Produksi Ekstraseluler Anti-leukemia Enzim L-asparaginase dari Actinomycetes Laut

oleh solidstate dan Submerged Fermentasi: Pemurnian dan Karakterisasi

abstrak

Tujuan: Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi actinomycetes kelautan, layar

mereka untuk Lasparaginase aktivitas dan karakterisasi enzim.

Metode: actinomycetes Kelautan diisolasi dari sampel sedimen yang diperoleh dari

Tamilnadu dan Kerala di India. Isolat diidentifikasi sebagai aktinomisetes dengan tes

mikroskopis dan biokimia. Produksi L-asparaginase dilakukan di tiga media yang berbeda,

yaitu, solid-state media, Trypton Glukosa Yeast ekstrak (TGY) kaldu dan Trypton Fruktosa

ekstrak Ragi (TFY) kaldu itu enzim dimurnikan untuk homogenitas dekat dengan

pengendapan amonium sulfat, dialisis, filtrasi gel pada Sephadex G-100 kolom dan SDS-

PAGE.

Hasil: Di antara 10 isolat laut mengalami skrining awal, hanya isolat S3, S4 dan K8

menunjukkan potensi L-asparaginase aktivitas. Semua tanah kelautan tiga isolat disintesis

asparaginase dengan hasil berkisar 24,6-49,2 IU / ml. Tanah mengisolasi S3 menunjukkan

produktivitas tertinggi 49,2 IU / ml dengan kandungan protein 65 ug / ml dan aktivitas

optimum pada pH 7,5 dan 50 º C. Nilai Km jelas untuk substrat adalah 25 pM. Mg2 + ion

sedikit menstimulasi aktivitas sementara Cu2 +, Zn2 + dan EDTA telah dihambat.

Kesimpulan: Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktinomisetes laut dapat menjadi sumber

potensi hasil tinggi, substrat yang tinggi spesifisitas L-asparaginase, yang merupakan agen

anti-leukemia.

Kata kunci: L-asparaginase, Solid-state media, TGY kaldu, kaldu TFY, SDS-PAGE, Km

dan Vmax.

PENDAHULUAN

Mikroba laut merupakan sumber potensial untuk bioaktif penting secara komersial

compounds1, 2. Di antara kelautan mikroorganisme, aktinomisetes telah mendapatkan

khusus penting sebagai sumber yang paling ampuh antibiotik dan sekunder bioaktif lainnya

metabolites3. Sementara sebagian besar studi tentang actinomycetes telah berfokus pada

antibiotik produksi, hanya beberapa laporan telah berdiam di mereka enzimatik potential4.

Penemuan L-asparaginase (Lasparaginase aminohydrolase, E.C.3.5.1.1), agen obat untuk

pengobatan tumor ganas, dibuat pada tahun 1922 5. Clementi menunjukkan bahwa marmot

serum berisi aktivitas tinggi dari L-asparaginase5, sementara Mashburn dan Wriston berhasil

dimurnikan Escherichia coli L-asparaginase dan menunjukkan tumor-hambat activity5 nya.

L-asparaginase mengubah L-asparagine untuk Laspartic acid. Sejak beberapa jenis tumor

sel membutuhkan L-asparagine untuk protein sintesis, mereka kehilangan sebuah penting

faktor pertumbuhan di hadapan Lasparaginase. Efektif menipisnya Lasparagine

Hasil di sitotoksisitas untuk leukemia cells5 tapi sejauh ini, tumor aktivitas inhibisi telah

ditunjukkan hanya dengan asparaginases dari E. coli, Erwinia aroideae dan Serratia

marcescens6. Itu administrasi seperti protein enzim untuk durasi yang panjang, secara umum,

menghasilkan sesuai antibodi dalam jaringan, menyebabkan syok anafilaksis atau

netralisasi efek obat. Oleh karena itu, penggunaan Lasparaginase serologis berbeda baru

dengan efek terapi yang sama sangat desirable7. Sampai sekarang, L-asparaginase diproduksi

oleh teknik fermentasi terendam. Namun, solid-state fermentasi (SSF) adalah lebih efektif

teknik sebagai hasil dari produk beberapa kali lebih tinggi dari terendam fermentasi (SF). Ia

juga menawarkan banyak keuntungan lainnya, termasuk resistensi kontaminasi, kemudahan

ekstraksi produk dan sederhana metode untuk mengobati difermentasi residue8.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi Lasparaginase dari aktinomisetes laut

oleh solid-state fermentasi dengan menggunakan bungkil kedelai dan terendam fermentasi

serta parsial pemurnian, dan karakterisasi minyak mentah ekstrak enzim.

