Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi Endonuklease
Progenmol 6 : Restriksi DNA
-
Upload
rifai-ridwan-dieugeste -
Category
Documents
-
view
216 -
download
1
Transcript of Progenmol 6 : Restriksi DNA
Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba
Percobaan 06
Restriksi DNA
Nama : Ridwan Muhamad Rifai
NIM : 10408040
Tgl. Percobaan : 14 Oktober 2010
Tgl. Pengumpulan : 21 Oktober 2010
Kelompok : 6
Asisten : Rahma
Program Studi Mikrobiologi
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati
Institut Teknologi Bandung
2010
1. Tujuan
a. Merestriksi suatu fragmen insert dengan panjang 750 bp dari vektor pGEMT-
Easy dengan enzim restriksi EcoRI
2. Metode
Dalam ilmu rekayasa biologi molekuler dikenal suatu metode yang disebut dengan
restriksi DNA. Restriksi DNA adalah proses pemotongan DNA baik untai ganda
maupun untai tunggal dengan menggunakan enzim DNA restriksi (DNA nuklease)
pada sisi spesifik yang dikenal sebagai sisi pengenalan (recognition site). Pada
organisme, enzim ini digunakan untuk mendegradasi fragmen DNA asing yang masuk
ke dalam sel, misalnya DNA virus. DNA organisme itu sendiri aman dari proses
restriksi karena mengalami proses metilasi. (Lodish, 2004)
Enzim restriksi mengenali sisi restriksi dari urutan nukleotidanya yang cocok. Sisi
restriksi ini kebanyakan dan hampir semuanya bersifat palindrom yaitu sama baik
dari forward maupun reverse.
Palindrom pada DNA
Sistem palindrom ini akan menimbulkan pemotongan yang bersifat sticky end.
Namun ada pula enzim restriksi yang memotong sisi pengenalan sebagai blunt end.
Saat ini dikenal empat jenis enzim nuklease restriksi. Keempat jenis enzim ini
digolongkan berdasarkan pada komposisi, jenis kofaktor, target DNA yang akan
dipotong, dan posisi sisi aktif enzim relatof terhadap target DNA. Keempat jenis
enzim tersebut adalah
a. Tipe I, enzim membelah di lokasi terpencil dari sisi pengenalan, membutuhkan
baik ATP dan S-adenosyl-L-methionine berfungsi; protein multifungsi dengan
aktivitas restriksi dan metilasi
b. Tipe II, enzim bersatu dalam atau pada jarak tertentu dari sisi pengenalan, paling
membutuhkan magnesium, fungsi tunggal enzim tidak bergantung metilasi
c. Tipe III, enzim membelah di lokasi jauh dari sisi pengenalan, membutuhkan ATP
(tetapi tidak menghidrolisisnya), S-adenosyl-L-metionin merangsang reaksi namun
tidak diperlukan, ada sebagai bagian dari kompleks modifikasi metilasi
d. Tipe IV, enzim menarget DNA termetilasi
(Bickle,1993)
Pada praktikum ini akan dilakukan restriksi terhadap plasmid pGEMT-Easy dengan
memanfaatkan sisi pengenalan pada EcoRI. Karena itu digunakan enzim restriksi
yang khusus akan memotong sisi pengenalan EcoRI. Bahan-bahan yang digunakan
adalah sebagai berikut.
- Buffer EcoRI
- Enzim EcoRI
- Deion
- Plasmid DNA
Kesemua bahan tersebut dicampur dalam tube dan diinkubasi semalaman dalam es.
Selanjutnya larutan tersebut dielektroforesis dengan terlebih dahulu ditambahkan
loading dye. Selain itu sebagai pembanding, dielektroforesis pula plasmid uncut,
yaitu plasmid yang belum direstriksi. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100V
selama 45 menit. Hasil elektroforesis akan menunjukan apakah plasmid terestriksi
atau tidak dilihata dari ukuran band yang terdeteksi.
3. Hasil Pengamatan
Pada saat pencampuran dan setelah inkubasi tidak ada suatu indikator pun yang
dapat terlihat dari tube, misalnya perubahan warna yang mengindikasikan restriksi
telah selesai. Karena itu digunakan elektroforesis untuk mendeteksi apakah restriksi
berjalan atau tidak. Berikut adalah gambar hasil elektroforesis.
