang , pada banyak kasus, sangat perlu sekali untuk fungsi

biologi. Salah satu contoh yang diketahui adalah hemoglobin, yang terdiri dari 4 unit

polipeptida bersama-sama diikat oleh ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Pada kasus

ini, fleksibilitas struktur kuartener pada respon untuk mengikat oksigen adalah sangat

kritis untuk mengambil dan melepaskan oksigen pada paru-paru dan lingkungan

pembuluh darah kapiler. Atibodi adalah contoh lain protein dengan struktur kuartener.

Molekul2 ini terdiri dari 4 rantai polipeptida (2 ringan dan 2 berat) terikat secara

bersama-sama oleh jembatan disulfida. Struktur yang dihasilkan biasanya sangat stabil,

memungkinkan antibodi untuk beredar secara bebas didalam plasma.

Struktur protein diklasifikasikan dalam beberapa hirarki. Protein diklasifikasikan

dalam beberapa kelas dan melekuk sehingga diketahui keasliannya dan pola

perkembangannya bisa diidentifikasi. Bagaimanapun juga , akan dicatat bahwa meskipun

protein termasuk dalam kelas yang sama dapat berkelakuan secara berbeda behkan sejak

subtitusi asam amino yang menghasilkan variasi sifat bifisik. Tabel 1.2 menunjukkan kelas

kelas protein:

9

10

Dengan demikian, kromatografi dapat digunakan sebagai alat untuk memisahkan isoform

yang sesuai. Glikosilasi adalah penambahan molekul karbohidrat, baik gula sederhana atau

oligosakarida kompleks, ke molekul protein.Glikosilasi menjadikan protein lebih hidrofilik dan

dengan demikian lebih mudah larut. Selain itu, karena karbohidrat terminal dari olssigosakarida

tersebut biasanya asam neuraminic (umumnya dikenal sebagai asam sialat) dengan pH 3, glikosilasi

juga mempengaruhi muatan bersih dan titik isoelektrikprotein. Akibatnya, pemisahan kromatografi

berdasarkan muatan yang berbeda dari glycovariants adalah mungkin.

Sebagai contoh, Gambar 1.10 menunjukkan isoelectric focusing (IEF) pemisahan gel

erythropoietin manusia rekombinan (rhEPO - saat ini penjualan terbesar kedua di industri

biofarmasi). Seperti dapat dilihat dalam gambar, bahan awal berisi beberapa varian dengan titik

isoelektrik antara 3,5 dan 5,5. Loading start materi pada kolom penukar anion dan eluting dengan

peningkatan konsentrasi garam menghasilkanfraksi terelusi yang telah secarasubstansial

mengurangi heterogenitas. Kemudian fraksi eluting mengandung varian lebih asam dengan nilai

isoelektrik rendah Varian ini lebih bermuatan negatif dan mengelusi hanya pada garam konsentrasi

tinggi dari penukar anion bermuatan positif. rhEPO tinggiglikosilasi dan glyco variants yang

memiliki bioaktivitas berbeda. Dengan demikian, kontrol pola glikosilasi pola dan, dalam beberapa

kasus, pemisahan varian tertentu yang tidak diinginkan diperlukan untuk menjaga kualitas produk

yang konsisten.

11

Deamidasi juga dapat memiliki efek dramatis baik pada bioaktivitas dan perilaku

kromatografi. Deamidasi melibatkan transformasi kimia dari asparagin dan glutamin, yang

bermuatan asam amino polar, menjadi asam aspartat dan asam glutamat masing-masing, baik yang

bermuatan negatif pada pH di atas4. Residu deamidasi asparagine lebih sering diamati dari pada

glutamin, namun proses ini sangat tergantung pada lokasi residu tersebut dalam struktur protein.

Residu permukaan cenderung paling terpengaruh, sementara yang terbenam dalam inti protein

biasanya lebih terlindungi. Deamidasi umumnya difasilitasi oleh nilai pH yang lebih tinggi dan suhu

yang lebih tinggi dan terjadi melalui mekanisme yang di ilustrasikan pada Gambar 1.11. Dalam

proses ini, gugus amino dipecah dari asparagin membentuk L - siklik imida intermediate.

Intermediate (produk antara) umumnya tidak stabil dan selanjutnya diubah menjadi peptida L-

Aspartyl dan L - iso - Aspartyl. Keduanya memasukkan muatan negatif dan menurunkan titik

isoelektrik dariprotein. Perlu dicatat bahwa amida L-siklik juga dapat mengalami racemization

membentuk amida D - siklik, yang kemudian diubah menjadi peptida D - Aspartyldan D -isoaspartyl.

Hasil akhirnya adalah pengenalan D - asam amino keprotein. Penghapusan varian terdeamidasi

merupakan tugas penting karena varian inidapat memiliki bioaktivitas berbeda dan

penghapusannya adalah tantangan bagi proses hilir. Pemisahan dengan kromatografi penukar ion

adalah mungkin, tetapisering terjadi kesulitan karena perbedaan muatan bersih antara bentuk asli

dan terdeamidasi kecil, menghasilkan selektivitas yang rendah.

12

1.2.1.2. Oligonukleotida dan polynucleotides

Oligonukleotida dan polinukleotida, keduanya dapat merupakan kontaminan atau mungkin

merupakan produk. Misalnya, dalam produksi DNA plasmid untuk aplikasi terapigen, DNA

genom adalah kontaminan. Sebaliknya, dalam produksiobat-obatanprotein, baik genomik dan

DNA plasmid adalah kontaminan.

Polynucleotides hadir dalam sel baik sebagai asam deoksiribonukleat (DNA) atau

sebagai ribonukleat acid (RNA). DNA atau RNA mengkodekan informasi genetik. Pada

manusia,hewan atau tumbuhan DNA adalah materi genetik, sedangkan RNA ditranskripsi

dari itu.Dalam beberapa organisme lain seperti virus RNA, RNA merupakan bahan genetik

dan, dalam mode terbalik, DNA ditranskripsi dari itu. Molekul nukleotida terdiri dari gugus

fosfat,kelompokgula, dan kelompok nukleosida nitrogen. Nukleotida lebihhidrofilik dan

bermuatan negatif karena ada gugus asam fosfat. Pada DNA, nukleotida disusun atas heliks

beruntai ganda yang terbentuk oleh ikatan hidrogen yang lemah antara pasangan nukleotida.

13

Molekulmenyerupai 'tangga' memutar, di mana sisi dibentuk oleh gugus gula dan fosfat,

sedangkan 'anaktangga' dibentuk oleh basis nukleosida yang tergabung dalamikatan

hidrogen.

 Ada empat nukleotida dalam DNA, masing-masing berisi basis nukleosida yang

berbeda:adenin (A), guanin (G), sitosin (C), atau timin (T). Pasangan basa terbentuk secara

alamihanya antara A dan T dan antara C dan G sehingga urutan dasar masing-masinguntai

tunggal DNA secara sederhana dapat disimpulkan dari untai mitranya.

RNA mirip dengan DNA dalam struktur, tetapi mengandung ribosa bukan deoksiribosa.Ada

beberapa kelas molekul RNA termasuk messenger RNA, transferRNA dan RNA ribosom.

Mereka memainkan peran penting dalam sintesis protein dan kegiatan sel lainnya. miRNAs

adalah regulator global ekspresi gen. miRNAs adalah non-coding double-stranded.Molekul

RNA terdiri dari 19 sampai 22 nukleotida yang mengatur ekspresi gen di tingkat post-

transkripsi yang membentuk struktur untai tunggal dan menunjukkan antisense yang saling

melengkapi yang awalnya diidentifikasi pada nematoda Caenorhabditiselegans.

DNA dan RNA secara kimiawi merupakan molekul sangat stabil kecuali enzim DNAse atau.

Kehadiran enzimdengan cepat akan terdegradasi. Polynucleotida juga sangat sensitif

terhadap pergeseran mekanik.Setelah lisis sel, DNA dan RNA dilepaskan ke dalam

supernatandan dengan dramatis mengubah viskositas kaldu fermentasi sebagai akibat dari

ukuran dan struktur filament.

DNA genomik ada dalam inti organisme eukariotik selalu dikaitkan dengan protein yang

sangat dasar yang dikenal sebagai histon. Plasmid DNA hadir dalam sitoplasma organisme

prokariotik dan bukan histon tapi adadalam bentuk fisik yang berbeda yaknisuperkoil,

circular, linier, dan agregatseperti yang diilustrasikan pada Gambar 1.12.

14

Bentuk-bentuk ini berbeda dalam ukuran memberikan dasar untuk pemisahan

dengan gel elektroforesis atau dengan kromatografi eksklusi ukuran. Polynucleotida

bermuatan negatif atasberbagai pH karena berkenaan dengan gugus fosfat. Dengan

demikian, mereka sangatterikat oleh permukaan bermuatan positif. Akibatnya, aplikasi

proses hilir dapat diterapkan secara nyaman dan efisien dilakukan dengan resin penukar

anionatau dengan membran bermuatan positif.

1.2.1.3.Endotoksin

Endotoksin, juga dikenal sebagai pirogen, merupakan komponen dari dinding sel

bakteri Gram negatif yang terus dikeluarkan oleh bakteri dan di mana-mana dalam

Bioproces.Endotoksin sangat beracun ketika memasuki aliran darahdan manusia adalah

salah satu organisme yang paling sensitive terhadap endotoksin. Dengan demikian

penghilangan total darisuatu produk jadi diperlukan. Seperti ditunjukkan dalamGambar

1.13, endotoksinlipopolisakarida yang terdiri dari sebagian lipid A , inti wilayah, dan

antigen O atau S.Sebagian lipid A adalah komponen yang paling dilestarikan dan ditemukan

di semuaendotoksin. Ini juga merupakan bagian dari molekul yang bertanggung jawab

untuk toksisitas.Antigen O atauS sangat bervariasi dan strain spesifik. Ukuran dan struktur

juga tergantung pada kondisi pertumbuhan.

15

Endotoksin menargetkan sel-selimun responsifseperti makrofag, monosit, sel

endotel, neutrofil dan granulosit. Mereka menginduksi ekspresidari interleukin, tumor

necrosis factor, koloni - stimulating factor, dan leukotrien dan oksigen radikal dalam sel.

Sebagai konsekuensi dari adanya endotoksin dalamaliran darah, pasien mengalami

peradangan jaringan dan demam, penurunantekanandarah, shock, palpitasi, penurunan

permeabilitas pembuluh darah, komplikasi pernapasan, dan bahkan kematian. Gejala yang

sama terjadi dengan infeksi bakteri yang parah, sehingga disebut syok septik. Toksisitas

Hati yang parah dan gangguan hematologi telah diamati terjadi pada manusia dalam respon

sedikitnya 8 ng endotoksin per kg berat badan. Sebaliknya, endotoksin jauh kurang beracun

bagi banyakhewan. Sebagai contoh, LD 50 sebanyak 200 - 400 mg / hewan pada tikus.