EKSPERIMENTAL

Bahan

Sampel sedimen laut dikumpulkan dari situs yang berbeda di Tamilnadu dan Kerala, India

pada kedalaman 10 cm pada Mei 2007 dan ditempatkan dalam kantong polythene yang baru,

dengan menggunakan steril spatula, sebelum analisis laboratorium. Pati, kasein, ekstrak ragi,

pepton, l-asparagin, bungkil kedelai, ekstrak daging sapi, akrilamida, bisacrylamide, bovine

serum albumin dan commassie brilian biru G-250 adalah dibeli dari Hi-media (Mumbai,

India). Sephadex G-100 diperoleh dari Sigma- Aldrich, Jerman, sementara asam

trikloroasetat dibeli dari E. Merck Ltd, Mumbai, India. Semua bahan kimia lainnya yang

analitis kelas dan digunakan tanpa modifikasi lebih lanjut. Pengayaan dan isolasi kelautan

mikroorganisme Satu gram sedimen dipindahkan ke kerucut botol berisi 100 ml steril air laut

broth9 kompleks, pati steril kasein kaldu dan glukosa agar asparagin disusun water10 laut

alami untuk preenrichment yang sampel. Labu adalah diinkubasi pada 30 º C selama 14 hari

dalam shaker inkubator. Sebuah loopful inokulum tersebut dari pra-diperkaya kaldu air laut

yang kompleks, pati kasein kaldu atau glukosa adalah kaldu asparagin melesat pada agar-agar

air laut yang kompleks (SWC), pati kasein agar (SCA) dan glukosa asparagin agar, dan plat

diinkubasi pada 30 º C selama 7 hari. Tunggal diskrit koloni diisolasi dan digunakan untuk

identifikasi. Karakterisasi isolat tanah laut Koloni terisolasi diidentifikasi dengan

menggunakan Standar Internasional Streptomyces Proyek (ISP) procedure10. Morfologi

identifikasi koloni terisolasi dilakukan oleh pewarnaan sederhana, pewarnaan Grams dan

motilitas pengujian dengan menggantung penurunan method11. Karakterisasi biokimia

adalah dengan Produksi melanoid test menggunakan Waksman media pada suhu inkubasi 37

° C selama 4 hari untuk mendeteksi pigmen memproduksi milik isolat; nitrat organik Uji

reduksi dilakukan di organik nitrat kaldu pada suhu inkubasi 37 ° C selama satu minggu

untuk mendeteksi nitrat mengurangi milik isolat; produksi asam Uji dilakukan dalam kaldu

glukosa nutrisi pada suhu inkubasi 20 ° C selama 15 hari untuk mendeteksi fermentasi

glukosa menyebabkan produksi asam; hidrogen sulfida tes produksi dilakukan di SIM Agar

pada suhu inkubasi 37 ° C selama 5 hari, sedangkan uji pencairan gelatin dilakukan di gelatin

nutrisi pada inkubasi suhu 37 ° C selama 24 – 48 jam untuk deteksi gelatin hidrolisis sifat

isolates12. Skrining tanah isolat untuk Lasparaginase produksi dengan cepat-plate assay

Isolat disaring untuk asparaginase Aktivitas menggunakan metode Gulati et al13. Itu media

yang digunakan telah dimodifikasi M-9 Media digabungkan dengan indikator pH (merah

fenol). L-asparaginase aktivitas yang diidentifikasi oleh pembentukan zona merah muda di

sekitar koloni. Dua piring kontrol juga disusun dengan menggunakan dimodifikasi M-9

media - satu adalah tanpa pewarna sementara yang lain adalah tanpa asparagin. Mentah

produksi enzim Enzim kasar disiapkan oleh metode solid-state fermentasi (SSF) dan

terendam fermentasi (SF) Solid-state fermentasi (SSF) metode Media fermentasi terdiri dari 5

g bungkil kedelai dan 10 ml 0,1 M natrium dapar fosfat (pH 7,0) dalam suatu tabung 250 ml.

