PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · ii validasi penetapan kadar campuran...

VALIDASI PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL,

PROPIFENAZON, DAN KAFEIN DENGAN METODE KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Adrian Rendy Irmanto

NIM : 058114010

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :


NIM : 058114010

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008


iii


iv


v

Halaman Persembahan You still are blind if you see a winding road Because there is always a straight way to the point you see

Don’t try to looked so wise Don’t cry ‘cause you’re so right Don’t try with fakes or fears Because you will hate yourself in the end

(Akeboshi)

Kupersembahkan karyaku ini untuk :

Tuhan Yang Maha Kuasa

Papa dan Mamaku tercinta

Adik – adikku

Sahabat – sahabatku

Almamaterku

Serta mereka yang mengasihiku


vi

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah menyertai dan

melimpahkan kasih karunia-Nya kepada penulis, sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi yang berjudul VALIDASI PENETAPAN KADAR

CAMPURAN PARASETAMOL, PROPIFENAZON, DAN KAFEIN

DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Keberhasilan penulis dalam menyusun skripsi ini tidak bisa lepas dari bantuan dan

dukungan dari banyak pihak, baik berupa material, moral, maupun spiritual.

Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Rita Suhadi,M.Si.,Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt, selaku dosen pembimbing dan dosen

penguji. Terima kasih atas segala bimbingan, masukan, waktu, kesabaran

dan perhatiannya yang besar selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. dan Bapak Jeffry Julianus, M.Si. selaku

dosen penguji atas segala masukan berupa kritik dan saran demi

kesempurnaan skripsi ini.

4. Papa, Mama, Vania, Nana, dan Juan atas doa dan dukungannya.

5. Mas Thomas Arian Adrianto, S.Farm. atas bantuan, masukan, dan

diskusinya yang sangat membantu.


vii

6. Mas Bimo, Mas Kunto, Mas Parlan, Mas Wagiran, serta Mas Ottok atas

bantuan dan dukungan selama pelaksanaan penelitian ini

7. My best partner Happy yang sekuat tenaga membantu penelitian ini dari

awal sampai selesai.

8. Sahabat – sahabatku yang terbaik, Dewi ”Sutok”, Mia, Aster, Tyas `Ndut,

dan Widdy terima kasih atas doa dan dukungannya.

9. Rio atas pinjaman scannernya yang sangat membantu penyusunan skripsi

ini.

10. Teman-teman angkatan 2005, terutama kelas FST; Yoyok, Fian, Feli, Lina

Chang, Ong, Totok, Made, Berto, dan Reni, terima kasih atas kebersamaan

selama ini serta doa dan dukungannya.

11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah

banyak membantu.

Semoga Tuhan melimpahkan berkat dan rahmatNya atas segala kebaikan dan

ketulusan yang telah diberikan.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh

karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran demi penyempurnaan skripsi

ini. Akhirnya besar harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi orang banyak.

Yogyakarta, Desember 2008

Penulis


viii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah

Yogyakarta, Desember 2008



LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Adrian Rendy Irmanto

Nomor Mahasiswa : 058114010

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :




Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata

Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain,

mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan

mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis

tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya

selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal 16 Februari 2009

Yang menyatakan

(Adrian Rendy Irmanto)


ix

INTISARI

Salah satu kombinasi zat aktif yang umum digunakan dalam obat

analgesik – antipiretik adalah parasetamol, propifenazon, dan kafein yang

memiliki kelarutan dalam etanol yang hampir sama dan serapan maksimum pada

daerah UV yang berdekatan. Metode yang dapat digunakan untuk memisahkan

sekaligus menetapkan kadar ketiga komponen tersebut yaitu metode KCKT fase

terbalik dengan detektor UV.

Kondisi KCKT fase terbalik yang optimal untuk menetapkan kadar ketiga

komponen tersebut yaitu kolom DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6mm x 25cm;

fase gerak metanol : aquabidest (40 : 60) pada flow rate 2 ml/menit serta detektor

UV pada panjang gelombang 272 nm. Parameter validitas yang diuji meliputi

akurasi, presisi, spesifisitas, linearitas, dan range.

Akurasi ditunjukkan oleh nilai rentang recovery sebesar 95,741 – 98,759%

untuk parasetamol; 97,760 – 101,220% untuk propifenazon; dan 105,556 –

109,397% untuk kafein. Presisi ditunjukkan oleh nilai CV sebesar 0,978% untuk

parasetamol; 1,132% untuk propifenazon; dan 1,128% untuk kafein. Spesifisitas

ditunjukkan oleh profil pemisahan ketiga analit dalam campuran. Linearitas

ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,9999 untuk parasetamol;

0,9991 untuk propifenazon; dan 0,9991 untuk kafein. Range untuk parasetamol

antara 239,3998 – 246,6509 ppm; untuk propifenazon antara 148,3515 – 151,6788

ppm; dan untuk kafein antara 50,0863 – 83,9953 ppm.

Kata kunci : parasetamol, propifenazon, kafein, KCKT, validitas


x

ABSTRACT

One of active ingredients combination commonly used in analgesic–

antipiretic drug is paracetamol, propyphenazone, and caffeine which are have

almost similar solubility in ethanol and maximum absorbance at nearly UV range.

The method which can be used to separate and quantify those three active

ingredients is Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography with

UV detector.

The optimum condition of RP-HPLC for quantifying those three active

ingredients were DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6mm x 25cm column;

methanol : aquabidest (40 : 60) mobile phase at 2 ml/minute flow rate and UV

detector at the wavelength of 272 nm. Validity parameters which were tested

including accuracy, precision, specificity, linearity, and range.

Accuracy was proved by recovery range of 95.741 – 98.759% for

paracetamol, 97.760 – 101.220% for propyphenazone, and 105.556 – 109.397% for

caffeine. Precision was proved by CV of 0.978% for paracetamol; 1.132% for

propyphenazone; and 1.128% for caffeine. Specificity was showed by separation

profile of those three analytes in mixture. Linearity was proved by correlation

coefficient (r) of 0.9999 for paracetamol; 0.9991 for propyphenazone; and 0.9991

for caffeine. Range for paracetamol were between 239.3998 – 246.6509 ppm; for

propyphenazone were between 148.3515 – 151.6788 ppm; and for caffeine were

between 50.0863 – 83.9953 ppm.

