Print 4 Tugas Makalah Pcr Teknik Lab 2 Maret 2016

8/19/2019 Print 4 Tugas Makalah Pcr Teknik Lab 2 Maret 2016

1/18

PRINSIP PELAKSANAAN POLYMERASE CHAIN

REACTION

Oleh:dr . Karina S.Anastasya

130120150502

Tugas Makalah Teknik LaboratoriuS2 !K"

#$!%&'S!TAS (A")A")A'A$*A$"#$+

201,

I. PENDAHULUAN


2/18

Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang tersusun

dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Fungsi

utama asam nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan informasi

genetik. Informasi ini diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui proses replikasi.

Sel memiliki dua jenis asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic

acid!"A# dan asam ribonukleat (ribonucleic acid$"A#.

I.% !eoxyribonucleic Acid (!"A#

Ada tiga struktur !"A yang dikenal selama ini. Struktur-struktur !"A tersebut

adalah sebagai berikut&

%. Struktur primer !"A tersusun dari monomer-monomer nukleotida. Setiap

nukleotida terdiri dari satu basa nitrogen berupa senya'a purin atau pirimidin, satu

gula pentosa berupa )-deoksi-!-ribosa dalam bentuk furanosa, dan satu molekul

fosfat. *enulisan urutan basa dimulai dari kiri yaitu ujung +) bebas (tidak terikat

nukleotida lain# menuju ujung dengan gugus ) hidroksil bebas atau dengan arah

+)◊) (!arnell, et al., dalam . ilanda, %//0#.

. Struktur sekunder Salah satu sifat biokimia !"A yang menentukan fungsinya

sebagai pemba'a informasi genetik adalah komposisi basa penyusun. *ada tahun

%/0/-%/+, 1d'in 2hargaff menggunakan metode kromatografi untuk pemisahan dan

analisis kuantitatif keempat basa !"A, yang diisolasi dari berbagai organisme.

3esimpulan yang diambil dari data yang terkumpul adalah sebagai berikut &

a. 3omposisi basa !"A ber4ariasi antara spesies yang satu dengan spesies yang

lain.

b. Sampel !"A yang diisolasi dari berbagai jaringan pada spesies yang sama

mempunyai komposisi basa yang sama.

c. 3omposisi !"A pada suatu spesies tidak berubah oleh perubahan usia,

keadaan nutrisi maupun perubahan lingkungan.


3/18

d. 5ampir semua !"A yang diteliti mempunyai jumlah residu adenin yang sama

dengan jumlah residu timin (A6#, dan jumlah residu guanin yang sama dengan

jumlah residu sitosin (762# maka A87 6 28, yang disebut aturan 2harrgaff.

e. !"A yang diekstraksi dari spesies-spesies dengan hubungan kekerabatan yang

dekat mempunyai komposisi basa yang hampir sama. *ada tahun %/+, 9ames !.

:atson dan Francis 5.2. 2rick berhasil menguraikan struktur sekunder !"A yang

berbentuk heliks ganda melalui analisis pola difraksi sinar ; dan membangun model

strukturnya#. 5eliks ganda tersebut tersusun dari dua untai polinukleotida secara

antiparalel (arah +)◊) saling berla'anan#, berputar ke kanan dan melingkari suatu

sumbu.


4/18

9arak di antara kedua untai hanya memungkinkan pemasangan basa purin (lebih besar# dengan

basa pirimidin (lebih kecil#. Adenin berpasangan dengan timin membentuk dua ikatan hidrogen

sedangkan guanin berpasangan dengan sitosin membentuk tiga ikatan hidrogen. !ua ikatan

glikosidik yang mengikat pasangan basa pada cincin gula, tidak persis berhadapan. Akibatnya,

jarak antara unit-unit gula fosfat yang berhadapan sepanjang heliks ganda tidak sama dan

membentuk celah antara yang berbeda, yaitu celah mayor dan celah minor .

. Struktur tersier

3ebanyakan !"A 4irus dan !"A mitokondria merupakan molekul lingkar. 3onformasi

ini terjadi karena kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak berujung.

olekul !"A lingkar tertutup yang diisolasi dari bakteri, 4irus dan mitokondria seringkali

berbentuk superkoil, selain itu !"A dapat berbentuk molekul linier dengan ujung-ujung rantai

yang bebas.

I. $ibonucleic Acid ($"A#

$"A mirip dengan !"A, perbedaanya terletak pada &

%. =asa utama $"A adalah Adenin, 7uanin, Sitosin dan ?

sampai %?.??? pb.

.