Keterangan:5C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 55U : Hasil Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 56C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 66U : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 6L : Ladder7C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 77U : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 78C : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 88U : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 8
4. Pembahasan
Pada praktikum ini dilakukan pemotongan fragmen DNA target dari plasmid pGEMT-
Easy dengan menggunakan enzim restriksi yang memiliki sisi pengenalan pada
fragmen EcoRI. Larutan restriksi ini kemudian dielektroforesis untuk mengetahui
keberhasilan proses. Fragmen yang berhasil direstriksi akan tampak dalam
elektroforesis dan menunjukan band lebih pendek dari band plasmid yang
panjangnya sekitar 3018 bp.
Plasmid yang digunakan dalam percobaan ini adalah plasmid pGEMT-Easy. Plasmid
ini memiliki banyak sisi pengenalan spesifik, salah satunya adalah EcoRI. Berikut
adalah gambar dari pGEMT-Easy.
5 5 6 6 L 7 7 8 8 cut uncut cut uncut cut uncut cut uncut
Terlihat dari gambar di atas ada dua buah sisi pengenalan EcoRI sehingga dengan
penambahan enzim restriksi ini maka akan terisolasi fragmen insert yang berada di
tengah-tengah kedua sisi pengenalan EcoRI ini. Enzim EcoRI memotong DNA dengan
menghasilkan sticky end, yaitu pemotongan yang tak hanya memotong ikatan
fosfodiester dari DNA namun juga ikatan hidrogennya sehingga akan menghasilkan
ujung yang reaktif dan dapat menempel dengan ujung sticky end lainnya.
(Clark,2005)
Untuk mengetahui keberhasilan restriksi maka dilakukan elektroforesis. Ada duam
amcam plasmid yang dielektroforesis, yaitu plasmid yang direstriksi (cut) dan tidak
direstriksi (uncut). Secara teori maka plasmid yang dicut akan menghasilkan dua
buah band, yaitu band plasmid dan band insert. Sedangkan plasmid uncut hanya
akan menghasilkan satu buah band yang menunjukan band plasmid itu sendiri.
Karena plasmid berasal dari praktikum sebelumnya yaitu ligasi, maka dapat diketahui
panjang fragmen DNA insert yaitu sebesar 750 bp. Bila plasmid cut benar benat
terestriksi maka akan ada band 3015 bp dan 750 bp. Sedangkan plasmid uncut akan
menghasilkan band dengan besaran 3715 bp.
6C 6U L
Dari hasil pengamatan terlihat bahwa pada plasmid cut menghasilkan tiga buah band
serta smear. Terdeteksi band dengan besaran 3000 bp yang mengindikasikan band
plasmid namun tidak ada band 750 bp, yang ada hanya smear. Ada pula band di atas
band 3000 bp. Hal ini dapat dijelaskan karena plasmid memiliki bentuk yang
berbeda-beda, ada yang linear, open circular, superkoil, dan lainnya. Band yang
berada di atas band 3000 bp diasumsikan adalah band yang memiliki konformasi
open circular sedangkan band yang berada di bawah band 3000 bp diasumsikan
memiliki konformasi superkoil. Bentuk-bentuk plasmid memengaruhi kecepatan
geraknya dalam menembus gel karena perbedaan sisi kontaknya.
Pada plasmid uncut terlihat adanya dua band, yaitu band 3000 bp dan band di
atasnya. Band 3000 bp mengindikasikan adanya plasmid uncut sedangkan band di
atasnya juga menunjukan plasmid yang sama namun berbeda konformasi yaitu
opencircular yang lebih sulit dalam menembus gel. Mengenai tidak adanya band 750
bp yang mengindikasikan restriksi berhasil dapat disebabkan oleh berbagai asumsi,
salah satunya adalah tidak ditambahkannya enzim restriksi pada larutan sehingga
proses restriksi tak dapat berjalan dan tak menghasilkan fragmen DNA insert.
5. Kesimpulan
a. Tidak terestriksi suatu fragmen insert dengan panjang 750 bp dari vektor
pGEMT-Easy dengan enzim restriksi EcoRI
6. Daftar Pustaka
Bickle, T. A., D. H. Krüger. 1993. Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev. 57 (2):
434–50
Clark, David P.. 2005. Molecular Biology: Understanding the Genetic Revolution. New
York : Elsevier Academic Press
Lodish H, Berk A, Matsudaira P, et al. 2004. Molecular Cell Biology 5th ed. . New
York : W. H. Freeman
PROMEGA. 2009. pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems. USA : PROMEGA