Keywords : paracetamol, propyphenazone, caffeine, HPLC, validity.


xi

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL .............................................................................. . i

HALAMAN JUDUL .................................................................................. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. v

PRAKATA .................................................................................................. vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... viii

INTISARI ................................................................................................... ix

ABSTRACT ................................................................................................. x

DAFTAR ISI ............................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ....................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xx

BAB I. PENGANTAR ............................................................................... 1

A. Latar Belakang ………………………………………………………... 1

1. Permasalahan.................................................................................... 2

2. Keaslian penelitian ........................................................................... 3

3. Manfaat penelitian ............................................................................ 4

B. Tujuan Penelitian ................................................................................... 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................ 5

A. Parasetamol............................................................................................ 5

B. Propifenazon ........................................................................................... 5


xii

C. Kafein ..................................................................................................... 6

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.......................................................... 7

1. Peralatan KCKT............................................................................... 7

2. Pembagian Jenis Kromatografi........................................................ 12

3. Kromatografi Partisi Fase Balik....................................................... 14

4. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif................................................... 16

E. Spektrofotemetri Ultraviolet................................................................... 24

F. Kesahihan Metode Analisis Instrumental................................................ 25

1. Akurasi............................................................................................. 26

2. Presisi............................................................................................... 26

3. Limit of Detection............................................................................. 27

4. Limit of Quantitation........................................................................ 27

5. Linieritas........................................................................................... 28

6. Spesifisitas........................................................................................ 28

7. Range………………………………………………………………………. 28

G. Kesalahan Metode Analisis Instrumental……………….…………...... 30

1. Kesalahan Sistematik........................................................................ 30

2. Kesalahan Tidak Sistematik.............................................................. 31

H. Keterangan Empiris …............................................................................. 31

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................. 33

A. Jenis Rancangan Penelitian .................................................................... 33

B. Variabel Penelitian ................................................................................. 33

1. Variabel Utama.................................................................................. 33


xiii

2. Variabel Pengacau Terkendali............................................................ 34

C. Definisi Operasional................................................................................ 34

D. Bahan Penelitian..................................................................................... 34

E. Alat Penelitian ....................................................................................... 35

F. Tata Cara Penelitian ............................................................................... 36

1. Pembuatan Larutan Baku Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein... 36

2. Pembuatan Fase Gerak..................................................................... 37

3. Pengamatan Panjang Gelombang Pengamatan antara Parasetamol,

Propifenazon, dan Kafein dengan Spektrofotometer UV..................... 38

4. Pengamatan Waktu Retensi Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein... 38

5. Optimasi Pemisahan Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein dengan

KCKT.................................................................................................... 39

6. Validasi Metode Analisis................................................................ 39

F. Analisis Hasil........................................................................................ 40

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 42

A. Penyiapan Fase Gerak............................................................................ 42

B. Pembuatan Larutan Baku....................................................................... 43

C. Optimasi Metode KCKT......................................................................... 44

1. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Dengan

Spektofotometri UV........................................................................ 44

2. Pengamatan Waktu Retensi Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein

dan Optimasi Pemisahan Parasetamol, Propifenazon, dan

Kafein.............................................................................................. 46


xiv

D. Penetapan Kadar Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein dalam Sampel

Simulasi..................................................................................................... 60

1. Pembuatan Kurva Baku.................................................................. 60

2. Penetapan Kadar Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein dalam

Campuran Sampel Simulasi dan Validasi Metode.......................... 63

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................... 71

A. Kesimpulan ............................................................................................ 71

B. Saran ....................................................................................................... 72

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 73

LAMPIRAN ................................................................................................ 76

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 109


xv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut.................................................. 11

Tabel II. Parameter analitik.......................…………………………… 29

Tabel III. Pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan

kafein pada berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate

tertentu............................................................................ 47

Tabel IV. Data kurva baku parasetamol………………......................... 60

Tabel V. Data kurva baku propifenazon………………....................... 61

Tabel VI. Data kurva baku kafein………….......................................... 62

Tabel VII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi

kadar rendah………………................................................... 64

Tabel VIII. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi

kadar rendah ……………….................................................. 64

Tabel IX. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar

rendah........………………..................................................... 64

Tabel X. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi

kadar sedang........………………........................................... 66

Tabel XI. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi

kadar sedang........………………........................................... 66

Tabel XII. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar

sedang........……………….................................................... 67

Tabel XIII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi

kadar tinggi........………………........................................... 68


xvi

Tabel XIV. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi

kadar tinggi........………………........................................... 68

Tabel XV. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar

tinggi........………………...................................................... 68


xvii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Rumus struktur parasetamol................................................... 5

Gambar 2. Rumus struktur propifenazon................................................... 6

Gambar 3. Rumus struktur kafein............................................................ 6

Gambar 4. Skema peralatan KCKT......................................................... 7

Gambar 5. Skema pemilihan kolom......................................................... 10

Gambar 6. Pemilihan jenis KCKT............................................................ 13

Gambar 7. Reaksi antara gugus silanol dan gugus klorosilan.................. 15

Gambar 8. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan................................. 15

Gambar 9. Resolusi antara dua peak yang berdekatan............................. 17

Gambar 10. Difusi Eddy............................................................................ 20

Gambar 11. Transfer massa fase diam dan fase gerak................................ 21

Gambar 12. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam................... 22

Gambar 13. Pengukuran peak asymmetry factor dan peak tailing factor..... 23

Gambar14. Spektra panjang gelombang maksimum parasetamol,

propifenazon, dan kafein........................................................ 44

Gambar 15. Gugus non polar pada parasetamol, propifenazon, dan kafein 48

Gambar 16. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan

kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (70 : 30) flow

rate 0,5 ml/menit............................................................ 49


xviii



rate 0,5 ml/menit............................................................ 50



rate 0,5 ml/menit ……………………………………... 51



rate 1,0 ml/menit............................................................ 52

Gambar 20. Penggaraman kafein oleh asam asetat glasial ……………... 53


kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest : asam asetat

glasial (70 : 28,5 : 1,5) flow rate 0,5 ml/menit ……………. 53



glasial (60 : 37 : 3) flow rate 0,5 ml/menit ………………... 54

Gambar 23. Penggaraman propifenazon oleh asam asetat glasial ……… 55



glasial (50 : 49 : 1) flow rate 0,5 ml/menit ………………... 56



rate 1,0 ml/menit ........................................................... 57


xix



rate 1,5 ml/menit ……………………………………... 58



rate 2,0 ml/menit ……………………………………... 59

Gambar 28. Kurva baku parasetamol……………………………...……… 61

Gambar 29. Kurva baku propifenazon…………………………...………... 61

Gambar 30. Kurva baku kafein……..……………………………...……… 62


xx

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis parasetamol............................................. 76