Para termos yang diautoklaf selama 15 menit pada 121 º C dan tekanan 15 lb, kemudian

didinginkan dan diinokulasi dengan 3 ml dari sebelumnya disiapkan suspensi bakteri. Itu

diinkubasi pada 37 º C selama 4 hari tanpa gemetar dan enzim kasar diendapkan di akhir

fermentasi dengan penambahan 90 ml dari buffer fosfat 0,1 M natrium (pH 7,0) diikuti

dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 20 min 8. Submerged fermentasi (SF) metode

Sejumlah (100ml) Glukosa Trypton Ekstrak ragi (TGY) kaldu (media produksi, pH 7,0) yang

terdiri dari glukosa, 0.1g, K2HPO4, 0,1 g; ekstrak ragi, 0,5 g; Trypton, 0,5 g; air, sampai 100

ml, dan terkandung dalam 250 ml Erlenmeyer termos, diinokulasikan secara terpisah dengan

isolat tanah dan diinkubasi pada - 28 º C dalam shaker inkubator-berosilasi pada 200 putaran /

menit selama 24 jam. Pada akhir periode fermentasi, enzim mentah disiapkan oleh

sentrifugasi pada 10000 rpm selama 20 menit. Supernatan sel-bebas diambil sebagai

enzyme14 mentah. Demikian pula, 100ml Trypton Fruktosa Ragi ekstrak (TFY) kaldu (media

produksi, pH 7,0) terdiri dari Trypton, 0,5 g; ragi ekstrak, 0,5 g, fruktosa, 0,1 g; kalium

dihidrogen fosfat, 0.1g, dan air, untuk 100 ml juga diinokulasi dengan tanah isolat dan

diinkubasi pada - 28 º C dalam shakerincubator berosilasi pada 200 putaran / menit selama 24

jam. Enzim kasar disiapkan oleh sentrifugasi pada 10000 rpm selama 20 min15. Protein

penentuan Kadar protein ditentukan menurut metode Lowry et al16. Sebuah larutan stok

protein standar, bovine serum albumin (BSA), pada konsentrasi 1000 mg / ml adalah dibuat.

Dari solusi ini, 0,2 sampai 1 ml bekerja larutan standar pada konsentrasi 100 mg / ml diambil

dalam tabung reaksi. Itu Volume dibuat sampai dengan 1 ml dengan suling air untuk

memberikan konsentrasi mulai dari 20 sampai 100 mg / ml. 1 ml reagen cocatteau folins

ditambahkan ke masing-masing tabung reaksi. Setelah 30 menit dari inkubasi, absorbansi

diukur pada 660 nm menggunakan UV berkas ganda – terlihat spektrofotometer (model SL

164, Elico, Hyderabad, India), dan kadar protein ditentukan. Penentuan L-asparaginase

aktivitas Metode yang digunakan adalah dasarnya bahwa Mashburn dan Wriston17. Dalam

pengujian ini, laju hidrolisis L-asparagine adalah ditentukan dengan mengukur amonia dirilis

menggunakan reaksi Nessler itu. Campuran dari 0,1 ml ekstrak enzim, 0,2 ml 0,05 M Tris-

HCl buffer (pH 8,6), dan 1,7 ml 0.01M L-asparagine diinkubasi selama 10 menit pada 37 º C.

Reaksi dihentikan dengan penambahan tersebut dari 0,5 ml 1.5M asam trikloroasetat. Setelah

sentrifugasi pada 10000 rpm, 0,5 ml supernatan terdilusi menjadi 7 ml dengan suling air dan

diobati dengan 1 ml yang Nessler reagen. Reaksi warna diizinkan untuk mengembangkan

selama 10 menit dan absorbansi dibaca pada 480 nm dengan spektrofotometer. Itu amonia

yang dibebaskan ini diekstrapolasikan dari kurva yang diperoleh dengan amonium sulfat.

Satu Unit (IU) dari L-asparaginase didefinisikan sebagai bahwa jumlah enzim yang

membebaskan 1 μ mol amonia per menit di bawah assay conditions18. Pemurnian L-

asparaginase dari kelautan actinomycetes L-asparaginase sebagian dimurnikan dengan

menggunakan prosedur berikut: The enzim kasar dibawa ke saturasi 45% dengan amonium

sulfat pada pH 8,4 dan terus semalam di ruang dingin pada 4 º C. Itu setelah mengalami

sentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 menit pada 4 º C. Endapan itu dibuang, sedangkan

supernatan dibawa kejenuhan 85% dengan amonium sulfat dan disentrifugasi pada 8000 rpm

pada 4 º C selama 10 min. Endapan langkah ini adalah dikumpulkan dan disimpan pada 4 º C

6. Dialisis tabung, yang sebelumnya direndam dalam 1M Tris HCl penyangga, digunakan

untuk dialisis dari mengendap. Endapan dilarutkan dalam 1M Tris HCl buffer dan didialisis

terhadap sama penyangga 6. Selanjutnya, didialisis Sampel dimuat ke pra-disetimbangkan

kolom dikemas dengan 0,05 M Tris HCl Sephadex G 100. Itu dielusi dengan 0,05 M Tris

