Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba

Percobaan 06

Restriksi DNA

Nama : Ridwan Muhamad Rifai

NIM : 10408040

Tgl. Percobaan : 14 Oktober 2010

Tgl. Pengumpulan : 21 Oktober 2010

Kelompok : 6

Asisten : Rahma

Program Studi Mikrobiologi

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati

Institut Teknologi Bandung

2010

1. Tujuan

a. Merestriksi suatu fragmen insert dengan panjang 750 bp dari vektor pGEMT-

Easy dengan enzim restriksi EcoRI

2. Metode

Dalam ilmu rekayasa biologi molekuler dikenal suatu metode yang disebut dengan

restriksi DNA. Restriksi DNA adalah proses pemotongan DNA baik untai ganda

maupun untai tunggal dengan menggunakan enzim DNA restriksi (DNA nuklease)

pada sisi spesifik yang dikenal sebagai sisi pengenalan (recognition site). Pada

organisme, enzim ini digunakan untuk mendegradasi fragmen DNA asing yang masuk

ke dalam sel, misalnya DNA virus. DNA organisme itu sendiri aman dari proses

restriksi karena mengalami proses metilasi. (Lodish, 2004)

Enzim restriksi mengenali sisi restriksi dari urutan nukleotidanya yang cocok. Sisi

restriksi ini kebanyakan dan hampir semuanya bersifat palindrom yaitu sama baik

dari forward maupun reverse.

Palindrom pada DNA

Sistem palindrom ini akan menimbulkan pemotongan yang bersifat sticky end.

Namun ada pula enzim restriksi yang memotong sisi pengenalan sebagai blunt end.

Saat ini dikenal empat jenis enzim nuklease restriksi. Keempat jenis enzim ini

digolongkan berdasarkan pada komposisi, jenis kofaktor, target DNA yang akan

dipotong, dan posisi sisi aktif enzim relatof terhadap target DNA. Keempat jenis

enzim tersebut adalah

a. Tipe I, enzim membelah di lokasi terpencil dari sisi pengenalan, membutuhkan

baik ATP dan S-adenosyl-L-methionine berfungsi; protein multifungsi dengan

aktivitas restriksi dan metilasi

b. Tipe II, enzim bersatu dalam atau pada jarak tertentu dari sisi pengenalan, paling

membutuhkan magnesium, fungsi tunggal enzim tidak bergantung metilasi

c. Tipe III, enzim membelah di lokasi jauh dari sisi pengenalan, membutuhkan ATP

(tetapi tidak menghidrolisisnya), S-adenosyl-L-metionin merangsang reaksi namun

tidak diperlukan, ada sebagai bagian dari kompleks modifikasi metilasi

d. Tipe IV, enzim menarget DNA termetilasi

(Bickle,1993)

Pada praktikum ini akan dilakukan restriksi terhadap plasmid pGEMT-Easy dengan

memanfaatkan sisi pengenalan pada EcoRI. Karena itu digunakan enzim restriksi

yang khusus akan memotong sisi pengenalan EcoRI. Bahan-bahan yang digunakan

adalah sebagai berikut.

- Buffer EcoRI

- Enzim EcoRI

- Deion

- Plasmid DNA

Kesemua bahan tersebut dicampur dalam tube dan diinkubasi semalaman dalam es.

Selanjutnya larutan tersebut dielektroforesis dengan terlebih dahulu ditambahkan

loading dye. Selain itu sebagai pembanding, dielektroforesis pula plasmid uncut,

yaitu plasmid yang belum direstriksi. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100V

selama 45 menit. Hasil elektroforesis akan menunjukan apakah plasmid terestriksi

atau tidak dilihata dari ukuran band yang terdeteksi.

3. Hasil Pengamatan

Pada saat pencampuran dan setelah inkubasi tidak ada suatu indikator pun yang

dapat terlihat dari tube, misalnya perubahan warna yang mengindikasikan restriksi

telah selesai. Karena itu digunakan elektroforesis untuk mendeteksi apakah restriksi

berjalan atau tidak. Berikut adalah gambar hasil elektroforesis.