Lampiran 2. Sertifikat analisis propifenazon............................................ 77

Lampiran 3. Sertifikat analisis kafein....................................................... 79

Lampiran 4. Skema pembuatan larutan baku parasetamol dan contoh

perhitungan kadar larutan baku yang digunakan ............... 80

Lampiran 5. Skema pembuatan larutan baku propifenazon dan contoh


Lampiran 6. Skema pembuatan larutan baku kafein dan contoh


Lampiran 7. Kromatogram larutan kurva baku parasetamol…….......... 83

Lampiran 8. Kromatogram larutan kurva baku propifenazon................... 87

Lampiran 9. Kromatogram larutan kurva baku kafein............................ 91

lampiran 10. Skema pembuatan sampel simulasi dan contoh perhitungan

kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam sampel

simulasi.................................................................................. 95

Lampiran 11. Kromatogram sampel...............................................…….. 103


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Dewasa ini, obat seolah – olah sudah menjadi suatu kebutuhan penting

dalam hidup sehari – hari. Hal ini didukung oleh kecenderungan masyarakat untuk

melakukan self medication terutama untuk penyakit pada tingkat keparahan yang

tidak serius (Azizahwati, 2000). Salah satu penyakit yang sering menjadi objek

self medication oleh masyarakat adalah influenza, yang umumnya diobati dengan

obat analgesik – antipiretik.

Salah satu kombinasi zat aktif dalam obat analgesik – antipiretik yang

umum digunakan adalah kombinasi parasetamol, propifenazon, dan kafein.

Kombinasi ini berfungsi untuk mengoptimalkan efek terapi obat serta

meminimalisasi efek merugikan (adverse effect) yang mungkin terjadi bila zat

aktif tersebut dipejankan dalam bentuk tunggal dengan dosis besar untuk

mencapai intensitas efek terapi yang diinginkan (Raffa, 2006).

Kini, banyak obat analgesik – antipiretik yang berupa kombinasi

parasetamol, propifenazon, dan kafein diproduksi dalam berbagai merek dagang,

di antaranya Bodrex migra, Paramex, dan Saridon yang berbentuk tablet.

Banyaknya produksi obat – obat ini perlu diimbangi dengan peningkatan

pengawasan mutu, agar obat yang beredar tersebut dapat dijamin keamanan dan

khasiatnya. Belum adanya suatu metode yang sederhana, cepat, dan tepat yang

dapat dijadikan acuan untuk menetapkan kadar ketiga komponen tersebut secara


2

simultan, mendasari perlunya dilakukan suatu penelitian untuk mendapatkan

kondisi yang optimal untuk menetapkan kadar ketiga komponen tersebut secara

simultan.

Metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dipilih karena dengan

metode ini dapat dilakukan pemisahan zat aktif parasetamol, propifenazon, dan

kafein sekaligus penetapan kadar tiap zat aktif tersebut dalam campuran. Ketiga

komponen zat aktif tersebut memiliki sifat fisika – kimia yang mirip, antara lain

kelarutan dalam etanol yang hampir sama dan serapan maksimum pada daerah

UV yang berdekatan (Clarke, 1986).

Hasil yang diperoleh dari optimasi yang dilakukan merupakan suatu

metode analisa yang baru sehingga perlu dilakukan validasi agar metode ini

memiliki hasil yang dapat dipertanggungjawabkan. Dalam USP 28, parameter

yang diuji pada validasi metode meliputi akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas,

dan range (Anonim, 2005). Melalui penelitian ini, diharapkan dapat diperoleh

informasi mengenai metode analisis multikomponen dari campuran parasetamol,

propifenazon, dan kafein menggunakan kondisi KCKT yang teruji validitasnya.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dapat disusun permasalahan

sebagai berikut :

a. Bagaimanakah kondisi yang optimal untuk memisahkan dan menetapkan kadar

parasetamol, propifenazon, dan kafein secara simultan dengan metode KCKT

fase terbalik menggunakan kolom C18?


3

b. Apakah metode KCKT fase terbalik yang digunakan untuk penetapan kadar

parasetamol, propifenazon, dan kafein secara simultan memiliki akurasi,

presisi, spesifisitas, linieritas, dan range yang baik?

2. Keaslian Penelitian

Analisis multikomponen dari campuran parasetamol, propifenazon, dan

kafein dalam tablet sediaan obat pernah dilakukan oleh Dimitrovska, Trajkovic-

Jolevska, Nancovska, dan Ilievska (1995) dengan metode KLT dan spektrofometri

UV. Penelitian lain yang pernah dilakukan adalah Program Komputer Analisis

Multikomponen Untuk Obat Flu dan Analgesik – Antiinflamasi (Yanuar, Hayun,

Suryadi, Henry, dan Wulandari, 2003) yang menggabungkan teknik

spektrofotometri UV dan matriks matematika, serta Optimasi Penetapan Kadar

Obat Analgesik Multikomponen dengan Metode KCKT Fase Balik (Ivanovic,

Medenica, Malenovic, Jancic, dan Misljenovic, 2003) yang menggunakan fase

gerak metanol : aquabidest pada berbagai rasio berkisar dari (30 : 70 v/v) hingga

(65 : 35 v/v) pada detektor UV 265 nm dan kolom Beckman Ultrasphere ODS

4,6 mm x 150 mm dengan ukuran partikel 5 µm. Namun tidak diketahui kondisi

yang optimal untuk penelitian tersebut karena tidak dipublikasikan secara bebas.

Metode KCKT banyak digunakan untuk menganalisis sediaan obat

multikomponen. Namun validasi penetapan kadar campuran parasetamol,

propifenazon, dan kafein dengan metode KCKT dengan fase gerak, flow rate, dan

kolom DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6 mm x 25 cm P.N 880952-702 yang

digunakan pada penelitian ini belum pernah dilakukan.


4

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat metodologis

Manfaat metodologis dari penelitian ini adalah dapat memberikan sumbangan

ilmiah mengenai metode penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan

kafein secara simultan yang teruji validitasnya.

b. Manfaat praktis

Manfaat praktis dari penelitian ini adalah dapat digunakan sebagai metode

untuk analisis multikomponen dari campuran parasetamol, propifenazon, dan

kafein.

B. Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka dapat

disusun tujuan penelitian ini, yaitu :

1. Mengetahui kondisi yang optimal untuk memisahkan dan menetapkan kadar

parasetamol, propifenazon, dan kafein secara simultan dengan metode KCKT

fase terbalik menggunakan kolom C18.