Untukparenteral biopharmaceuticals tingkat ambang batas untuk aplikasi intravena5

endotoksin Unit s (EU) per kg berat badan per jam. Uni Eropa mendefinisikan aktivitas

biologi endotoksin dengan 1 UE sesuai dengan 100 pg dari EC-5 standar endotoksin atau

120 pg dari endotoksin berasal dari strain E. coli O111: B4. Deteksi endotoksin sulit dan

dilakukan dengan menggunakan bioassay. Di masa lalu kelinci telah digunakan untuk tujuan

ini. Kali ini penggunaan tes telah digantikan oleh uji yang disebut Limulusamoebocyte lisat

(LAL), yang menggunakan Hemolimf dari kepiting tapal kuda. LAL menggumpal beberapa

menit dengan adanya sejumlah endotoksin (lihat Gambar 1.14) membentuk suatu dasar

untuk tes dengan batas deteksi endotoksin serendah dari 10 pg per ml. Pedoman umum

dijelaskan di USP di Bab 79 pada compounding and sterile preparations (CSP).

Tabel1.4 memberikan ringkasan berbagai solusi dari tipe endotoksin. Endotoksin hadir

dalam konsentrasi yang besar dalam protein yang berasal dari fermentasi bakteri, tetapi

juga dapat hadir sebagai agen adventif dalam banyak sistem lain.

16

Dalam produksi industri farmasi untuk penggunaan parenteral, perawatan khusus

digunakan untuk mencegah kontaminasi endotoksin. Misalnya, endotoksin–bebas air

digunakan dalam penyusunan media kultur dan buffer kromatografi, diresirkulasi pada

suhu tinggi untuk menghindari pertumbuhan bakteri dan akibatnya pembentukan

endotoksin. Meskipun endotoksin stabil terhadap panas, mereka hancur pada pH basa. Jadi,

membersihkan peralatan pengolahan, tank, membran, dan media kromatografi dengan

larutan natrium hidroksida umumnya diperlukan untuk menjamin penghilangan lengkap

dari kontaminan ini.

1.2.2. Biomolekul: physiochemical Properti

    1.2.2.1 Absorbansi UV

Konsentrasi proteindalam larutan sering diukur dengan absorbansi Uv terutama karena

penyerapan oleh tirosin asam amino aromatik, triptofan, dan fenil alanin dan jembatan disulfida.

Absorbansi panjang gelombang maksimum dan koefisien ekstingsi untuk komponen ini

dirangkum dalam Tabel 1.5.

17

Karena absorbansi kuat triptofan, absorbansi maksimum untuk protein biasanya sekitar

280 nm dan panjang gelombang ini paling sering digunakan untuk penentuan kuantitatif.

Menurut hukum Lambert-Beer, absorbansi dari larutan protein pada panjang gelombang

tertentu berhubungan linier dengan konsentrasi molar dari analit, c, persamaannya sebagai

berikut:

A=

A= εmlc

di mana Io adalah intensitas cahaya sebelum melewati sampel, I adalah intensitas cahaya

setelah melewati sampel, εmadalah koefisien ekstingsi dan l adalah panjang atau jarak cahaya

18

yang melewati sampel. Validitas Persamaan diatas umumnya relatif terbatas untuk larutan

protein yang encer dan jalan cahayanya pendek, dimana A kurang dari 2. Pada nilai yang lebih

tinggi, rasio yang ditransmisikan dan cahaya yang melewati sampel menjadi terlalu kecil untuk

penetapan suatu determinasi. Dengan demikian, penentuan kuantitatif penentuan konsentrasi

larutan protein membutuhkan dilusi atau cahaya yang sangat pendek.Seperti terlihat pada Tabel

1.6, absorbansi spesifik dari protein yang khas bervariasi dengan adanya asam amino aromatic

Trp dan Try dan, jembatan disulfida. Karena isi protein relatif bervariasi, teka dempiris

diperlukan untuk penentuan kuantitatif yang tepat.

Untuk alternative, koefisien molar dapat diperkirakan dengan akurasi relatif sebagai

kombinasi linear dari residu Trp dan Tyr jembatan disulfida menurut persamaan berikut:

dimana nTrp, nTyr, dan nSS adalah jumlah residu Trp Tyr dan ikatan disulfida

Perlu dicatat bahwa asam nukleat memiliki absorbansi maksimum pada 260 nm

dan dapat mengganggu secara substansial penentuan protein pada 280 nm. Dengan demikian,

ketikaasam nukleat hadir simultan dalam larutan, koreksi harus dilakukan dalammenentukan

konsentrasi protein dariabsorbansi pada 280 nm.Kelompok protein peptida menyerap cahaya

dalam kisaran UV jauh (180-230 nm)dan nilai-nilai absorbansi yang sangat tinggi diamati di

daerah ini bahkan untuk kondisi yang sangat encer. Akibatnya, deteksi dalam analitis

kromatografi sering dilakukan pada 218 nm, dimana absorbansinya sekitar 100 kali lebih

besar.Protein dengan chromophores tambahan menyerap di UV dekat atau terlihat di daerah

sinar tampak. Contoh umum adalah protein yang mengandung besi

sepertihemoglobin,mioglobin dan transferrin yang berwarna merah, atau Cu - Zn superoxide

dismutase yang hijau.

Asam nukleat menunjukkan absorbansi yang kuat di daerah 240-275 nm daerah transisi -π

*dari π cincin nukleosida pirimidin dan purin. Polimer DNA danRNA menyerap pada daerah

yang luas pada maksimum dekat 260 nm. Massa spesifik koefisien ekstingsiDNA adalah 20

(mg ml-1cm-1). Kemurnian DNA diperkirakan oleh rasio absorbansi pada 260 dan 280 nm.

Kemurnian DNA untai ganda dan RNA rasio E260/E280 adalah antara 1,8 dan 2,0. Pengukuran lebih

dapat diandalkan pada pH basa. Berbeda dengan protein, absorbansi asam nukleat cukup

sensitif terhadap pH, dan menurun pada pH rendah.

19

1.2.2.2 Ukuran

larutan dan suspensi ditemukan dalam produk bioteknologi proses hilir mengandung

molekul dan partikel dengan berbagai ukuran seperti digambarkan pada Tabel 1.7. Protein

globular berada di kisaran 3 - 10 nm, sedangkan asam nukleat bisa jauh lebih besar. Plasmid

terapetik berada di kisaran 100 nm. Virus dan partikel seperti virus berada di kisaran 50 nm

sampai 400 nm, sedangkan sel berada di jangkauan mikrometer.

Sementara sel-sel dan puing-puing sel mudah dipisahkan dengan sentrifugasi karena

memiliki kecepatan sedimentasi tinggi (Tabel 1.7), protein dan asam nukleat memerlukan

metode lebih canggih seperti kromatografi dan filtrasi membran. Pemisahan protein dengan

ultra sentrifugasi hanya dilakukan untuk tujuan analisis karena tingkat rotasi yang diperlukan

sangat tinggi (setinggi 50 000 rpm).Ukuran diberikan dalam Tabel 1.7 untuk protein globular

terlipat. Struktur protein cukup padat (kepadatan massa ~ 1,4 g cm-3), bentuknya bulat atau

mirip elips. Namun, protein menyimpang dari bentuk-bentuk kompak seperti yang telah

didenaturasi, fibrosa, batang, atau disk. Dalam kasus ini, ukuran dari protein dan

makromolekul lainnya sering digambarkan oleh parameter lain termasuk jari-jari rotasi, rg,

jari-jari hidrodinamik, rh, jari-jari dibentuk dengan memutar protein sekitar pusat

geometrisnya, rr, dan jari-jari, setara dengan bola dengan massa yang sama dan kepadatan

sebagai molekul yang sebenarnya, rm.

20

Jari-jari rotasi dapat diukur dengan hamburan cahaya statis. Hal ini seringdilakukan dengan

size kromatografi eksklusi (SEC) sehingga memungkinkan pencampuran protein yang akan

dianalisa. Ada suatu hubungan umum antara radius rotasi dan jumlah cahaya yang tersebar,

yang berbanding lurus dengan produk dari berat- massa molar rata-rata dan konsentrasi

protein.

Sebuah alternatif, biasanya metode yang digunakan untuk penentuan ukuran protein adalah

size exclusion chromatography (SEC). Ukuran molekul yang berbeda tidak semua menembus

pori-pori media SEC pada tingkat yang sama sehingga mengarah ke berbagai retensi dalam

kolom. Kolom SEC dapat dikalibrasi dengan standar protein yang diketahui massa molekulnya

yang memungkinkan ukuran protein yang tidak diketahui untuk dapat diperkirakan.

Metode lain untuk penentuan ukuran molekul protein adalah SDS - gel poliakrilamida

elektroforesis (SDS - PAGE) yang memberikan informasi tentangmassa molekul,

ultrasentrifugasi yang menyediakan informasi mengenai radius hidrodinamika, dan teknik

hamburan lain seperti small angle X–rayscattering (SAXS).

1.2.2.3. Muatan

Protein adalah molekul amfoter dengan muatan negatif dan positif, yang berasal dari rantai

samping asam amino asam dan basa (Tabel 1.1) dan dari ujung amino dan karboksil masing-

masing rantai polipeptida. Memiliki nilai pK masing-masing sekitar 8,0 dan 3,1. Modifikasi dari

rantai samping asam amino secara substansial dapat mengubah muatan protein. Contoh

penting adalah glikosilasi dengan asam sialat, misalnya, disitus N-glikosilasi dalam anti bodi

atau eritropoietin, dan deamidasiresi dua sparagin dan glutamin. Keduanya merupakan

modifikasi post-translasi membuat protein lebih asam dan dengan demikian lebih tinggi

muatan negatif. Dalam banyak kasus dapat mempengaruhi waktu paruh protein in-vivo,

sehingga kontrolini menjadi tujuan pentingdalam bioteknologi proses hilir.

1.2.2.4. Hidrofobitas

Hidrofobisitas protein di tentukan oleh rantai samping non-polar asam amino.

Meskipun istilah hidrofobisitas sering digunakan, tetapi definisinya sulit dan di

perdebatkan secara luas. Pengalihan senyawa apolar kedalam cairan polar seperti air yang

berhubungan dengan panas dan sebagai kuantifikasi bebas energy. Efek hidrofobik

meningkat saat efek entropis dominan. Efek hidrofobik meningkat dengan tegangan

permukaan air yang di sebabkan oleh Daya tarik antar molekul di dalam cairan yang di

21

sebabkan oleh berbagai kekuatan antar molekul. Efek hidrofobik demikian terutama

disebabkan oleh ikatan hidrogen yang kuat dalam air, sedangkan gaya van der Waals

umumnya memainkan peran kecil.

Hidrofobisitas protein secara teoritis dihitung dari transfer energi asam amino dari

pelarut apolar ke dalam air (lihat Gambar 1.20).

Gambar 1.20. Kalkulasi hidrofobisitas dari kalkulasi Cu-Zn seuperoxide dismutase manusia

menurut skala perbedaan hidrofobisitas : Hopp dan Wood [22] {kiri} dan Kyte dan Doolittle

[23] {kanan}.