HCl (pH 8,4) buffer yang mengandung 0,1 M KCl. Sebanyak 30 fraksi dikumpulkan di laju

alir dari 5 ml/30 menit. Pecahan menunjukkan aktivitas yang tinggi dikumpulkan dan

digunakan untuk lebih lanjut studies6. Karakterisasi yang dimurnikan secara parsial

Lasparaginase Pengaruh ion pH, suhu dan logam Kegiatan pH profil dimurnikan secara

parsial enzim (pH kisaran 3,5-10,5) telah dipelajari. Buffer asetat (0,1 M, pH berkisar 3,5 -

5,5), 0,1 M dapar fosfat (pH 6,0-8,0 kisaran) dan 0,1 M Tris HCl buffer (pH kisaran 8,5-10,5)

digunakan untuk purpose19 ini. Pengujian itu dilakukan dengan menggunakan 0,1 ml tepat

diencerkan enzim. Aktivitas enzim spesifik adalah dihitung dengan mengukur amonia dirilis,

berdasarkan reaksi Nessler ini, oleh metode Mashburn dan Wriston20 dijelaskan di atas untuk

penentuan Lasparaginase aktivitas. Demikian pula, aktivitas enzim diukur pada berbagai suhu

berkisar antara 30 ° C sampai 100 ° C, dan pada pH optimum dengan menggunakan uji yang

prosedur yang diuraikan above20. Dalam rangka untuk menentukan aktivitas enzim dalam

adanya ion logam yang berbeda (Mg2 +, Cu2 +, Zn2 + dan EDTA), larutan garam yang

berbeda - magnesium sulfat, sulfat tembaga, seng sulfat dan etilena diamina tetraacetic acid

(EDTA) - ditambahkan ke enzim substrat campuran reaksi untuk menghasilkan akhir

konsentrasi 1, 3 dan 10mm, respectively21. Aktivitas spesifik dari masing-masing Sampel

kemudian ditentukan dengan metode dari Mashburn dan Wriston20. Penentuan Km dan

Vmax Ini merupakan salah satu parameter penting untuk mengevaluasi kegunaan potensi

enzim untuk anti-leukemia terapi. Awal kecepatan sampel diperkirakan dalam kisaran L-

asparagine konsentrasi (4 sampai 160 M). Km dan Vmax dihitung dari Lineweaver-Burk

plot18.

HASIL

Pengayaan dan isolasi kelautan actinomycetes di media yang berbeda Dari 20 sampel

sedimen laut diuji, hanya 10 sedimen menunjukkan pertumbuhan pengayaan media. Ini 10

isolat disubkultur dan digunakan untuk studi lebih lanjut. Identifikasi actinomycetes Semua

isolat menghasilkan abu-abu dan putih koloni tanpa pigmentasi dan menunjukkan

pertumbuhan yang cepat dalam waktu dua hari. mereka adalah diidentifikasi sebagai

Streptomyces spp. oleh geser budaya, karakteristik morfologi, fisiologis dan sifat enzimatik,

karbon pemanfaatan dan penggunaan nitrogen. Itu sampel Streptomyces spp yang diisolasi

dari Tamilnadu yang ditunjuk S3, S4 dan S6, sedangkan dari Kerala yang ditunjuk K4 dan

K8. The biokimia karakteristik isolat tanah dirangkum dalam Tabel 1. Screening of L-

asparaginase positif budaya Dari terisolasi Streptomyces spp. Disaring untuk L-asparaginase

aktivitas, hanya S3 dan S4 dari Tamilnadu dan K8 dari Kerala menunjukkan hasil positif

dalam metode uji plate yang cepat. Produksi L-asparaginase Ketiga isolat diperiksa disintesis

asparaginase dengan hasil berkisar antara 24.61 ke 49,23 U / ml. Namun, tanah mengisolasi

S3 adalah dipilih untuk studi lebih lanjut karena sifatnya produktivitas tinggi (49,23 U / ml).

protein konsentrasi Konsentrasi protein yang diperoleh dari S3 organisme terisolasi

ditemukan menjadi 65 pg / ml.