2. Mengetahui akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas, dan range metode KCKT

fase terbalik yang digunakan untuk penetapan kadar parasetamol,

propifenazon, dan kafein secara simultan.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Parasetamol

Parasetamol mempunyai sinonim asetaminofen dan p-asetamidifenol,

dengan rumus molekul C8H9NO2 dan berat molekul 151,6 (Anonim,1995).

O

NH

OH

Gambar 1. Rumus struktur parasetamol (Anonim,1995)

Menurut Clarke (1986) 1 gram parasetamol larut dalam 70 ml air, 20 ml

air mendidih, 7 ml etanol, dan 50 ml kloroform. Parasetamol larut dalam

dimetilforfamid, metanol, etilendiklorida, aseton, etil asetat, dan natrium

hidroksida 1 N. Parasetamol tidak larut dalam eter, petroleum eter, pentana, dan

benzen (Anonim, 1995). Parasetamol memberikan serapan maksimum dalam

etanol pada panjang gelombang 250 nm dengan nilai A%1

1cm sebesar 913.

Parasetamol memberikan serapan maksimum dalam metanol pada panjang

gelombang 250 nm dengan nilai A%1

1cm sebesar 900 (Autherhoff,1987).

B. Propifenazon

Propifenazon mempunyai sinonim 4-isopropilantipirin, isopropilfenazon,

Baukal, dan Causyth, dengan rumus molekul C14H18N2O dan berat molekul

230,30 (Anonim,1989).


6

O

N

N

Gambar 2. Rumus struktur propifenazon (Anonim,1989)

Propifenazon berbentuk kristal dengan rasa agak pahit. Titik didih

propifenazon pada 1030C. Propifenazon mudah larut dalam alkohol dan eter.

Kelarutan propifenazon dalam air sebesar 0,24 g / 100 ml pada 16,50C (Anonim,

1989). Propifenazon memberikan serapan maksimum dalam etanol pada panjang

gelombang 248 nm dengan nilai A%1

1cm sebesar 483; dan pada panjang gelombang

277 nm dengan nilai A%1

1cm sebesar 493 (Clarke, 1986).

C. Kafein

Kafein mempunyai sinonim 1,3,7-trimetilxantin atau 1,3,7-trimetil-2,6-

dioksopurin, dengan rumus molekul C8H10N4O2. Pemeriannya berupa serbuk

putih atau bentuk jarum mengkilat, biasanya menggumpal, tidak berbau, dan

berasa pahit (Anonim,1995).

O N

N

N

N

O

Gambar 3. Rumus struktur kafein (Anonim,1995)

Menurut Clarke (1986) 1 gram kafein larut dalam 60 ml air, 75 ml etanol,

50 ml aseton, 900 ml eter, dan 8 ml kloroform. Kafein agak sukar larut dalam air

dan dalam etanol, mudah larut dalam kloroform dan sukar larut dalam eter


7

(Anonim, 1995). Kafein memberikan serapan maksimum dalam HCl 0,1 N pada

panjang gelombang 272 nm dengan nilai A%1

1cm sebesar 470. Kafein memberikan

serapan maksimum dalam etanol pada panjang gelombang 273 nm dengan nilai

A%1

1cm sebesar 519 (Clarke, 1986).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Peralatan KCKT

KCKT merupakan kondisi kromatografi yang fase geraknya dialirkan

menuju kolom secara cepat dengan bantuan tekanan dari pompa dan hasilnya

dapat dideteksi dengan detektor (Hendayana, 2006). Tujuan dari KCKT adalah

memperoleh hasil pemisahan yang baik dalam waktu relatif singkat (Mulja dan

Suharman, 1995). Peralatan KCKT biasanya terdiri dari beberapa komponen

seperti yang dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

Gambar 4. Skema Peralatan KCKT (Kazakevich dan Nair, 1996)


8

Menurut Gritter, Bobbit, dan Schwarting (1991), ada tiga variabel utama

pada kondisi KCKT yang harus diperhatikan, yaitu :

a. Detektor

Detektor diperlukan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan yang

terdapat dalam kolom dan untuk mengukur jumlah komponen yang ada dalam

cuplikan (Johnson dan Stevenson, 1978). Beberapa persyaratan detektor

menurut Mulja dan Suharman ialah sensitivitas yang sangat tinggi dengan

rentang sensitivitas 10-8

hingga 10-15

gram solut per detik, kestabilan dan

reprodusibilitas yang sangat baik, memberikan respon yang linier terhadap

konsentrasi solut, dapat bekerja dari temperatur kamar hingga 400 0C, tidak

dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut pengembang, mudah

didapat dan mudah dipakai oleh operator, selektif terhadap macam – macam

linarut dalam pelarut pengembang dan tidak merusak sampel. Detektor untuk

KCKT dibagi dalam dua kategori, yaitu :

1) Bulk Property Detector

Detektor ini merupakan jenis detektor yang mengukur sifat solut dan fase

gerak. Contohnya adalah detektor indeks bias. Detektor indeks bias adalah

suatu jenis detektor universal yang menangkap sinyal pada setiap solut yang

memiliki indeks bias berbeda dengan indeks bias fase gerak. Kelemahannya

adalah indeks bias sangat dipengaruhi oleh suhu. Selain itu, detektor indeks

bias juga kurang sensitif dan tidak cocok untuk kondisi elusi landaian

(Munson, 1991).


9

2) Solute Property Detector

Detektor ini merupakan detektor yang selektif mengukur sifat solut.

Detektor ini lebih sensitif dibanding bulk property detector. Contohnya :

detektor UV-Vis dan detektor fluoresensi. Detektor pada KCKT yang sering

digunakan dalam analisis farmasi ialah detektor UV-Vis. Hal ini disebabkan

kebanyakan senyawa obat memiliki struktur yang dapat menyerap sinar

UV-Vis. Detektor UV digunakan untuk mendeteksi senyawa – senyawa

yang memiliki gugus kromofor dengan atau tanpa adanya gugus auksokrom,

sedangkan detektor visibel digunakan untul mendeteksi senyawa berwarna

yaitu senyawa yang memiliki gugus kromofor yang sangat panjang maupun

merupakan senyawa kompleks (Settle, 1997).

b. Kolom

Kolom pada kondisi KCKT merupakan bagian yang sangat penting karena

pemisahan komponen – komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.