Dalam rantai peptida - gugus amino dan gugus karboksil tidak ada karena gugus tersebutα

harus bereaksi untuk membentuk ikatan peptida. Dengan demikian energi bebas dari

transfer asam amino tidak benar-benar menggambarkan hidrofobisitas dari protein dan

sangat tergantung pada skala hidrofobik yang digunakan untuk menghitung hidrofobisitas

protein.

Distribusi dari residu hidrofobik surface-exposed dalam protein tidak homogen. Hal

ini digambarkan untuk lisozim pada Gambar 1.21.

22

Gambar 1.21. Distribusi dari kultur hidrofobik di permukan lysozyme (kiri) dan serum

albumin manusia (kanan) pada pH netral. Kuning dan biru bercahaya menunjukkan

hidrofobik dan hidrophilik bertambal, berturut.

Densitas dan distribusi dari residu permukaan protein adalah dasar untuk

hydrophobic interaction chromatography (HIC) di mana permukaan hidrofobik residu

berinteraksi dengan matriks hidrofobik ringan. Pada lipat yang salah dapat menyebabkan

variasi dalam jumlah dari permukaan residu hidrofobik terbuka, HIC dapat digunakan

sebagai alat untuk memisahkan protein asli dari isoform gagal melipat.

Pendekatan lain untuk mengukur hidrofobisitas protein adalah dengan mengukur

retensi dalam kolom kromatografi yang dikemas dengan media hidrofobik. Di kasus ini, jika

protein tidak terungkap, retensi ini terkait dengan jumlah sisi rantai asam amino hidrofobik

yang memempel pada permukaan [24]. Hidrofobisitas diperoleh dengan metode ini relatif

dan tergantung pada metodologi yang digunakan, sehingga hanya berguna untuk tujuan

peringkat

1.2.2.5. Solubilitas

Kelarutan sering menjadi pertimbangan penting dalam pengolahan hilir, karena

berbeda drastis dengan pH, kekuatan ionik, dan jenis garam. Memprediksi kelarutan dari

protein dalam media air dari strukturnya sangat sulit dan biasanya memerlukan

pengukuran empiris. Kelarutan protein bervariasi secara dramatis. Beberapa protein,

misalnya Cu - Zn superoxide dismutase, memiliki kelarutan setinggi 400 mgml–1 sementara

yang lain, misalnya interferon- rekombinan, yang larut pada konsentrasi kurang dari 10γ

mgml-1. Secara umum, kelarutan protein terendah pada titik isoelektrik, di mana muatan

bersih adalah nol, tetapi bervariasi dengan kekuatan ion, yang merupakan gambaran

sebagai berikut :

(1.16)

dimana Cj adalah konsentrasi ion j dan Zj muatannya. Kelarutan dari -lactoglobulin sebagaiβ

fungsi dari konsentrasi garam dan pH, yang dapat di lihat seperti contoh pada gambar 1.22.

23

Gambar. 1.22. Kelarutan dari β-lactoglobulin seperti fungsi pH paa empat konsentrasi yang

berbeda dari NaCl (sodium clorida).

Secara umum, garam pada konsentrasi rendah meningkatkan kelarutan protein,

yang prosesnya disebut sebagai 'salting in'. Sebaliknya, pada konsentrasi tinggi garam

mengurangi kelarutan protein, yang disebut sebagai 'salting out'. Besarnya efek ini sangat

tergantung pada jenis garam, seperti yang ditunjukkan dalam contoh Gambar 1.23

Gambar 1.23 Kelarutan carboxyhemoglobin dalam larutan encer dengan perbedaan

elektrolit pada 250C. S dan S0 yang di gunakan sebagai pengganti w atau w0.

Untuk carboxyhemoglobin. Kecendrungan kelarutan protein dapat dijelaskan dari

bentuk perpanjangan teori Debye –Hückel. Dapat di lihat dari persamaan:

24

(1.17)

dimana w adalah kelarutan protein dalam larutan yang sebenarnya, w 0 kelarutan dari

protein dalam air, z1 dan z2 nilai garam, dan Ks dan A adalah garam dan protein parameter

empiris spesifik. Pada kekuatan ion tinggi, Persamaan 1,17 tereduksi menjadi hubungan

log-linear sebagai berikut:

(1.18)

yang ditampilkan untuk berbagai protein pada Gambar 1.24.

Gambar 1.24 Kelarutan protein dalam larutan ammonium sulfat.

Pengaruh jenis garam pada kelarutan protein secara resmi dijelaskan yang pertama

oleh Hofmeister yang menjelaskan peringkat anion dan kation sesuai dengan kemampuan

mereka untuk mengendapkan protein, yang umumnya dikenal sebagai Hofmeister atau seri

lyotropic:

25

Interpretasi sempel sederhana dari seri ini adalah ion tertentu yang mengikat

bebas air menurun kemampuan protein untuk tetap dalam larutan. Menariknya garam

dalam seri Hofmeister juga berkorelasi dengan begitu so-called Jones-Doyle koefisien-B

koefisien dan hidrasi entropi sehingga tampaknya baik berhubungan dengan efek dari

garam pada struktur air.

Intinya, perlu dicatat bahwa dalam prakteknya, pemilihan garam untuk digunakan

dalam hilir pengolahan tidak hanya tergantung pada seri Hofmeister, tetapi juga pada

faktor-faktor seperti nilai ketersediaan, biokompatibilitas, dan nilai pembuangan.

1.2.2.6. Stabilitas

Dua jenis stabilitas perlu dipertimbangkan untuk protein: Stabilitas termodinamika

atau Konformasi dan stabilitas kinetik atau koloid. Stabilitas konformasi protein

digambarkan oleh energi bebas G dari keseimbangan antara alami dan lipatan membuka.Δ

Transisi lipatan alami dari N, ke dalam bentuk lipatan, U, digambarkan oleh reaksi kimia

berikut :

di mana k1 dan k-1 adalah konstanta laju. Keseimbangan yang sesuai konstanta K eq

= [U] / [N] biasanya sangat rendah dalam larutan air, karena protein folding umumnya

termodinamika disukai sebagai akibat dari konsentrasi hidrofobik residu dalam inti protein.

The G yang sesuai diberikan pada persamaan berikut:Δ

Perwakilan nilai yang diberikan dalam Tabel 1.8 bersama dengan pencairan yang

sesuai 'melting temperature', yang merupakan sebagai gambaran suhu di mana setengah

dari protein ini dalam keadaan tidak dilipat.

26

Kosmotropic (atau cosmotropic) garam dan poliol seperti sorbitol atau sukrosa

menstabilkan protein sementara chaotropic garam atau urea pada konsentrasi yang lebih

tinggi memiliki efek destabilisasi di protein konformasi.

Stabilitas kinetik, di sisi lain, dapat digambarkan sebagai berikut persamaan:

yang menunjukkan lebih lanjut langkah kinetically-driven dari keadaan tidak dilipat

kedaerah aggregat ireversibel. Protein dengan k2 tinggi menunjukkan stabilitas kinetik

rendah. Keseluruhan stabilitas demikian tergantung pada efek termodinamika dan kinetik.

mungkin, misalnya, untuk di tambahkan garam untuk mengurangi stabilitas kinetic,

sementara meningkatkan stabilitas secara keseluruhan sebagai akibat dari efek

termodinamika. Namun, efek ini sering susah untuk diprediksi, sehingga dalam prakteknya,

stabilitas keseluruhan dan shelf-life diukur secara empiris.

1.2.2.7. Viskositas

Banyak larutan dan suspensi yang di temui dalam Bioprocessing sangat kental. Hal

ini terutama berlaku untuk kaldu fermentasi yang mengandung DNA dan untuk konsentrasi

larutan protein tinggi. Secara umum, viskositas ( ), berkaitan dengan tegangan geser ( ),η τ

dan laju geser (ý) , Dengan persamaan sebagai berikut:

(1.22)

27

Untuk fluida Newtonian, adalah konstan dan hubungan antara tegangan geser dan lajuη

geser yang linear. Untuk non-fluida Newtonian, bagaimanapun, bervariasi dengan geserη

Tingkat dan hubungan yang non - linear. Misalnya, perilaku fluida pseudoplastik

digambarkan oleh persamaan berikut:

(1.23)

di mana K dan n adalah konsistensi dan flow indeks, masing-masing. Untuk sangat

terkonsentrasi larutan protein unuk banyak kultur supernatan, n lebih kecil dari satuan,

menunjukkan bahwa viskositas jelas, = ý, menurun dengan meningkatnya laju geser.η τ

Rentang suku geser untuk berbagai larutan dan suspense ditemui dalam Bioprocessing

ditunjukkan pada Tabel 1.9.

Viskositas Khas yang dihadapi dalam Bioprocessing ditunjukkan pada Tabel 1.10.

Pada umumnya, kultur sel supernatan memiliki viskositas rendah dari 10 MPa s, sedangkan

sel homogenat jauh lebih kental dengan - nilai hingga 40 mPa s. KOntribusi terbesarη

terhadap viskositas kaldu fermentasi mentah adalah DNA. Namun, Untungnya baik DNA

genomik dan plasmid sangat sensitif terhadap geser dan sering terdegradasi mekanis pada

awal proses hilir. Enzim DNAse, baik alami atau ditambahkan sengaja, juga membantu

untuk menurunkan molekul-molekul, sehingga mengurangi viskositas.

Viskositas intrinsik [ ] adalah ukuran dari kontribusi zat terlarut ke viskositas larutan danη

merupakan gambaran sebagai berikut:

(1.24)

28

dimana 0 adalah viskositas tanpa adanya zat terlarut dan c konsentrasi zat terlarut. Padaη

batas semi-encer, dapat digambarkan sebagai fungsi dari c oleh ekpresi polinomialη

berikut:

(1.25)

Pada konsentrasi protein yang sangat tinggi, namun, model semi-empiris yang

diperlukan. Sebagai contoh, Gambar 1,25 menunjukkan viskositas relatif ( / 0) IgGη η

larutan sebagai fungsi konsentrasi IgG. Untuk konsentrasi yang lebih rendah sekitar 100 ml

mg–1 data kira-kira sesuai dengan Persamaan 1.25. Namun, pada konsentrasi yang lebih

tinggi viskositas meningkat secara eksponensial.

Gambar 1.25 Viskositas dari larutan IgG manusia, sapi, dan babi seperti fungsi dari

konsentrasi IgC.

Tabel 1.11 daftar viskositas intrinsik dari perwakilan biomolekul. Sepertinya dapat

diduga dari data tersebut, viskositas intrinsik tergantung pada bentuk molekul. Misalnya,

bentuk batang protein memiliki viskositas intrinsik yang lebih tinggi daripada bentuk

globular.