PEMBAHASAN

Meskipun L-asparaginase dari bakteri memiliki secara luas ditandai, yang mirip Perhatian

belum dibayarkan kepada actinomycetes23. Sampai saat ini, antibiotik adalah senyawa

bioaktif utama yang diperoleh dari actinomycetes. Namun, kemampuan untuk menghasilkan

berbagai enzim dapat menarik penelitian bunga dalam prokariota. Tanah isolat S3 dan S4 dari

Tamilnadu dan tanah mengisolasi K8 dari Kerala memiliki Lasparaginase aktivitas. Namun

organisme tidak menghasilkan zona merah muda dalam kontrol baik kelompok - M-9 media

yang digabungkan dengan Lasparagine tanpa merah fenol dan M-9 Media dimasukkan tanpa

L-asparagine. Hal ini menunjukkan bahwa pembentukan zona merah muda karena hanya

untuk L-asparaginase produksi. Di antara tiga media yang digunakan, solid-state Media

memberikan aktivitas enzim tertinggi untuk semua 3 isolat. Mekanisme depresi Efek di TGY

dan TFY kaldu diperkirakan hasil dari kehadiran metabolisme glukosa produk. Studi

menunjukkan bahwa dalam kasus asparaginase biosintesis, depresi yang efek karbohidrat

mungkin merupakan fungsi dari kemampuan mereka untuk menurunkan nilai pH fermentasi

media24. Perbandingan terendam dan solid-state fermentasi menunjukkan perbedaan yang

signifikan dalam enzim aktivitas. Hal ini menunjukkan bahwa mungkin ada peningkatan

akumulasi antara metabolit antara substrat dan produk formasi dalam fermentasi terendam.

Ini adalah juga mungkin karena perbedaan dalam fisiologis keadaan mikroorganisme di

fermentasi solid-state dan terendam. Untuk yang terbaik dari pengetahuan kami, ini adalah

yang pertama melaporkan produksi dan parsial pemurnian L-asparaginase dari laut

actinomycetes terisolasi melalui solid state fermentasi (SSF). Pada langkah pemurnian akhir,

enzim menunjukkan aktivitas spesifik 662,61 IU / mg, yang kira-kira 2 kali lipat kemurnian.

Terbaik pH ditemukan menjadi 7,5, yang dekat dengan pH darah, dibandingkan dengan L-

asparaginases dari lainnya bakteri sumber seperti Serratia marcescens, Mycobacterium spp.

Dan Pseudomonas spp menunjukkan pH optimum kisaran 8,0-8,5 15, 20, 27. Pada 50 ° C,

enzim menunjukkan aktivitas optimal. Itu hasil uji sensitivitas Lasparaginase untuk ion logam

berat mengindikasikan bahwa aktivitas enzim tergantung pada kehadiran fungsional sulfhidril

kelompok. Afinitas L-asparaginase ke substrat berhubungan dengan derajat keefektifan

terhadap tumors25. Afinitas substrat Lasparaginase yang diukur dengan nilai Km adalah

ditemukan 2,4 x 10-5 M untuk L-asparagine. Hal ini lebih baik dibandingkan dengan nilai

Km dilaporkan untuk antineoplastik L-asparaginases dari sumber lain seperti E. coli (1,25 x

10 - 5 M) 26, Proteus vulgaris (2,6 x 10-5 M) 27 dan Erwinia aroideae NRRL Q-138 (3,0 x

10-5 M) 27. Linearitas dari Lineweaver-Burk Plot timbal balik ganda menunjukkan bahwa

terisolasi L-asparaginase mengikuti Michaelis-Menten kinetika.

KESIMPULAN

Penelitian ini hanya menunjukkan laut yang sedimen sampel dari Tamilnadu dan Kerala di

India merupakan sumber potensial dari bioaktif aktinomisetes tetapi juga menunjukkan

bahwa perlakuan awal yang berbeda metode dapat berhasil diterapkan untuk isolasi

actinomycetes. Hyperproductive marine actinomycetes dengan tinggi Lasparaginase

Kegiatan itu berhasil diisolasi dengan menggunakan substrat biaya rendah - kacang kedelai

makan. Selanjutnya, terisolasi Lasparaginase tampaknya menjadi menjanjikan agen dan

memerlukan investigasi lebih lanjut dari perusahaan potensi anti-leukemia aktivitas. Atas

dasar dari data yang diperoleh, kelautan aktinomisetes mungkin menjadi sumber yang belum

tergarap dari berpotensi berharga produk dan mungkin juga lebih baik untuk skrining massal

umum bakteri. Akibatnya, kami sarankan enzim yang mendegradasi asam amino harus

mendapat perhatian yang lebih besar sebagai potensi terapi agen.