Keterangan:5C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 55U : Hasil Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 56C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 66U : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 6L : Ladder7C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 77U : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 78C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 88U : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 8

4. Pembahasan

Pada praktikum ini dilakukan pemotongan fragmen DNA target dari plasmid pGEMT-

Easy dengan menggunakan enzim restriksi yang memiliki sisi pengenalan pada

fragmen EcoRI. Larutan restriksi ini kemudian dielektroforesis untuk mengetahui

keberhasilan proses. Fragmen yang berhasil direstriksi akan tampak dalam

elektroforesis dan menunjukan band lebih pendek dari band plasmid yang

panjangnya sekitar 3018 bp.

Plasmid yang digunakan dalam percobaan ini adalah plasmid pGEMT-Easy. Plasmid

ini memiliki banyak sisi pengenalan spesifik, salah satunya adalah EcoRI. Berikut

adalah gambar dari pGEMT-Easy.

5 5 6 6 L 7 7 8 8 cut uncut cut uncut cut uncut cut uncut

Terlihat dari gambar di atas ada dua buah sisi pengenalan EcoRI sehingga dengan

penambahan enzim restriksi ini maka akan terisolasi fragmen insert yang berada di

tengah-tengah kedua sisi pengenalan EcoRI ini. Enzim EcoRI memotong DNA dengan

menghasilkan sticky end, yaitu pemotongan yang tak hanya memotong ikatan

fosfodiester dari DNA namun juga ikatan hidrogennya sehingga akan menghasilkan

ujung yang reaktif dan dapat menempel dengan ujung sticky end lainnya.

(Clark,2005)

Untuk mengetahui keberhasilan restriksi maka dilakukan elektroforesis. Ada duam

amcam plasmid yang dielektroforesis, yaitu plasmid yang direstriksi (cut) dan tidak

direstriksi (uncut). Secara teori maka plasmid yang dicut akan menghasilkan dua

buah band, yaitu band plasmid dan band insert. Sedangkan plasmid uncut hanya

akan menghasilkan satu buah band yang menunjukan band plasmid itu sendiri.

Karena plasmid berasal dari praktikum sebelumnya yaitu ligasi, maka dapat diketahui

panjang fragmen DNA insert yaitu sebesar 750 bp. Bila plasmid cut benar benat

terestriksi maka akan ada band 3015 bp dan 750 bp. Sedangkan plasmid uncut akan

menghasilkan band dengan besaran 3715 bp.

6C 6U L

Dari hasil pengamatan terlihat bahwa pada plasmid cut menghasilkan tiga buah band

serta smear. Terdeteksi band dengan besaran 3000 bp yang mengindikasikan band

plasmid namun tidak ada band 750 bp, yang ada hanya smear. Ada pula band di atas

band 3000 bp. Hal ini dapat dijelaskan karena plasmid memiliki bentuk yang

berbeda-beda, ada yang linear, open circular, superkoil, dan lainnya. Band yang

berada di atas band 3000 bp diasumsikan adalah band yang memiliki konformasi

open circular sedangkan band yang berada di bawah band 3000 bp diasumsikan

memiliki konformasi superkoil. Bentuk-bentuk plasmid memengaruhi kecepatan

geraknya dalam menembus gel karena perbedaan sisi kontaknya.

Pada plasmid uncut terlihat adanya dua band, yaitu band 3000 bp dan band di

atasnya. Band 3000 bp mengindikasikan adanya plasmid uncut sedangkan band di

atasnya juga menunjukan plasmid yang sama namun berbeda konformasi yaitu

opencircular yang lebih sulit dalam menembus gel. Mengenai tidak adanya band 750

bp yang mengindikasikan restriksi berhasil dapat disebabkan oleh berbagai asumsi,

salah satunya adalah tidak ditambahkannya enzim restriksi pada larutan sehingga

proses restriksi tak dapat berjalan dan tak menghasilkan fragmen DNA insert.

5. Kesimpulan

a. Tidak terestriksi suatu fragmen insert dengan panjang 750 bp dari vektor

pGEMT-Easy dengan enzim restriksi EcoRI

6. Daftar Pustaka

Bickle, T. A., D. H. Krüger. 1993. Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev. 57 (2):

434–50

Clark, David P.. 2005. Molecular Biology: Understanding the Genetic Revolution. New

York : Elsevier Academic Press

Lodish H, Berk A, Matsudaira P, et al. 2004. Molecular Cell Biology 5th ed. . New

York : W. H. Freeman

PROMEGA. 2009. pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems. USA : PROMEGA