29

Sebuah hubungan empiris antara [ ] dan massa molekul M r adalah ditunjukkan oleh Mark -η

Houwink persamaan:

(1.26)

di mana a adalah parameter yang terkait dengan 'kekakuan' dari rantai polimer. Secara

teoritis, a = 2 untuk batang kaku, 1 untuk gulungan, dan 0 untuk bola keras. Secara empiris,

bagaimanapun, nilai a, = 0,6 0,7, dan 0,5 telah ditemukan untuk BSA, ovalbumin, dan

lisozim, masing-masing. Literature data (misalnya [33]) menunjukkan hubungan umum

antara viskositas intrinsik dan jumlah residu asam amino, yang dapat dinyatakan sebagai

berikut dengan [ ] dalam mlgη -1:

(1.27)

Dengan demikian, protein yang lebih besar dan agregat protein memiliki viskositas protein

tinggi yang lebih kecil dan bentuk monomer.

30

1.2.2.8. Difusivitas

Koefisien molekul difusi atau difusivitas dalam larutan, D0 adalah fungsi dari

ukuran zat terlarut, dalam larutan viskositas dan suhu. Seperti sebelumnya mencatat

persamaan Stokes-Einstein menggambarkan hubungan ini sebagai:

(1.28)

di mana kb adalah konstanta Boltzmann dan rh adalah radius hidrodinamika zat terlarut.

Diffusivities ditemui dalam rentang Bioprocessing luas dari 1 × 10 – 5 cm2s-1 untuk garam

dan molekul kecil lainnya 1 × 10-9 cm2s-1 untuk biomolekul besar seperti DNA. Protein

diffusivities dalam larutan encer umumnya dalam kisaran 10-6 sampai 10-7 cm2s-1.

Tabel 1.12 menyediakan ringkasan diffusivities khas dalam larutan encer pada suhu

kamar. Secara umum, diffusivities protein 10 - 100 kali lebih rendah daripada molekul kecil.

Plasmid memiliki nilai lebih kecil dengan faktor sebanyak 1000.

Gambar 1.26 menggambarkan efek dari massa molekul pada difusivitas pada

larutan encer berair pada suhu kamar. Tyn dan Gusek telah mengikuti korelasi untuk

protein globular:

(1.29)

di mana D adalah 0 dalam cm2s- 1, di mPa s, T di K, dan M r di Da, yang memiliki akurasiη

dari ± 10%.

31

Gambar 1.26 difusi protein globular dalam larutan encer cair pada temperature ruangan.

Beberapa pendekatan yang tersedia untuk penentuan eksperimental difusivitas

contohnya, oleh Cussler [35]. Umumnya digunakan pendekatan untuk protein termasuk

hamburan cahaya dinamis (lihat Bagian 1.1.2.2), sel difusi, Taylor berbasis dispersi, dan

microinterferometry.

1.3 Bioproses

Dalam bab ini kita akan membahas sistem ekspresi yang umum digunakan dan struktur

umum dari proses hilir yang diperlukan untuk mencapai kemurnian produk yang diinginkan.

Penekanan khusus dalam hal ini adalah pada produksi protein rekombinan melalui fermentasi dan

kultur sel, yang memainkan peran utama dalam industri bioteknologi.

1.3.1 Sistem Ekspresi

Banyak sistem ekspresi yang berbeda telah dikembangkan dalam protein rekombinan,

mulai dari bakteri yang sangat sederhana sampai pada tanaman dan hewan. Namun, jumlah sel

inang yang digunakan dalam produksi industri biofarmasi protein sangat terbatas. Strain bakteri

yang paling populer adalah E. coli, BL21, yang digunakan untuk memproduksi protein dimana

aktivitas biologis dari strain bakteri ini tidak memerlukan modifikasi pasca translasi. Ekspresi

protein dalam E. coli dapat terjadi dalam tiga cara yang berbeda. Protein dapat disekresi ke dalam

periplasma yang merupakan ruang antara membran sel dan dinding sel; protein dapat

diekspresikan dalam sitoplasma sebagai protein terlarut; atau dapat terakumulasi dalam sel

sebagai badan inklusi. Masing-masing sistem efektif untuk protein tertentu. Sitoplasma E. coli

32

merupakan lingkungan reduksi yang kuat yang menghalangi pembentukan jembatan disulfida,

sedangkan periplasma menawarkan lingkungan oksidasi yang memungkinkan pembentukan

jembatan ini sehingga memudahkan folding protein. Beberapa protein yang beracun bagi sel-sel

atau yang memiliki waktu hidup pendek dalam sitoplasma atau periplasma telah berhasil

diproduksi sebagai badan inklusi. Dalam hal ini, protein membentuk agregat yang tidak dapat

diserang oleh enzim protease. Di sisi lain, meskipun tidak sepenuhnya terdenaturasi, protein yang

dinyatakan sebagai badan inklusi umumnya tidak dalam konformasi asli mereka. Dengan demikian,

prosedur refolding biasanya diperlukan untuk menghasilkan bentuk aktif sepenuhnya. Meskipun

refolding dapat memerlukan biaya yang besar, bila dapat tercapai keseimbangan dalam pendekatan

ini, biaya akan menjadi lebih ekonomis karena tingkat ekspresi dalam sistem tubuh inklusi yang

didapat melalui proses ini sangat tinggi dan prosedur untuk mencuci protein yang dihasilkan

sederhana dan dapat digunakan untuk menghilangkan sebagian besar protein sel inang sehingga

menghasilkan kemurnian yang relatif tinggi. Gambar 1.27 menunjukkan contoh sel E. coli yang

mengekspresikan protein sebagai badan inklusi dan hasil analisis SDS-PAGE pada berbagai tahap

proses.

33

Sel ragi Saccharomyces cerevisae dan Pichia pastoris telah berhasil digunakan untuk

mengekspresikan berbagai macam protein rekombinan termasuk insulin dan albumin.

Saccharomyces cerevisiae juga digunakan untuk produksi antigen permukaan hepatitis. Namun, sel-

sel mamalia lah yang dibutuhkan untuk menghasilkan sebagian besar protein biofarmasi. Meskipun

kultur sel mamalia umumnya lebih kompleks, sel-sel ini dapat membawa keluar hasil modifikasi

pasca translasi, seperti glikosilasi, yang penting untuk aktivitas biologis dan farmakologis yang

tepat. Hamster Ovarium Cina (CHO) sel adalah sistem ekspresi mamalia yang paling umum

digunakan, terutama untuk antibodi rekombinan. Sel manusia, PerC6, telah dikembangkan baru-

baru ini dan juga digunakan untuk produksi beberapa protein rekombinan. CHO dan PerC6 mampu

mengekspresikan antibodi dalam konsentrasi 15 mg ml-1. Titer produk yang dicapai tinggi, hal ini

terutama dikarenakan ekspresi protein dalam sistem ini umumnya independen dalam hal

pertumbuhan. Akibatnya, sel-sel dapat dipertahankan dalam bioreaktor untuk waktu yang lama

dalam keadaan produktif dan dapat dikembangbiakan untuk mencapai densitas yang sangat tinggi,

hingga 108 sel per ml.

Sel mamalia lainnya yang digunakan dalam produksi protein rekombinan adalah sel ginjal

bayi hamster (BHK), sel Vero, dan sel ginjal anjing Madin - Darbyn (MDCK). Beberapa faktor

koagulasi yang membutuhkan - carboxylation diproduksi di BHK. Sel Vero, berasal dari ginjalγ

monyet, dan sel-sel MDCK digunakan untuk produksi vaksin. Sel serangga seperti sel-sel dari

jaringan ovarium kepompong ulat Spodoptera frugiperda (Sf9), juga telah diusulkan untuk

mengekspresikan protein rekombinan. Sel-sel ini dapat terinfeksi virus serangga seperti virus

polihedral California Autograph nuklir yang juga dikenal sebagai baculovirus. Meskipun mudah

untuk menanganinya, sistem sel serangga belum berlisensi untuk dapat diproduksi pada industri

protein biofarmasi.

Pada masa lalu, hewan transgenik dianggap memiliki sistem produksi yang sangat baik

sejak protein dapat disekresikan kedalam susu dengan titer sampai 5 mg ml -1. Satu dekade yang

lalu, titer tidak dapat dicapai dengan kultur sel mamalia. Dengan demikian, pada saat itu sistem

ekspresi sering disukai. Kemajuan modern dalam kultur sel, bagaimanapun, telah memungkinkan

tercapainya titer yang lebih tinggi. Sistem transgenik membutuhkan prosedur yang sangat

membosankan dalam mengembangkan keturunan dengan karakteristik ekspresi yang tepat.

Pemurnian protein dari susu juga bisa jadi merepotkan, terutama ketika penghilangan kasein

melalui pengendapan acid-induced yang tidak kompatibel dengan produk protein. Selain itu,

sebagai 'sistem produksi terbuka', hewan transgenik mungkin rentan terhadap masalah keamanan

34

dan kontaminasi eksternal. Keuntungan dari budidaya sel mamalia dalam sistem bioreaktor

tertutup ditambah dengan titer lebih tinggi daripada yang dicapai dalam susu transgenik dan

penggunaan proses pengolahan hilir yang sederhana mungkin adalah alasan rasional mengapa

kultur sel umumnya disukai dalam industri biofarmasi.

Tanaman dan sel tumbuhan juga menjadi kandidat yang potensial untuk ekspresi protein.

Meski berbeda dengan sel mamalia, modifikasi pasca translasi juga memungkinkan dalam

organisme ini. Namun, ekspresi dalam daun, batang, atau biji menyajikan tantangan proses

penanganan dan pemurnian karena jaringan atau benih harus ditumbuk atau ditekan dan

diekstraksi yang nantinya akan menghasilkan campuran yang sangat kompleks. Sebuah sistem

ekspresi yang menarik adalah rhizo-secretion, dimana protein yang disekresi ke dalam cairan

budidaya dari akar berbulu. Sel tumbuhan, di sisi lain, menyajikan sedikit kesulitan dalam

pengolahan hilir karena sel-sel tumbuh dalam media yang sangat sederhana. Sistem lain yang

menarik adalah 'teknologi olesins'. Dalam kasus ini, lipid diakumulasikan dalam sel tanaman dalam

bentuk tetesan kecil. Protein, yang dikenal sebagai olesins ini dapat terkonsentrasi sebagai

monolayer pada permukaan tetesan ini. Setelah menggabungkan protein rekombinan ke olesins,

penanganan utama protein target dapat dicapai oleh proses yang relatif sederhana melalui panen

tetesan minyak.

1.3.2 Komposisi Sel Inang

Komposisi sel inang memiliki efek penting pada pengolahan hilir ketika produk merupakan

intrasel, karena dalam hal ini komponen seluler merupakan kotoran besar. Komponen sel inang

juga ditemukan secara luas sebagai pengotor dalam produk sekresi, karena lisis sel selalu terjadi

sampai batas tertentu selama proses fermentasi. Kenyataannya, dalam beberapa kasus, prosedur

budidaya yang menghasilkan titer tinggi, seperti yang digunakan untuk antibodi, merupakan hasil

produksi lisis sebagian dari sel yang pada gilirannya menyebabkan kontaminasi dari produk

dengan komponen sel inang. Sebuah gambaran karakteristik komposisi dan fisik dari sel inang

utama digambarkan pada tabel 1.13 dan 1.14.