Keberhasilan pemisahan komponen – komponen sampel akan sangat

bergantung pada keadaan kolom (Mulja dan Suharman, 1995). Pemilihan

kolom yang tepat sangat menentukan keberhasilan pemisahan. Berikut ini

merupakan ikhtisar dalam pemilihan kolom untuk kondisi KCKT :


10

Gambar 5. Skema Pemilihan Kolom (Johnson dan Stevenson, 1978)

c. Fase gerak

KCKT dapat dikembangkan dengan pelarut tunggal, campuran pelarut atau

lebih sering dengan campuran pelarut yang terus – menerus berubah

susunannya, biasanya terdiri dari dua atau tiga pelarut dan disebut elusi gradien

(Gritter dkk, 1991). Pada KCKT, fase gerak harus mempunyai sifat : murni dan

tanpa cemaran, tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat

melarutkan sampel, viskositas rendah, memungkinkan memperoleh kembali

sampel dengan mudah (jika diperlukan), dan harganya wajar (Johnson dan

Stevenson, 1978). Pada pemilihan fase gerak yang terpenting adalah kepolaran


11

campuran pelarut yang digunakan yang bersifat linier dengan kepolaran pelarut

murninya. Nilai kepolaran antara dua campuran sembarang pelarut dapat

dihitung dengan persamaan di bawah ini :

P’ = Φa P’a + Φb P’b

dengan Φa dan Φb adalah fraksi volume pelarut a dan b dalam campuran,

sedangkan P’a dan P’b adalah angka P’ pelarut murni (Gritter dkk, 1991).

Berikut adalah beberapa nilai indeks polaritas dari beberapa pelarut yang sering

digunakan :

Tabel 1. Nilai indeks polaritas pelarut

Pelarut Indeks

polaritas

Nilai Eluotropik UV Cut-off (nm)

Alumina C18 Silika

Heksana 0,1 0,01 - 0,00 195

Sikloheksana 0,2 0,04 - - 200

Toluena 2,4 0,29 - 0,22 284

Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212

Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256

Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330

Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205

Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190

Dimetilformamid 6,4 - 7,6 - 268

Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268

Air 10,2 - - - 190

(Snyder, Kirkland, dan Glajch,1997)

Tabel di atas menunjukkan bahwa semakin besar eluotropic values dari pelarut

menunjukkan semakin mudah untuk mengelusi sampel. Semakin besar indeks

polaritas yang dimiliki oleh pelarut maka semakin bersifat polar pelarut yang

digunakan.


12

2. Pembagian jenis kromatografi

Menurut Harris (1999), KCKT dibagi menjadi 5 jenis, yaitu :

a. Kromatografi partisi

Pada kromatografi partisi, fase diam dapat polar atau non polar. Bila fase diam

polar dan fase gerak non polar disebut kromatografi partisi fase normal,

sedangkan bila fase diam non polar dan fase gerak polar dinamakan

kromatografi partisi fase terbalik. Solut berkeseimbangan di antara fase diam

dan fase gerak.

b. Kromatografi adsorpsi

Kromatografi ini menggunakan fase diam padat dan fase gerak cair atau gas.

Solut dapat diadsorpsi pada permukaan partikel padat.

c. Kromatografi pertukaran ion

Anion atau kation diikatkan secara kovalen pada fase diam padat, biasanya

disebut resin. Ion – ion solut muatan berlawanan menyerang fase diam dengan

kekuatan elektrostatik dan fase geraknya berupa zat cair.

d. Kromatografi eksklusi

Pada kromatografi ini tidak ada interaksi tarik – menarik antara fase diam dan

solut. Fase gerak cair atau gas melalui gel berpori. Ukuran pori cukup kecil

untuk mengeluarkan solut yang besar. Molekul solut yang kecil akan masuk ke

dalam pori gel, sedangkan molekul yang besar akan mengalir tanpa memasuki

pori gel.


13

e. Kromatografi afinitas

Digunakan untuk interaksi yang spesifik antara suatu jenis molekul solut dan

sebuah molekul yang lain yang secara kovalen terikat pada fase diam. Misalnya

untuk pemisahan komponen protein.

Pemilihan jenis KCKT yang tepat dan sesuai dengan sampel yang

dipisahkan akan menghasilkan pemisahan yang baik. Gambar berikut merupakan

bagan pendekatan umum dalam memilih jenis KCKT :

Gambar 6. Pemilihan jenis KCKT (Johnson dan Stevenson, 1978)


14

3. Kromatografi partisi fase balik

Istilah fase normal dan fase terbalik digunakan dalam kromatografi partisi

untuk menggambarkan polaritas efektif antara fase diam dan fase gerak (Settle,

1997). Kromatografi dengan fase diam polar dan fase gerak kurang polar atau non

polar disebut kromatografi fase normal. Sebaliknya, kromatografi yang

menggunakan fase diam relatif non polar seperti hidrokarbon dan fase gerak polar

seperti air atau metanol disebut kromatografi fase terbalik (Gritter dkk, 1991).

Menurut Gritter dkk. (1991), konsep pada pengembangan kromatografi

cair partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi cair – cair tergantung pada

kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat. Jika solut ditambahkan ke

dalam kondisi yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan

kondisi dibiarkan seimbang, solut akan tersebar antara kedua fase itu menurut

persamaan :

CmCsK

K adalah koefisien distribusi, Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam dan

Cm adalah konsentrasi solut dalam fase gerak (Skoog, West, dan Holler,1994).

Hal – hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan metode kromatografi

partisi fase balik adalah :

a. Kolom

Kolom yang digunakan pada jenis kromatografi ini ialah kemasan fase terikat.

Penyanga pada kemasan fase terikat terbuat dari silika (Gritter dkk, 1991).