5/18

I. !enaturasi

9ika larutan !"A dipanaskan, maka energi termal akan memecahkan ikatan hidrogen dan

ikatan lain yang menentukan kestabilan heliks ganda, akibatnya kedua untai akan memisah atau

mengalami denaturasi.

*roses denaturasi &

(a#. !"A mengalami denaturasi oleh pemanasan

(b#. !"A mengalami denaturasi oleh larutan basa

(c#. $"A mengalami denaturasi menjadi nukleotidanukleotidanya

olekul !"A heliks tunggal dari proses denaturasi cukup stabil. 9ika suhu diturunkan,

molekul tersebut biasanya tidak mengalami renaturasi menjadi molekul !"A heliks ganda asal


6/18

tetapi membentuk pola kusut, namun untai yang saling komplemen dapat mengalami ranaturasi

secara perlahan-lahan. Sifat ini menjadi dasar teknik hibridisasi asam nukleat.

I.0 Sentral !ogma

*ada tahun %/+@, Francis 5. 2rick memperkenalkan diagram alur yang menggambarkan

fungsi !"A dalam perjalanan informasi genetik yang disebut sentral dogma

anda panah yang melingkari !"A menunjukkan bah'a !"A berfungsi sebagai

template atau cetakan bagi replikasi dirinya. anda panah antara !"A dan $"A menunjukkan

pembentukkan molekul $"A dari !"A cetakan (transkripsi# kemudian sintesis protein

ditentukan oleh $"A cetakan melalui proses translasi.

II.Polymerase Chain Reacion

*olymerase 2hain $eacton (*2$# adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi !"A

secara in 4itro. eknik ini pertama kali dikembangkan oleh 3arry ullis pada tahun %/+.

eknik *2$ dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen !"A dalam jumlah jutaan kali

hanya dalam beberapa jam. !engan diketemukannya teknik *2$ di samping juga teknik-teknik


7/18

lain seperti sekuensing !"A, telah mere4olusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang

diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan e4olusi molekular.

II.%*$I"SI*-*$I"SI*


8/18

suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar ++

?2 selama ?-@? detik.

(0# pemanjangan primer (extension#

Setelah primer menempel pada untai !"A target, enCim !"A polimerase akan memanjangkan

sekaligus membentuk !"A yang baru dari gabungan antara primer, !"A cetakan dan

nukleotida.


9/18

3etika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai !"A yang baru dibentuk

akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai !"A menjadi

untai !"A yang baru. *engulangan proses *2$ akan menghasilkan amplifikasi !"A cetakan

baru secara eksponensial

(+# pemantapan (postextension#.

ahap (# sampai dengan (0# merupakan tahapan berulang (siklus#, di mana pada setiap siklus

terjadi duplikasi jumlah !"A. *2$ adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang

berulang (siklus# dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target !"A untai ganda.


10/18

G 6 (n E n#;

G & jumlah amplicon

n & jumlah siklus

; & jumlah molekul !"A templat semula

9ika ; 6 % dan jumlah siklus yang digunakan adalah ?, maka jumlah amplicon yang

diperoleh pada akhir proses *2$ adalah %.?>0 x %?/ . !ari fenomena ini dapat terlihat bah'a

dengan menggunakan teknik *2$ dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen !"A yang

diinginkan (amplicon# secara eksponensial dalam 'aktu relatif singkat.


11/18

*emilihan metode yang digunakan di dalam penyiapan !"A templat tergantung dari

tujuan eksperimen. *embuatan !"A templat dengan menggunakan metode lisis dapat

digunakan secara umum, dan metode ini merupakan cara yang cepat dan sederhana untuk

pendedahan !"A kromosom ataupun !"A plasmid. *rinsip metode lisis adalah perusakan

dinding sel tanpa harus merusak !"A yang diinginkan. Jleh karena itu perusakan dinding

sel umumnya dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis.

3omposisi buffer lisis yang digunakan tergantung dari jenis sampel. =eberapa contoh buffer

lisis yang biasa digunakan mempunyai komposisi sebagai berikut& + m ris-2l p5,+B ?,%

m 1!A p5 ,+B ?,+ H 'een-? dan %?? ugm *roteinase-3 (ditambahkan dalam

keadaan segar#.

=uffer lisis ini umumnya digunakan untuk jenis sampel yang berasal dari biakan, sel-sel

epitel dan sel akar rambut. 2ontoh lain dari buffer lisis adalah buffer lisis 3 yang mempunyai

komposisi sebagai berikut& buffer *2$ (+?m 32l, %?-?m ris-2l dan ,+m g2l #B ?,+

H 'een-? dan %?? ugm *roteinase-3 (ditambahkan dalam keadaan segar#.