35

Seperti yang dapat dilihat dari tabel ini, sel mamalia mengandung lebih banyak protein

tetapi sedikit asam nukleat daripada bakteri. Bakteri dan ragi juga mengandung banyak komponen

dinding sel. Komponen ini sering tidak larut dan secara efisien dapat dihilangkan selama langkah

proses awal. Langkah-langkah awal secara signifikan dipengaruhi oleh kepadatan sel dan viskositas

dari kaldu. Kepadatan sel yang sangat tinggi dapat diperoleh pada ragi, terutama pada P. pastoris,

dimana telah dilaporkan bahwa sel kepadatannya bisa sampai 400 g sel per liter. Suspensi tersebut

sangat sulit untuk diklarifikasi. Suspensi ini seringkali harus diencerkan dengan tujuan untuk

mensentrifus kaldu. Asam nukleat hadir dalam bentuk DNA dan berbagai bentuk RNA. Senyawa ini

yang bertanggung jawab terhadap viskositas kaldu yang tinggi tetapi cepat terdegradasi akibat

adanya gaya geser mekanis atau nuklease endogen.

36

Pertimbangan terakhir adalah stabilitas mekanik dari sel inang. Bakteri dan sel-sel ragi

umumnya secara mekanis sangat stabil dan tingkat geser diatas 106 s-1 diperlukan untuk

memecahkan sel-sel ini. Tingkat geser yang tinggi hanya dapat dicapai dengan menggunakan

peralatan khusus seperti high-pressure homogenizers atauFrench presses. Sebagai perbandingan, sel

mamalia jauh lebih lemah untuk memecahkan sel-sel. Kekuatan peledak yang mungkin diperlukan

untuk menghancurkan sel ragi adalah pada kisaran 90 N sedangkan kekuatan ledakan untuk selμ

mamalia berkisar 2 - 4 N.μ

1.3.3 Media Kultur

Biofarmasi modern biasanya diproduksi bersama media dimana komponennya secara

kimiawi terkarakterisasi. Di masa lampau, ragi, daging, dan ekstrak kedelai diproduksi melalui

degradasi proteolitik dan ekstraksi, yang biasa digunakan untuk budidaya bakteri dan sel-sel ragi.

Standarisasi bahan baku sangat sulit karena dapat menghasilkan variasi antar batch. Sampai saat

ini umumnya dilakukan penambahan media budidaya untuk sel mamalia dengan serum janin sapi,

dengan konsentrasi sampai dengan 10%. Selain menambahkan kompleksitas dan biaya, suplemen

tersebut dapat memperkenalkan agen adventif yang tidak diinginkan, seperti prion, yang secara

37

signifikan dapat meningkatkan proses pengolahan hilir. Walaupun pengujian untuk agen tersebut

masih mungkin diperlukan, namun penggunaan media dimaksudkan untuk menyederhanakan

pengolahan hilir.

Media untuk budidaya bakteri pada tingkat industri biasanya sangat sederhana dan

menyediakan sumber-sumber penting dari karbon, nitrogen dan fosfat. Contoh media terpapar

dalam Tabel 1.15.

Ketika pH fermentasi dikendalikan oleh penambahan NaOH, konduktivitas setinggi 40 cm

mS-1 dapat dicapai pada akhir periode budidaya. Konduktivitas yang tinggi tersebut dapat

mengganggu operasi pengolahan hilir seperti pertukaran ion, sehingga langkah-langkah seperti

pengenceran atau diafiltrasi diperlukan. Kesulitan ini dapat dihindari dengan menggunakan amonia

untuk mengontrol pH, yang biasanya menghasilkan konduktivitas yang lebih rendah dari

supernatan kultur.

Selain garam dan gula, yang diperlukan untuk metabolisme sel, produksi protein

rekombinan pada bakteri biasanya membutuhkan penambahan induser, seperti isopropil - - D -β

thiogalactopyranoside (IPTG), yang digunakan untuk mengaktifkan ekspresi protein saat kepadatan

sel tertentu tercapai. Penggunaan senyawa alam sebagai induser menguntungkan karena spesies

tersebut mudah terdegradasi dalam kultur dan kotoran tidak signifikan. Di sisi lain, deterjen atau

minyak ditambahkan ke kultur sebagai agen anti-foaming, meskipun hadir dalam jumlah yang

relatif kecil, dapat mempengaruhi proses hilir karena mereka cenderung dapat mengotori

membran dan matriks kromatografi.

38

Kultur media untuk ragi mirip dengan yang digunakan untuk E. coli. Metanol sering

digunakan sebagai inducer untuk sistem ekspresi berbasis promotor oksidase alkohol (AOX).

Kultur sel mamalia, di sisi lain, memerlukan medium jauh lebih kompleks termasuk glukosa sebagai

sumber karbon, asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, asam lemak, nukleotida, piruvat,

dan butirat. Medium basal ini dilengkapi dengan protein untuk transportasi oksigen, hormon, dan

faktor pertumbuhan. Protein transport oksigen seperti transferin mengandung zat besi dalam

bentuk terikat. Dalam rangka mendapatkan media bebas protein, protein ini sering diganti dengan

chelators besi seperti besi sitrat, asam iminodiaectic besi, amonium sitrat besi dan tropolone (2 -

hidroksi - 2,4,6 - cycloheptatrien - 1 - one). Namun, senyawa ini juga dapat mengganggu pengolahan

hilir. Ditambah lagi, dalam kondisi sedikit asam, sitrat besi dapat membentuk gel, yang sulit untuk

dipisahkan dari protein dan biomakromolekul lainnya.

Beberapa aditif lainnya yang mungkin ada dalam media kultur sel: pH indikator seperti

fenol red, ditambahkan ke media kultur skala laboratorium dalam bentuk terikat sebagai

pertukaran ion resin dan sebaiknya dihindari pemakaiannya untuk budidaya skala besar. Polimer,

seperti poli (propilen glikol) atau poli (etilen glikol), sering diperlukan dalam konsentrasi sampai

0,02% untuk melindungi sel-sel dari tegangan geser. pH dalam kultur sel mamalia biasanya diatur

dengan penambahan CO2, meskipun kultur dengan kepadatan tinggi mungkin memerlukan

penambahan NaOH. Konduktivitas akhir kurang dari 17 mS cm-1 adalah khas dan dapat membuat

penangkapan langsung melalui pertukaran ion lebih mudah daripada menangkap dari ragi dan

homogenat E. coli.

1.3.4 Komponen Kultur Kaldu

Secara umum, sebelum panen, kultur kaldu mengandung komponen-komponen berikut: sel

utuh, puing-puing dari sel lisis, komponen intraseluler sel inang, media komponen yang tidak

digunakan, senyawa yang disekresikan oleh sel, dan secara enzimatik atau kimiawi dikonversikan

oleh komponen media. Oksigen habis karena selama proses penanganan utama suplai oksigen

dimatikan dan residu oksigen yang terlarut sangat cepat dikonsumsi. Kandungan oksigen yang

rendah dapat menyebabkan nekrosis dan kematian sel-sel serta dapat dengan cepat terjadi lisis

selama fase ini. Beberapa jenis sel mulai autolisis hanya sekitar 30 menit tanpa oksigen. Akibatnya,

pemisahan jenis sel yang cepat dari sel-sel supernatan kaldu sangat diperlukan untuk

mempertahankan tingkat kotoran sel inang dalam jumlah rendah. Konsentrasi tinggi dari CO2 yang

39

dapat diproduksi oleh sel-sel sisa dalam kultur kaldu akan pecah dan menggeser pH menuju

wilayah asam. CO2 jauh lebih mudah larut dalam larutan air daripada oksigen, sehingga konsentrasi

substansial mungkin hadir. CO2 terlarut dapat dengan cepat dibebaskan ketika pH disesuaikan

pada proses pengolahan hilir dan membentuk gelembung yang kemudian dapat masuk kedalam

kolom kromatografi dan mengganggu pada kemasan.

Komponen sel inang intraseluler yang ada sebagai pengotor dalam supernatan kultur dapat

diperkirakan dari persamaan berikut:

dimana konsentrasi komponen intraseluler dapat diperkirakan dari Tabel 1.13 dan 1.14. Dengan

demikian, dari perspektif pengolahan hilir, viabilitas sel yang tinggi sangat diperlukan, ini tidak

selalu mungkin. Misalnya, dalam high-titer produksi antibodi oleh kultur sel, sel-sel sering lisis

dalam tahap akhir dari budidaya. Akibatnya, supernatan dari kultur sel mamalia tumbuh akan

mengandung protein sel inang dalam kisaran 1 - 3 mg ml-1 (1000 sampai 3000 ppm). Tingkat ini

harus dikurangi menjadi kurang dari 100 ppm dalam produk akhir.

1.3.5 Persyaratan Kualitas Produk

Pembuatan produk biologi untuk aplikasi farmasi harus mengikuti pedoman umum yang

telah ditetapkan oleh regulasi. Tiga kata kunci persyaratan kualitas produk utama: kemurnian,

potensi, dan konsistensi. Secara industri, persyaratan ini harus dipenuhi melalui proses yang

ekonomis dan dapat membawa produk ke pasar dengan cepat. Proses hilir harus dirancang untuk

memperoleh kemurnian yang cukup dan tetap menjaga potensi atau aktivitas farmakologi secara

konsisten.

1.3.5.1 Jenis Pengotor

Persyaratan kemurnian untuk biofarmasi bervariasi tergantung pada aplikasi tertentu.

Dengan demikian, tidak mungkin untuk menentukan nilai absolut. Namun, sebuah perbedaan

penting dapat dibuat antara zat pengotor, yang sering dikategorikan sebagai kritis atau non-kritis.

Sebuah pengotor non-kritis adalah senyawa inert tanpa relevansi biologis. Hal ini dapat terjadi,

misalnya, PEG sisa dari proses ekstraksi atau komponen berbahaya inangnya seperti lipid. Di sisi

40

lain, endotoksin atau sekresi faktor pertumbuhan ke dalam supernatan kultur adalah contoh

pengotor kritis, karena mereka menimbulkan aktivitas biologis yang merugikan. Pengotor ini perlu

ditelusuri sepanjang proses. Pengotor dapat berasal baik dari proses budidaya atau dari bahan

tambahan yang digunakan. Contoh dari proses terkait pengotor diantaranya kelarutan enhancer,

redoks - buffer, inhibitor enzim, dan senyawa yang dilepaskan dari filter atau media kromatografi.

Monomer yang bocor dari bahan polimer akan datang dan masuk dalam bentuk kontak dengan

produk kadang-kadang perlu menjadi perhatian khusus. Pengujian ekstensif dan dokumentasi

penghilangan mereka harus dan wajib dilakukan.