Kemasan fase terikat bersifat stabil karena fase diamnya terikat secara kimia

pada penyangga, sehingga tidak mudah terbawa oleh fase gerak. Kemasan fase


15

terikat mempunyai tipe ikatan siloksan (Si-O-Si-C), dibuat dari reaksi antara

gugus klorosilan dengan gugus silanol yang terdapat pada permukaan silika

gel, seperti pada gambar berikut :

Si OH ClSi(CH3)2R Si O Si(CH3)2R+ + HCl

Gambar 7. Reaksi antara gugus silanol dan gugus klorosilan

Tertambatnya sampel pada fase diam dipengaruhi oleh panjang pendeknya

rantai karbon. Kelebihan kolom dengan rantai karbon yang lebih panjang

adalah sifatnya yang lebih retensif, sehingga sampel yang mempunyai sifat

mirip dengan kolom akan tertambat lebih lama (Skoog dkk, 1994). Menurut

Willard, Merritt, Dean, dan Settle (1988), kolom oktadesilsilan digunakan pada

aplikasi yang membutuhkan retensi yang maksimal, sehingga pemisahan

komponen sampel dapat lebih optimal. Oktadesilsilan dapat dibuat dari reaksi

berikut :

Si OH (CH2)17CH3SiCl Si O Si (CH2)17CH3+ + HCl

Gambar 8. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan (Gritter dkk, 1991)

Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase balik adalah

oktadesilsilan (ODS). Selain ODS, dikenal pula silika dengan substitusi oktil

(C8) (Munson, 1991). Interaksi antara senyawa dengan sisa silanol dapat

mengganggu penggunaan kolom fase terbalik. Akibatnya waktu retensi dari

senyawa standar menjadi lebih sulit untuk ditafsirkan. Dalam beberapa kasus,

interaksi menyebabkan tailing terutama pada pertukaran ion. Lamanya suatu


16

senyawa ditahan akan tergantung pada lipofilisitas dalam kasus kolom fase

terbalik seperti ODS silika gel. Fase gerak yang lebih hidrofil akan lebih cepat

mengelusi suatu senyawa dari kolom fase terbalik (Watson, 1999). Ukuran

kinerja kolom dilihat dari kemampuan kolom untuk memisahkan komponen

senyawa yang akan dianalisis. Batasan yang banyak digunakan adalah sebagai

berikut yaitu jumlah lempeng teoritik (N), dan nilai H atau HETP (Height

Equivalent to a Theoritical Plate) yang merupakan penentu ukuran efisiensi

kolom, faktor resolusi, serta bentuk peak. Kolom yang efisien dapat mencegah

pelebaran peak yang sempit.

b. Fase gerak

Kemampuan KCKT dalam memisahkan banyak senyawa terutama bergantung

pada tambatan sampel dan pemisahan komponen dalam campuran. Pada fase

balik, kandungan utama fase geraknya adalah air. Pelarut yang dapat campur

dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran ditambahkan

untuk mengatur kepolaran fase gerak. Menurut Munson (1991), pemodifikasi

fase gerak yang paling banyak digunakan ialah metanol, asetonitril, dan

tetrahidrofuran. Metanol sering digunakan karena merupakan pelarut yang

sangat murni, mudah didapat, dan berhasil baik pada banyak pemisahan

(Johnson dan Stevenson, 1978).

4. Analisis kualitatif dan analisis kuantitatif

Waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan oleh linarut (solut)

mulai saat injeksi hingga keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor


17

dan dinyatakan sebagai tr ( Mulja dan Suharman, 1995). Waktu retensi ini bersifat

sangat khas untuk senyawa tertentu pada kondisi tertentu (kolom, suhu, laju

aliran, dan sebagainya). Beberapa senyawa mungkin mempunyai waktu retensi

berdekatan tetapi tiap senyawa hanya mempunyai satu waktu retensi saja. Waktu

retensi tidak terpengaruh oleh adanya komponen lain (Nair dan Bonelli, 1988).

Di dalam setiap pemisahan yang dipentingkan adalah kemampuan suatu

kondisi untuk memisahkan dua komponen dalam campuran. Kemampuan tersebut

dinamakan resolusi (Rs) yang didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak

dibagi dengan rata – rata lebar dasar puncak, seperti terlihat pada gambar berikut :

Gambar 9. Resolusi antara dua peak yang berdekatan

(Johnson dan Stevenson, 1991)

Berdasarkan definisi di atas, maka persamaan resolusi adalah sebagai

berikut :

) W(W (1/2)

)(t - )(t Rs

2 1

r1r2

……………………………(1)

Resolusi dikatakan baik apabila nilai Rs ≥ 1,5 yang berarti pemisahan

telah mencapai 99,7% (Sastrohamidjojo, 2002). Resolusi juga dipengaruhi oleh

beberapa faktor yang dapat terlihat pada persamaan berikut :


18

Rs = 4

1 N

1

1'

'

k

k………………………….(2)

a b c

Untuk memperbaiki daya pisah maka faktor – faktor tersebut perlu

dioptimasi. Optimasi efisiensi kolom (a) dilakukan dengan menambah jumlah

lempeng teoritis (N), yaitu dengan memperpanjang kolom (N=L/H) dengan L

adalah panjang kolom yang digunakan, dan N adalah jumlah pelat teoritis dari

suatu kolom sehingga diperoleh puncak yang kecil dan resolusi yang baik.

Optimasi faktor selektivitas (b) dilakukan dengan mengganti pelarut atau

mengubah komposisi pelarut sehingga efisiensi pelarut bertambah dan resolusi

juga meningkat. Optimasi faktor kapasitas (c) dilakukan dengan memvariasi

kekuatan pelarut sehingga fase gerak dapat memberikan harga k’ suatu komponen

sampel menjadi lebih besar atau lebih kecil. Dengan meningkatkan harga k’ maka

akan memperbaiki resolusi (Noegrohati, 1994).

Ada dua teori yang dapat menerangkan tentang efisiensi kolom yaitu :

a. Teori pelat

Teori ini menyatakan bahwa pelat (atau lebih baik disebut HETP) merupakan

tinggi atau panjang dari kolom yang cukup dapat mencapai kesetimbangan

antara solut dalam fase gerak dan fase diam. Semakin banyak pelat yang

dimiliki kolom maka akan memberikan puncak yang lebih sempit atau dapat

dikatakan efisiensi kolom menjadi lebih baik.

HETP = N

L…………………………………(3)


19

HETP adalah ketinggian ekivalen terhadap jumlah pelat teoritis, L adalah

panjang kolom yang digunakan, dan N adalah jumlah pelat teoritis dari suatu

kolom (Sastrohamidjojo, 2002). Menurut Mulja dan Suharman (1995), dapat

dikatakan bahwa makin kecil harga L/N atau makin kecil harga HETP maka

makin baik efisiensi kolom yang digunakan. Konsekuensi dari penambahan

lempeng teoritis yaitu semakin lama sampel untuk terelusi yang berakibat

waktu retensi semakin lama (Skoog dkk, 1994). Daya pisah dapat diperbaiki

apabila efisiensi kolom rendah yang dapat diukur secara kuantitatif seperti pada

persamaan berikut :

N =

2Rt

=

2

16W

tR= 5,54

2

1/2 W

tR………………….. (4)

tr adalah waktu retensi zat analit dan W adalah lebar alas peak kromatogram,

sedangkan W1/2 adalah lebar peak pada setengah tinggi peak (Anonim, 1995).