=uffer lisis 3 ini biasanya digunakan untuk melisis sampel yang berasal dari sel darah

dan 4irus. Selain dengan cara lisis, penyiapan !"A templat dapat dilakukan dengan cara

mengisolasi !"A kromosom ataupun !"A plasmid menurut metode standar yang tergantung

dari jenis sampel asal !"A tersebut diisolasi. etode isolasi !"A kromosom atau !"A

plasmid memerlukan tahapan yang lebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan !"A

dengan menggunakan metode lisis. *rinsip isolasi !"A kromosom atau !"A plasmid adalah

pemecahan dinding sel, yang diikuti dengan pemisahan !"A kromosom !"A plasmid dari

komponen-komponen lain. !engan demikian akan diperoleh kualitas !"A yang lebih baik dan

murni.

. *rimer

3eberhasilan suatu proses *2$ sangat tergantung dari primer yang digunakan. !i dalam

proses *2$, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen !"A target yang akan

diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-J5# pada ujung ) yang

diperlukan untuk proses eksistensi !"A. *erancangan primer dapat dilakukan berdasarkan

urutan !"A yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju.!ata urutan !"A atau protein bisa didapatkan dari database 7en=ank. Apabila urutan

!"A maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat


12/18

didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan !"A atau protein yang telah diketahui

mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. !alam melakukan perancangan primer

harus dipenuhi kriteria-kriteria sebagai berikut&

a. *anjang primer

!i dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih.


13/18

konsentrasi primer yang digunakan menjadi berkurang selama proses karena terjadinya

mispriming. 3eadaan ini akan berpengaruh pada efisiensi proses *2$.

. d"*s (deoxynucleotide triphosphates#

d"*s merupakan suatu campuran yang terdiri atas dA* (deoksiadenosin trifosfat#,

d* (deoksitimidin trifosfat# , d2* (deoksisitidin trifosfat# dan d7* (deoksiguanosin

trifosfat#. !alam proses *2$ d"*s bertindak sebagai building block !"A yang diperlukan

dalam proses ekstensi !"A.

d"* akan menempel pada gugus EJ5 pada ujung ) dari primer membentuk untai baru

yang komplementer dengan untai !"A templat. 3onsentrasi optimal d"*s untuk proses

*2$ harus ditentukan

0. =uffer *2$ dan g2l

$eaksi *2$ hanya akan berlangsung pada kondisi p5 tertentu. Jleh karena itu untuk

melakukan proses *2$ diperlukan buffer *2$. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin

p5 medium. Selain buffer *2$ diperlukan juga adanya ion g8, ion tersebut berasal dari

berasal g2l . g2l bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi akti4itas

!"A polimerase. !engan adanya g2l ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang

membentuk komplek larut dengan d"* (senya'a antara#. !alam proses *2$ konsentrasi

g2l berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses.


14/18

lebih mudah dilakukan.


15/18

!"A templat berkisar antara / E /+o 2, ini semua tergantung pada panjang !"A

templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen !"A target. Suhu denaturasi

yang terlalu tinggi akan menurunkan akti4itas polimerase !"A yang akan berdampak

pada efisiensi *2$. Selain itu juga dapat merusak !"A templat, sedangkan suhu yang

terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi !"A templat tidak sempurna.

*ada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah /0o 2. Secara umum

suhu annealing yang digunakan berkisar antara > - @?o 2. *emilihan suhu annealing

berkaitan dengan m primer yang digunakan untuk proses *2$. Suhu annealing yang

digunakan dapat dihitung berdasarkan (m E +#o 2 sampai dengan (m 8 +#o 2. !alam

menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada

daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses *2$ akan ditentukan oleh

eksperimen. *roses ekstensi primer pada proses *2$ selalu dilakukan pada suhu >o 2

karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase !"A yang biasa digunakan

untuk proses *2$

0. =uffer *2$=uffer *2$ yang digunakan berkaitan dengan p5 dan kapasitas buffer nya.

!alam perdagangan ada dua jenis buffer *2$ yaitu Mo'-salt buffer (p5 ,>+ dan

kapasitas buffer rendah# dan M5igh-salt buffer (p5 /, dan kapasitas buffer tinggi#.


16/18

*enentuan 'aktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer.


17/18

Ikatan yang terbentuk akan meningkatkan intensitas fluorosensi dari Cat 'arna

bebasnya.*erkiraan


18/18

!AFA$ *

Print 4 Tugas Makalah Pcr Teknik Lab 2 Maret 2016

Documents

Transcript of Print 4 Tugas Makalah Pcr Teknik Lab 2 Maret 2016