Istilah agen adventif ini digunakan untuk menggambarkan pengotor yang berpotensi

menular yang belum ditambahkan dengan sengaja dan tidak penting untuk proses tapi biasanya

sangat berbahaya. Mereka mungkin dapat masuk kedalam proses sebagai akibat bahan baku yang

terkontaminasi atau sel. Contoh-contoh zat adventif adalah virus, virus-like partikel, dan prion yang

mampu mengubah agen ensefalitis spongiform. Beberapa bahan kimia beracun juga dapat

dipertimbangkan untuk menjadi agen adventif. Terakhir, bioburden yang berasal dari kontaminasi

mikroba dari udara atau personil atau dari peralatan yang tidak cukup bersih, juga dapat memiliki

efek serius dan harus secara hati-hati dipantau dan dikendalikan.

Tabel 1.16 merangkum langkah-langkah yang diperlukan untuk menghilangkan agen

adventif dan pengotor lainnya. Demonstrasi ini biasanya dilakukan dalam percobaan skala kecil

karena jelas akan kontraproduktif yang dapat mencemari pabrik produksi oleh agen adventif.

Untuk penentuan ini, dikenal sebagai percobaan spiking, sebuah bolus dari agen adventif, misalnya

virus, akan ditambahkan ke aliran bahan baku dan memasuki langkah proses pemurnian. Titer

virus sebelum pemurnian a'= log10 (Feed titer) dan setelah pemurnian a''= log10 (titer Harvest) harus

ditentukan dan nilai faktor log - virus reduksi (LVR) dihitung sebagai berikut:

   

41

Dalam rangka untuk menjelaskan efek perubahan volume (misalnya hanya 1:10 pelarut

yang dihasilkan dalam LVR 1), faktor reduksi individu, Ri, dapat dihitung:

       

di mana V' dan V" adalah masing-masing volume makanan dan panen. Akhirnya, LVR dari

langkah-langkah proses individu ditambahkan bersama-sama sampai mencapai LVR kumulatif

untuk seluruh proses. Tabel 1.17 menggambarkan izin skema virus khas untuk proses pemurnian

antibodi.

42

Meskipun hampir semua sel mamalia yang terinfeksi virus harus membuat validasi

pemberantasan virus, upaya untuk menghilangkan prosedur ini sering dilakukan dengan

memanfaatkan proses platform yang telah menunjukkan nilai efisiensi clearance.

1.3.5.2 Peraturan Aspek dan Validasi

Kualitas produk biofarmasetik dan proses validasi harus tunduk pada peraturan oleh

masing-masing pemerintah. Di Amerika Serikat, kerangka hukum ini diterbitkan dalam Code of

Federal Regulation 21 (21 CFR), Subchapter F Biologics. US Food and Drug Administration (US FDA)

bertanggung jawab atas pelaksanaannya. Kode US ini mendefinisikan produk biologi sebagai

berikut: 'produk biologis berarti virus, serum terapi, racun, antitoksin, atau produk serupa yang

digunakan untuk pengobatan, pencegahan atau penyembuhan penyakit atau cedera manusia'.

Plasmid, sel dan jaringan yang tidak disebutkan secara eksplisit, tetapi dianggap sebagai bagian

dari definisi ini. Di Uni Eropa (UE), kerangka hukum masih di bawah kedaulatan negara-negara

anggota, meskipun Uni Eropa telah mendirikan Badan Kedokteran Eropa (EMEA), dengan tujuan

harmonisasi struktur peraturan di negara anggota Uni Eropa. Pedoman untuk produk obat yang

diperoleh dalam bioteknologi sebagaimana diatur oleh Commission of European Community,

mendefinisikan biologis sebagai produk yang berasal dari:

1. darah, cairan tubuh lain manusia atau jaringan manusia

2. darah binatang

3. mikroorganisme atau komponen mikroorganisme

4. hewan atau mikroorganisme untuk imunisasi aktif atau pasif

5. antibodi monoclonal

6. produk DNA rekombinan.

Adanya peraturan-peraturan tersebut menambah kompleksitas industri biofarmasetik.

Dengan demikian, Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) dibentuk untuk

mengembangkan kerangka peraturan umum internasional tersebut. ICH menyatukan kewenangan

Eropa, Jepang dan Amerika Serikat, serta ahli dari industri farmasi dari tiga wilayah untuk

membahas aspek-aspek ilmiah dan teknis terkait registrasi produk. Tujuannya adalah untuk

membuat rekomendasi tentang cara-cara untuk mencapai harmonisasi dalam penafsiran dan

penerapan pedoman teknis dan persyaratan untuk registrasi produk. Sementara kemajuan sedang

dibuat dalam proses harmonisasi, kerangka peraturan masing-masing negara tetap berlaku.

43

Selama bertahun-tahun, Pusat Penelitian dan Evaluasi Biologis (CBER) dari FDA AS telah

mengeluarkan rekomendasi rinci untuk pembuatan produk biologis didalam seri makalah 'Poin

Pertimbangkan'. Pertama kali makalah ini dirilis pada tahun 1983 dengan judul 'Prosedur Uji

Interferon: Poin Pertimbangan dalam Produksi dan Pengujian Interferon yang Ditujukan untuk

Penggunaan Investigational pada Manusia'. Makalah selanjutnya meliputi:

1. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Produksi dan Pengujian Obat Baru dan Produksi

Produk Biologis melalui Teknologi Rekombinan DNA - 1985/04/10

2. Pedoman Validasi Uji Limulus Amebocyte lisat sebagai Tes Produk Akhir Endotoksin

untuk Obat Parenteral Manusia dan Hewan, Produk Biologi dan Alat Kesehatan -

12/1987

3. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Industri dan Pengujian Produk Terapi untuk

Manusia yang Menggunakan Hewan Transgenik – 1995

4. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Industri dan Pengujian Produk Antibodi

Monoklonal untuk Penggunaan pada Manusia - 1997/02/28

5. Pedoman Industri: Penggunaan Antibodi Monoklonal sebagai Reagen dalam Produksi

Obat - 2001/03/29

 Validasi merupakan aspek penting dari proses pengembangan biofarmasetik. Menurut

definisi ICH yang ada, parameter penting yang dapat mempengaruhi kualitas produk perlu

divalidasi. Setelah validasi, protokol operasi standar (SOP) harus ada, yang menggambarkan proses

dan variasi yang diperbolehkan. Parameter operasional yang kritis didefinisikan sebagai proses

parameter sub-set terbatas yang secara signifikan mempengaruhi atribut kualitas produk kritis

ketika memiliki variasi bermakna diluar jangkauan operasional, sempit (atau sulit untuk dikontrol).

Misalnya, operasi langkah pemurnian kromatografi. Seperti terlihat pada Tabel 1.18 operasi ini

akan membutuhkan definisi dari sejumlah kondisi operasi sebagai input, yang pada gilirannya akan

menghasilkan karakteristik kinerja tertentu, yang didefinisikan sebagai output.

Dalam rangka untuk memvalidasi proses, parameter input harus lebih bervariasi

menyesuaikan rentang dan output yang diukur. Parameter kritis kemudian ditetapkan berdasarkan

percobaan ini, yang biasanya dilakukan dalam skala kecil. Rentang operasional disesuaikan dengan

interval yang telah ditetapkan untuk parameter ini serta untuk non - parameter kritis. Karena yang

terakhir tidak mempengaruhi atribut produk kualitas kritis, range mereka biasanya akan lebih luas

daripada parameter kritis (lihat Gambar 1.28).

44

1.3.5.3 Persyaratan Kemurnian

Sulit untuk menjelaskan persyaratan kemurnian mutlak karena mereka bergantung pada

tujuan penggunaan biofarmasetik, dosis, perbandingan risiko-manfaat, dll. Tabel 1.19

menggambarkan nilai perkiraan kemurnian yang dimaksudkan sebagai pedoman umum.

Agregat merupakan perhatian penting bagi banyak protein biofarmasetik. Hal ini

ditunjukkan bahwa agregat dapat menginduksi reaksi kekebalan tubuh atau menyebabkan efek

samping lainnya. Selain itu, agregat mungkin merupakan awal terjadinya pengendapan dan

mengurangi umur simpan produk. Akibatnya, kontrol pada persentase dimer, oligomer dan bentuk

agregat yang lebih tinggi sering dan sangat diperlukan. Kebocoran ligan atau bahan kimia lainnya

yang dapat dilepaskan dan terjadi pada media kromatografi dan membran juga menjadi perhatian

penting karena bahan-bahan tersebut bisa imunogenik dan beracun. Kontaminasi virus jelas

merupakan isu penting dan telah bertanggung jawab untuk banyak penyakit iatrogenik, seperti

45

yang terjadi karena produk darah yang terkontaminasi. Sejak penghilangan absolut agen-agen

adventif tidak mungkin dilakukan, terdapat batasan yang didirikan atas dasar analisis resiko-

manfaat. Misalnya, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) menerima kasus satu vaksin yang

merugikan dalam 109 aplikasi - maka, nilai probabilitas 10-9 yang disarankan dalam Tabel 1.19.

Dalam prakteknya, kesulitan untuk mencapai probabilitas rendah seperti ini, tentu saja, tergantung

pada dosis. Sebagai contoh, tingkat umum set 10 pg DNA per dosis relatif mudah untuk mencapai

untuk vaksin Hepatitis B, di mana satu dosis mungkin berisi hanya sekitar 12 g protein. Di sisiμ

lain, persyaratan seperti itu mungkin agak sulit untuk bertemu dalam kasus antibodi rekombinan,

di mana satu dosis dapat terdiri dari sebanyak 500 mg protein.

Seperti telah disebutkan sebelumnya, biofarmasetik kebanyakan tidak sepenuhnya

didefinisikan sebagai entitas molekul individu, mereka terdiri dari sejumlah besar isoform serupa

atau bervariasi (beberapa produk antibodi rekombinan berisi 200 varian yang diidentifikasi).

Karena aktivitas biologis dan farmakologis dapat bervariasi di antara isoform yang berbeda, untuk

itu penting untuk menjaga distribusi varian dalam rentang yang dapat diterima. Karena

kompleksitas sistem bioproduksi, konsistensi yang sama juga harus dipertahankan untuk profil

pengotor seperti yang ditentukan dari tes analitis, untuk menjamin keamanan produk. Akhirnya,

sistem pengujian harus ditetapkan untuk mengendalikan potensi in vitro dan, jika perlu, in vivo.

46

Hormon / Insulin

Teknologi Pemisahan pada Obat

Hormon adalah unsur kimia yang mengatur efek metabolisme dan aktivitas organ. Bekerja

sama dengan sistem saraf, mengkoordinasikan semua fungsi tubuh. Sebuah mekanisme kontrol

yang rumit yang memastikan interaksi hormon pada fungsi tubuh. Teknologi pemisahan GEA

memainkan peran penting dalam produksi hormon, misalnya insulin.