b. Teori laju

Teori ini didasarkan pada parameter – parameter transfer massa antara fase

diam dan fase gerak, laju difusi solut di sepanjang kolom, laju alir fase gerak,

dan dinamika fase gerak. Ada 3 faktor yang sangat menentukan berdasarkan

teori laju ini yaitu :

1) Difusi Eddy

Difusi ini disebabkan karena banyaknya kemungkinan celah dalam partikel

terpacking yang dapat dilewati oleh molekul solut. Dengan demikian

molekul solut ada yang melewati bagian kolom yang dekat dengan dinding

yang merupakan daerah dengan kerapatan packing rendah sehingga molekul


20

tersebut dapat lebih cepat keluar dari kolom. Sedangkan untuk molekul yang

melalui bagian tengah kolom yang merupakan suatu daerah packing lebih

tinggi akan keluar kolom dengan kecepatan yang lebih rendah. Hal ini

menyebabkan elusi untuk tiap solut menjadi kurang efisien (Hendayana,

2006).

Gambar 10. Difusi Eddy

2) Difusi longitudinal

Difusi ini merupakan gerakan molekul solut yang cenderung untuk berdifusi

ke segala arah secara acak karena adanya perbedaan konsentrasi

(Noegrohati, 1994). Semakin lama solut berada dalam kolom maka semakin

besar pula kecenderungan untuk berdifusi yang dapat mengakibatkan

melebarnya peak kromatogram.

3) Transfer massa non ekuilibrium

Terjadi karena aliran fase gerak yang terlalu cepat sementara sebagian

molekul solut tidak dapat keluar dari fase diam secara cepat sehingga

sebagian solut akan terlambat meninggalkan kolom sehingga dapat terjadi

pelebaran peak sekaligus membuat pemisahan tidak efisien (Hendayana,

2006).


21

A B

Gambar 11. Transfer massa fase diam (A) dan fase gerak (B)

Demikian pula yang terjadi pada cekungan kolom, solut dalam fase diam

bertemu dengan fase gerak yang masih baru, karena laju transfer solut tidak

terjadi dengan segera, masih ada solut yang tertinggal dalam fase diam. Efek

netto yang terjadi dari kedua keadaan ini adalah pelebaran peak solut pada

kedua ujungnya.

Hubungan antara difusi, kesetimbangan dan kecepatan dinyatakan dalam

persamaan Van Deemter yaitu :

HETP = A + B

+ C ...………………………. (5)

HETP adalah tinggi lempeng teoritis. Suku A adalah difusi Eddy. Untuk

mendapatkan harga A yang kecil maka diameter dalam packing kolom harus

dibuat kecil dan kerapatannya seragam. Suku B adalah difusi longitudinal.

Peran difusi ini tidak terlalu penting dalam kromatografi cair tetapi sangat

berperan terutama dalam kromatografi gas. Pelebaran peak dapat dikurangi

dengan meningkatkan flow rate fase gerak dan menjadi penting bila flow rate

fase gerak sangat lambat (Watson, 1999). Tanda berarti kecepatan rata-rata

dari fase gerak. Suku C adalah transfer massa yang merupakan hasil

penjumlahan dari nilai transfer massa fase gerak dan fase diam (Noegrohati,

1994). Laju migrasi solut tergantung pada keadaan ekuilibrium dan kecepatan


22

fase gerak, di samping pelebaran peak yang tergantung pada keadaan aliran

dalam kolom, difusi longitudinal dan laju transfer massa.

Bentuk peak yang dihasilkan dari hasil pemisahan merupakan ukuran

efisiensi kolom. Kolom yang menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetris

selalu lebih disukai. Peak yang kurang simetris dapat mengakibatkan

ketidakakuratan pengukuran resolusi, ketidaktelitian hasil pengukuran kuantitatif,

memperkecil resolusi, dan tidak dapat mendeteksi sinyal yang kecil, dan waktu

retensi tidak reprodusibel (Noegrohati, 1994). Bentuk peak yang tidak simetris

dengan front di belakang turun dengan landai disebut tailing. Sedangkan pada

keadaan sebaliknya di mana pada bagian depan naik dengan landai disebut

fronting atau leading (Kuwana, 1980). Distribusi analit dalam fase gerak dan fase

diam pada saat terjadi tailing dan leading dapat dilihat sebagai berikut :

Gambar 12. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam

Terjadinya peak yang asimetri dapat disebabkan oleh jumlah solut yang

terlalu besar dalam kolom, dekomposisi solut, analit teradsorpsi kuat dalam sisi

aktif fase diam (Watson, 1999).


23

Salah satu cara untuk menilai bentuk peak adalah dengan peak asymmetry

factor (As). Nilai As diukur pada 10% dari tinggi peak. Kolom yang baik akan

menghasilkan nilai As sebesar 0,9 – 1,1 (Snyder dkk, 1997). Harga As > 1 berarti

kromatogram tersebut mengekor. Semakin besar harga As maka makin tidak

efisien kolom yang dipakai (Mulja dan Suharman, 1995). Cara lain untuk menilai

bentuk peak adalah dengan peak tailing factor (PTF). Pengukuran dengan

menggunakan peak tailing factor lebih disukai. Pengukuran dengan PTF diukur

pada 5% dari tinggi peak. Peak asymmetry factor dan peak tailing factor dapat

dihitung seperti disajikan pada gambar di bawah ini. Kedua hal tersebut dapat

disebabkan karena kolom yang buruk, sampel overload, pemilihan pelarut yang

tidak tepat, efek kimia, dan efek tambatan sekunder dari silanol (Snyder dkk,

1997).

Gambar 13. Pengukuran peak asymmetry factor dan peak tailing factor

Analisis kualitatif bertujuan untuk membuktikan ada tidaknya senyawa

tertentu dalam sampel dengan cara membandingkan waktu retensi senyawa murni

dan waktu retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel.


24

Respon yang berupa tinggi peak maupun luas area peak dapat digunakan

untuk analisis kuantitatif. Analisis berdasarkan tinggi peak dapat memberikan

ketelitian yang tinggi jika keadaan kolom tidak menyebabkan pelebaran peak.

Pada kromatogram yang memiliki bentuk peak relatif lebar, analisis berdasarkan

luas area peak lebih disukai dibanding analisis berdasarkan tinggi peak

(Noegrohati,1994).