Diabetes merupakan penyakit gangguan metabolik yang ditandai dengan gula darah

(glukosa) tinggi, yang disebabkan dari kerusakan sekresi insulin sehingga tubuh tidak mampu

memproduksi atau menggunakan insulin untuk mengubah gula dan makanan lainnya menjadi

energi. Bila menderita diabetes, tubuh pastinya tidak membuat cukup insulin atau tidak dapat

menggunakan insulin sendiri sebagaimana mestinya, atau keduanya. Sekitar 150 juta orang di

seluruh dunia saat ini menderita gangguan metabolik ini. Mereka harus menyuntikkan insulin

tambahan sehari-hari untuk mencegah penyakit kardiovaskular atau ginjal yang serius.

Mesin pemisah dari GEA Westfalia Separator Group memainkan peranan penting dalam

proses produksi. Pemisah nosel beroperasi dalam proses seperti yang digambarkan, di mana bahan

padat diekstrak terus menerus dengan konsentrasi konstan. Produksi biosintesis insulin manusia

dikonduksi oleh bakteri atau ragi. Setelah fermentasi, atau konversi bahan baku kimia oleh mikro-

organisme, biomassa diekstraksi oleh pemisah nozzle. Tahap selanjutnya, bahan aktif dicuci dan

47

dipekatkan. Mesin GEA Westfalia Separator Grup juga digunakan dalam tahap kristalisasi

berikutnya, misalnya GEA Westfalia Separator hycon dan pemisah chamber.

Protein Produk farmasi

Bioproduk yang dimodifikasi secara genetik

48

Proses bioteknologi dapat diartikan sebagai proses menggunakan mikroorganisme hasil

rekayasa genetika. Hal ini mampu menghasilkan produk biologi yang tidak dapat dibuat secara

alami. Rantai DNA yang dimodifikasi dan faktor hereditas yang dimanifulasi secara genetik

dikembangbiakkan dengan cara fermentasi pada mikroorganisme. Produk sel yang diinginkan

mungkin terdapat pada intrasel atau ekstrasel.

Produk ekstraseluler

Setelah proses fermentasi, mikroorganisme diekstraksi dengan separator yang beroperasi

secara terus menerus. Untuk meningkatkan hasil, bahan padat dicuci dan diekstraksi lagi dengan

pemusingan. Semua material yang digunakan harus disterilkan pada suhu 121 °C. Untuk menjaga

proses sesederhana mungkin, biomassa dimatikan secara langsung setelah fermentasi dalam

fermentor baik dengan metode panas atau dengan metode kimia. Secara tertutup, uap sentrifus

steril yang bekerja dalam proses ini dapat terhubung ke peralatan lain secara steril.

Produk Intraseluler dan badan inklusi

Dalam proses intraseluler, hal ini dibedakan apakah produk yang diinginkan terkandung

dalam cairan intraseluler atau dalam badan inklusi. Berbeda dengan bioproduksi ekstraseluler,

pada produk intraseluler biomassa dicuci dan terkonsentrasi secara homogen, yaitu sel-sel yang

rusak dan cairan intraseluler dan badan inklusi dilepaskan. Semua ini dipisahkan dari fragmen sel,

dicuci dan terkonsentrasi di tahap selanjutnya dari proses sentrifugal pada GEA Westfalia

Separator Grup. Untuk produk intraseluler yang diperoleh dari cairan sel, padatan diekstraksi

dengan separator yang beroperasi secara terus menerus.

49

Kultur Sel Mamalia

Budidaya kultur sel mamalia menjadi semakin menarik bagi industri farmasi. Dengan sel-

sel, protein dapat diproduksi secara efektif (quartiary struktur). Dibandingkan dengan produksi

oleh mikroorganisme (bakteri / ragi), tahapan hilir pada proses dapat dikurangi secara substansial.

Selain itu, risiko seperti infeksi dalam produksi protein manusia dapat dihindari.

Optimalisasi pada proses produksi

Dalam proses ini, perhatian khusus harus diberikan pada efek dari pengaruh asing seperti

perubahan dari perilaku dan produktivitas sel. Karena keadaan ini, mesin dioptimalkan untuk

mengurangi perubahan pada sel. Proses ini mendapatkan signifikansi untuk industri.

"Hydrohermetic inlet" yang dikembangkan oleh GEA Westfalia Separator Group

mengurangi gaya geser menjadi minimum. Kultur sel khas yang diproses adalah CHO, BHK,

hibridoma dan sel-sel serangga.

Fraksinasi Plasma Darah Manusia

Terapi dengan komponen darah secara eksplisit dapat memerangi berbagai penyakit lama

yang dikembangkan dari transfusi darah sederhana.

50

Fraksinasi merupakan pemisahan protein dalam fase plasma oleh proses fisika dan kimia.

Hal ini didasarkan pada perubahan tiga parameter yaitu temperatur, konsentrasi alkohol dan nilai

pH, yang mempengaruhi kelarutan protein dalam air. Darah manusia terdiri dari fase yang

berwarna merah dan fase plasma yang bersih. Fase yang berwarna merah, sekitar 40 persen dari

darah, dipisahkan oleh sentrifugal khusus dalam kantong donor. Plasma akan membeku setelah

diekstraksi dan diproses oleh peralatan fraksinasi. Hanya sekitar 5 persen dari plasma terdiri dari

komponen yang berharga, yang harus difraksinasi, siisanya adalah air dan elektrolit.

Terapi dengan komponen darah

Zat berharga dapat diekstraksi dari protein. Kriopresipitat, persiapan pembekuan "Faktor

VIII konsentrat" dan kompleks prothrombin (PPSB) dapat diperoleh dari plasma segar secara

langsung setelah mencair. Plasma yang tersisa masuk dalam fraksi etanol dengan proses Cohn, di

mana fraksi individu seperti fibrinogen, globulin gamma, alpha dan beta globulin dan albumin

diendapkan. Partikel-partikel pada plasma protein digunakan untuk mencegah dan mengobati

pendarahan, mengontrol perdarahan selama operasi, berbagai penyakit menular, kekurangan

protein, malnutrisi dan meningkatkan proporsi plasma darah. Setelah fraksinasi, protein

diperlakukan dengan berbagai metode yang spesifik sebelum digunakan untuk tujuan klinis.

Peran kromatografi dalam proses hilir

51

Kromatografi adalah alat yang penting digunakan untuk pemurnian biofarmasi. Hal ini

dapat dijelaskan dengan keuntungan tertentu dari kromatografi disbanding unit operasi lainnya.

Keuntungan kromatografi :

1. Kromatografi memberikan efisiensi pemisahan yang sangat tinggi, yang

memungkinkan campuran yang kompleks dengan sifat molekul yang sangat mirip.

Kolom kromatografi dirancang dapat memiliki efisiensi pemisahan ratusan atau

bahkan ribuan. Sebagai perbandingan, ekstraksi dan filtrasi membran biasanya

terbatas hanya beberapa tahap.

2. Kolom kromatografi dikemas dengan adsorben kapasitas tinggi yang ideal untuk

menangkap molekul dari larutan encer yang dilakukan dalam Bioproses. Dalam

sistem tersebut, ada kontak antara efisiensi larutan volume besar dan adsorben

dengan jumlah kecil yang berada dalam kolom, sehingga menghilangkan

kontaminan yang ada dalam konsentrasi kecil. Sebagai perbandingan, sistem

ekstraksi cair – cair biasanya memerlukan volume yang hampir sama dari dua fase

agar dapat berfungsi dengan baik, sehingga konsentrasi tidak dapat dikerjakan

dengan mudah.

3. Kromatografi dapat dilakukan dalam suatu sistem tertutup dan fase diam dapat

dengan mudah diregenerasi. Sehingga, metode kromatografi cocok dalam banyak

proses manufaktur biofarmasi dan alat yang sesuai dan bahan sudah tersedia.

Kelemahan yang dirasakan dari kromatografi adalah kesulitan dalam skala tinggi pada industri

biofarmasi . Seperti yang ditunjukkan oleh Kelley, proses pemurnian kromatografi cocok dan

secara teknis dan ekonomis untuk pemurnian protein pada skala setinggi 20 ton per tahun.

Meskipun tidak ada produk yang saat ini dibuat pada skala yang besar, popularitas biofarmasi

meningkat dengan cepat sehingga skala tersebut dapat dibayangkan di masa depan.

Larutan yg mengandung beberapa bahan terlarut diinjeksikan pada satu ujung kolom, dan eluent

membawa larutan melewati fase diam ke ujung kolom. Tiap bahan terlarut bergerak pada laju yg

proporsional dengan afinitas relatifnya thd fase diam dan keluar pada ujung kolom sebagai band

yang terpisah. Tergantung pada tipe adsorben atau interaksi bahan terlarut dengan adsorben,

kromatografi dipisahkan atas kromatografi adsorpsi, pertukaran ion, affinitas, dan filtrasi gel.

Kromatografi filtrasi gel

52

Memisahkan protein berdasarkan ukurannya. Pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan

pergerakan relatif dari masing-masing protein melalui suatu molecular sieve. Molecular sieve

yang digunakan biasanya merupakan suatu gel polisakarida dalam bentuk bulatan kecil

(granula). Gel yang sering digunakan : dekstran (polimer gula) yang larut dalam air dan

telah mengalami cross linkage dengan bantuan epikhlorhidrin

Kromatografi penukar ion

Memanfaatkan perbedaan afinitas molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa

tidak reaktif yang berfungsi sebagai pengisi kolom yang muatannya berlawanan. Senyawa

tidak reaktif yang digunakan adalah polimer yang bersifat elastik yang mengandung

kerangka resin sintetik : seperti Polistiren. Pada polimer tersebut dikaitkan gugus

fungsional tertentu yang berupa penukar anion atau kation. Jenis penukar ion yang banyak

digunakan : CMC dan DEAE (dietanolaminoetil) selulosa.

Pemakaian penukar kation dilakukan dengan penambahan

buffer pH 5 dan 10 mM kation (biasanya Na+) untuk

menciptakan kondisi penyerapan yang kuat. Kromatografi

pertukaran ion banyak digunakan dalam pemurnian enzim.

53

Kromatografi afinitas

Kromatografi dengan dasar interaksi biokimia. Pemisahan terjadi karena interaksi spesifik

antara pasangan senyawa enzim dengan substrat, kofaktor, allosterik, efektor atau

inhibitor. Prinsip : ligan yang terikat secara kovalen pada matrik yang tidak larut air akan

menyerap salah satu/beberapa dari komponen campuran. Komponen yang diserap

mempunyai afinitas yang spesifik dengan ligan. Komponen yang tidak memiliki afinitas

akan melaju dan keluar. Molekul yang sudah diserap dilepaskan dengan mengubah kondisi

elusi (dengan larutan bebas ligan, perubahan pH atau kekuatan ion

Keuntungan :

Sifat interaksinya spesifik

Jumlah adsorben yang digunakan dapat disesuaikan dengan zat yang akan

diadsorbsi

Adsorben dapat diregenrasi beberapa kali

Ligan dapat berupa :

Substrat yang termodifikasi

Inhibitor spesifik

Kofaktor

Efektor biologis

54

Sistem kromatografi afinitas yang baik ditentukan oleh jenis matriks dan ligan yang

digunakan. Matriks pengisi kolom : matriks gel dengan sifat :

Mempunyai gugus fungsional yang ampuh untuk bereaksi dengan jenis protein dan

ligan yang diinginkan,

Tahan terhadap mikroba

Stabil,

Tahan lama

Bersifat hidrofilik

Ddapat diregenrasi

Mempunyai kapasitas yang besar terhadap enzim atau ligan,

Dapat melewatkan pelarut,

Kromatogafi interaksi hidrofobik

Protein enzim dapat diikat oleh matriks melalui interaksi hidrofobik pada lingkungan

polaritas dan kekuatan ion yang tinggi. Matriks yang digunakan bersifat non polar,

misalnya sefarosa. Enzim dipisahkan dari ikatan dengan menggunakan eluen yang

polaritasnya diturunkan. Eluen yang digunakan : beberapa jenis garam. Peningkatan

polaritas dapat dilakukan dengan menggunakan konsentrasi ion yang berbeda : Ba2+, Ca2+,

Mg2+, Li+, Cs+, Na+, K+, Rb+ dan NH4 + (untuk kation), atau SCN-, I-, ClO4-, NO3-, Br-,Cl-,

CH3COO-, SO2 2- dan PO43- (untuk anion).

55

Gambar diatas menggambarkan struktur dari proses generik untuk recovery dan

pemurnian produk biologi dengan fermentasi mikroba atau kultur sel hewan. Langkah awal di

mana sel-sel dipisahkan disebut sebagai primary recovery. Langkah ini membutuhkan strategi yang

berbeda tergantung pada apakah produk dikeluarkan ke dalam media kultur atau ditunjukkan

dalam sel, baik sebagai inklusi, dalam bentuk cairan dalam sitosol atau periplasm, atau menuju ke

membrane. Umumnya, kromatografi memainkan peran kecil dalam langkah-langkah awal, yang

difokuskan pada penghilangan padatan suspense seperti sel-sel atau bagian - bagian sel.

Sedimentasi, sentrifugasi, deep bed filtration, dan mikrofiltrasi atau kombinasi biasanya digunakan

untuk langkah-langkah awal. Namun, kromatografi, dilakukan melalui penggunaan fluidized atau

expand bed juga dapat digunakan untuk menangkap langsung protein dikeluarkan dari supernatan

kultur sel.

Dalam sistem ini aliran cairan ke atas melalui dasar awal yang menetap pada partikel

adsorben padat. Kecepatan aliran tertentu expand bed dan partikel menjadi fluidized

memungkinkan membebaskan bagian dari sel dan padatan tersuspensi lainnya sementara produk

secara langsung ditangkap oleh adsorben. Pendekatan ini bisa efektif untuk suspensi encer, tapi

karena ekspand bed langsung dipengaruhi oleh kepadatan dan viskositas, operasi cenderung kritis

56

dipengaruhi oleh variasi dalam komposisi kaldu. Dalam prakteknya, viskositas tinggi dan densitas

sel ditemui dalam teknologi fermentasi modern (sampai 400 mg ml - 1 massa sel basah untuk P.

pastoris atau 200 mg ml -1 untuk E. coli) membuat kesulitan untuk menerapkan pendekatan ini

pada skala industri. Alternatif yang mungkin untuk penangkapan awal tanpa klarifikasi adalah

menggunakan adsorpsi yang memenuhi bed dengan partikel besar, disebut “big beads”. Jika

diameter partikel lebih besar dari 400µm, ruang interpartikel cukup besar untuk bagian sel dan

bagian – bagian sel. Walaupun efisiensi penangkapan berkurang oleh keterbatasan diffusional

dengan diameter partikel yang lebih besar, pengurangan ini dalam langkah dapat memberikan

keuntungan ekonomi secara keseluruhan dan operasional. Tidak seperti expanded bed, proses

packed bed tidak terlalu sensitif untuk memberi viskositas bahan sehingga operasi yang handal

dengan diameter beads besar dapat dicapai bahkan dengan bahan baku kental.

Gambar 1.30 menunjukkan contoh purifikasi dari antibodi rekombinan. Dalam proses ini,

capture direalisasikan menggunakan adsorben selektif yang terdiri dari Protein stafilokokus A

bergerak dalam beads berpori. ligan sangat selektif memungkinkan pemuatan langsung kultur

kaldu ke kolom capture, dan kemudian secara selektif mengikat antibody. Pada tahap selanjutnya,

pemurnian dan polishing dilakukan dengan pertukaran ion dan kolom interaksi hidrofobik untuk

menghilangkan protein sel inang dan varian protein menyimpang. Perhatikan bahwa intermediate,

57

non - kromatografi, langkah ini juga disertakan. Pertama, inkubasi pada pH rendah dan kemudian

langkah 'virus filtration' di implementasikan untuk pemberantasan virus. Kedua, langkah

diafiltration termasuk untuk pertukaran buffer dan formulasi akhir.

PROSES HILIR

1. ENZIM (Proses percepatan sebagai biokatalisator)

Enzim adalah senyawa protein organik kompleks yang terdapat pada setiap sel yang

hidup, dimana didalam sel tersebut enzim akan diproduksi. Enzim yang dihasilkan tersebut

dapat mempercepat proses organik, seperti pemecahan pati, protein lemak, atau gula sebagai

katalis, tanpa ikut dalam proses atau reaksi tersebut.

Produksi enzim intraseluler

Glukosa isomerase adalah contoh dari enzim yang mengubah glukosa menjadi fruktosa dan

merupakan pati yang sangat dibutuhkan dalam industri. Enzim diproduksi dan digunakan

dalam sel-sel mikro-organisme. Untuk digunakan dalam proses tersebut, fase cair dari

kaldu fermentasi dipisahkan dengan sentrifugasi setelah dilakukan fermentasi.

Mikroorganisme yang telah mengalami fermentasi tersebut diperlakukan lebih lanjut

setelah disentrifugasi. Dinding sel dar mikroorganisme akan rusak, Tergantung pada

konsistensi suspensi, suspensi itu diencerkan sebelum fragmen sel dipisahkan oleh mesin

pemisah.

58

Produksi enzim ekstraseluler

Mesin pemisah dan mesin pendekantasi telah didesain sedemikian rupa untuk perlakuan

optimal terhadap pencucian enzim serbuk. Udara yang telah dimurnikan dan disterilkan

disuntikkan ke dalam fermentor yang dilengkapi dengan agitator (pengaduk). Gelembung

udara didistribusikan dalam larutan nutrien, yang terdiri dari karbohidrat, protein, growth

agent, dan nutrisi. Kemudian disterilkan, dipanaskan sampai suhu optimum dan kemudian

diinokulasi dengan kultur yang dimurnikan dari mikroorganisme patogenik.

Mikroorganisme memelihara (memberi makan) diri mereka sendiri dengan mengubah zat

dan sekaligus menghasilkan enzim. Ini kemudian diekskresikan ke kaldu fermentasi.

Setelah fermentasi, mikroorganisme dipisahkan dengan menambahkan flocculent dan

dilakukan sentrifugasi serta dekantasi. Keberhasilan proses tersebut akan diperoleh

peningkatan hasil dan kemurnian dari enzim.

59

2. KULTUR MIKROBA MAKANAN

Kultur mikroba pada makanan dapat dibagi menjadi kultur awal (starter) dan produk

probiotik, keduanya digunakan dalam banyak segmen industri makanan. Kultur Starter

merupakan bagian tetap dari industri makanan, produk medis dan hewan. Mereka bertanggung

jawab atas kualitas produk dan merupakan kontrol dari proses produksi. Produk probiotik juga

penting, karena bersifatnya menguntungkan kesehatan. Pemisahan secara steril menjadi lebih

penting untuk memulihkan produk tersebut, probiotik ini dapat digunakan dalam berbagai cara

dan mungkin hasil dan kekuatan kultur dapat ditingkatkan kembali.

60

Pengkulturan, Pengolahan, dan Pemanenan

Produksi biakan (kultur) biang dapat dibagi menjadi dua bagian. Setelah pengkulturan

di fermentor, bakteri diproses dan dipisahkan dari larutan fermentasi. Ini terdiri dari

laktobasilus dan sisa larutan nutrien termasuk asam laktat yang dihasilkan. Pertama, mikro-

organisme yang telah mengalami fermentasi dipisahkan dari fase cair. Pemisah nozzle dan

piringan pembersih disterilisasi uap. Laktobasilus yang telah mengalami fermentasi kemudian

dilewatkan pada freeze drier. Pada tahap akhir, kultur (biang) yang dikemas dalam kedap udara

dan disimpan pada suhu rendah. Hal tersebut dapat mempertahankan aktivitas probiotik

selama berbulan-bulan sebelum mereka diproses, dikenal sebagai "kultur hidup" dalam yoghurt

probiotik.

3. VAKSIN (Proteksi terhadap penyakit )

Vaksin adalah obat yang mengimunisasi manusia atau hewan terhadap penyakit.

Organisme akan dilindungi berulang kali dengan adanya sejumlah kecil antigen (dalam vaksin)

atau antibodi dalam bentuk serum. Hal ini dilakukan untuk meningkatkan atau mencapai

kekebalan.

Proses pembuatan vaksin

Ketika strain virus yang cocok telah dipilih, kemudian diisolasi dalam ampul dan disimpan

pada suhu -192 ° C dalam nitrogen cair. Pembiakan kemudian dilakukan dimulai dengan

pra-fermentor dan dilanjutkan dalam fermentor utama. Proses fermentasi dilengkapi

dengan larutan nutrien. Nutrien dilarutkan dalam tangki nutrien dan ditambahkan ke

proses fermentasi setelah difiltrasi. Sel-sel tersebut kemudian dipisahkan dari fase clear

dengan sentrifugasi. Vaksin mentah dimasukan ke bejana pencampuran, di mana imunogen

dari vaksin tersebut meningkat dengan penambahan adjuvant, stabilisator dan pengawet

(preservative).

Vaksin hidup (Live-Vaccine)

Salah satu cara adalah terapi dengan vaksin hidup. Ini adalah kuman dengan virus yang

telah dilemahkan atau erat terkait dengan kuman patogen yang biasa disebut antigen, tetapi

tanpa efek patogen. Vaksin ini berasal dari mutasi virus (kuman) dengan tingkat patogen

yang rendah, yang cocok untuk produksi vaksin.

61

Non-live vaksin

Dalam terapi serum, organisme yang terinfeksi diberikan serum yang diproduksi dengan

antibodi dari individu yang diimunisasi. Serum diperoleh dengan membiakkan bakteri

dalam larutan nutrien yang sesuai. Serum yang diproduksi selama fermentasi diekskresikan

oleh sel-sel ke dalam larutan fermentasi. Serum ini kemudian diisolasi dengan memisahkan

biomassa di dalam alat sentrifugasi. Dalam proses produksi vaksin dan sera ini di butuhkan

teknik aseptik dalam prosesnya.

62

63