E. Spektrofotometri Ultraviolet

Spektrofotometri UV-Vis merupakan bagian dari teknik analisis

spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat

(190 – 380 nm) dan sinar tampak (380 – 780 nm) dengan menggunakan instrumen

spektrofotometer. Spektrum UV-Vis merupakan korelasi serapan (sebagai ordinat)

dan panjang gelombang (sebagai absis) berupa pita spektrum. Terbentuknya pita

tersebut disebabkan transisi energi yang tidak sejenis dan terjadi eksitasi

elektronik lebih dari satu macam pada gugus molekul yang kompleks.

Analisis dengan spektrofotometri UV-Vis selalu melibatkan pembacaan

serapan radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang

diteruskan. Keduanya dikenal sebagai serapan (A) tanpa satuan dan transmitan

dengan satuan persen (%T).

Bouguer Lambert dan Beer membuat rumus hubungan antara transmitan

atau serapan terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan

tebal larutan yang mengabsorbsi sebagai :


25

T = II

o

t = 10 –ε.b.c

A = log T

1 = ε.b.c

A = a.b.c

Dengan T adalah persen transmitan, I0 dan It adalah intensitas radiasi yang datang

dan yang diteruskan. A adalah serapan, ε adalah koefisien ekstingsi molar atau

daya serap molar (L mol-1

cm-1

), yaitu serapan suatu larutan dibagi dengan tebal

larutan b dalam cm dan konsentrasi molar c dalam mol. L-1

. a adalah daya serap

dengan satuan L g-1

cm-1

, yang merupakan hasil bagi serapan (A) dibagi dengan

hasil perkalian kadar c yang dinyatakan dalam gram per liter zat dan panjang sel

dalam cm (b). Nilai daya serap molar dapat dihitung dengan persamaan sebagai

berikut :

ε = A cm

%1

1.BM. 10

-1

A cm

%1

1 adalah serapan jenis yaitu serapan dari larutan 1% zat terlarut dalam sel

dengan ketebalan 1 cm. BM adalah massa molekul relatif zat (Mulja dan

Suharman, 1995).

F. Kesahihan Metode Analisis Instrumental

Persoalan analisis terkait dengan kecilnya kadar senyawa yang dianalisis

dan kompleksnya kandungan sampel yang dianalisis. Untuk mengatasi hal

tersebut, metode analisis instrumental yang dipilih harus dapat menyelesaikan

masalah yang ada. Analisis dengan menggunakan instrumen perlu memperhatikan


26

kecermatan dan ketelitian alat. Untuk itu, diperlukan suatu pedoman mengenai

kesahihan metode analisis. Parameter – parameter yang digunakan sebagai

pedoman kesahihan metode analisis antara lain :

1. Akurasi

Akurasi adalah ukuran kedekatan nilai hasil percobaan dengan nilai yang

sesungguhnya, dinyatakan dengan persen recovery (Anonim, 2005). Akurasi

untuk bahan obat dengan kadar kecil disepakati 90 – 110%, akurasi untuk kadar

obat yang lebih besar disepakati 95 – 105%, sedangkan akurasi untuk bahan baku

disepakati 98 – 102%. Sedangkan untuk bioanalisis rentang akurasi 80 – 120%

masih bisa diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).

2. Presisi

Presisi adalah suatu ukuran kedekatan nilai data satu dengan data lainnya

dalam suatu pengukuran pada kondisi analisis yang sama. Menurut United State

Pharmacopeia (USP) 28, presisi didefinisikan sebagai tingkat kesesuaian di antara

masing – masing hasil analisis yang dihasilkan dengan menggunakan metode

analitik secara berulang – ulang untuk pengambilan sampel homogen yang

berulang kali. Presisi seringkali diukur sebagai persen Relative Standard

Deviation (RSD) atau Coefficient of Variation (CV) untuk sejumlah sampel yang

berbeda bermakna secara statistik. Kriteria presisi diberikan jika metode

memberikan nilai CV 2% atau kurang. Akan tetapi nilai ini fleksibel tergantung

pada kadar analit dalam sampel yang dianalisis. Pada kadar 1% atau lebih, standar


27

deviasi relatif antara laboratorium ialah sekitar 2,5%. Pada kadar satu per sejuta,

RSD-nya adalah 16% (Harmita ,2004)

3. Limit of Detection (LOD)

LOD adalah konsentrasi terrendah dari analit yang dapat diukur pada

kondisi percobaan tertentu tetapi tidak perlu secara kuantitatif. LOD merupakan

parameter uji batas pengukuran dan menentukan apakah analit berada di atas atau

di bawah suatu nilai tertentu. Menurut USP 28, untuk metode instrumental, signal

to noise ratio ditentukan dengan membandingkan hasil uji dari sampel yang telah

diketahui konsentrasinya dengan hasil uji blanko dan menetapkan konsentrasi

analit terrendah yang dapat dideteksi. Konsentrasi analit yang mampu

memberikan respon 2-3 kali respon blanko inilah yang kemudian ditetapkan

sebagai LOD.

4. Limit of Quantification (LOQ)

LOQ adalah konsentrasi terrendah dari analit dalam sampel yang dapat

ditentukan dengan presisi dan akurasi yang baik pada kondisi percobaan tertentu

dari suatu metode. LOQ ditentukan dengan membandingkan sinyal terukur dari

sampel dengan konsentrasi analit yang rendah dengan sinyal dari blankonya.

Perbandingan signal to noise yang dapat diterima adalah 10 : 1 (Anonim, 2005).


28

5. Linieritas

Linieritas suatu metode analitik adalah kemampuannya untuk memperoleh

hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi analit pada sampel yang

dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Linieritas yang baik ialah nilai r yang

lebih besar dari nilai r tabel (Snyder dkk,1997). Persyaratan data linieritas yang

bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0.999 (Harmita, 2004).

6. Spesifitas

Spesifitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan

akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel yang mungkin ada dalam

matriks sampel (Mulja dan Hanwar,2003).

7. Range

Range adalah interval antara kadar terrendah sampai kadar tertinggi dari

suatu analit yang masih dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode

tertentu yang masih dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang mencukupi.

Biasanya range memiliki satuan yang sama dengan satuan yang digunakan pada

metode analisis, misalnya persen atau ppm (Anonim, 2005).


29

USP 28 mencantumkan beberapa kategori uji umum yang harus memenuhi

validitas data, yaitu :

a. Kategori I

Meliputi metode analitik yang digunakan untuk mengukur secara kuantitatif

sejumlah besar komponen dari serbuk obat atau senyawa aktif (termasuk

preservatif) dalam sediaan obat jadi.

b. Kategori II

Meliputi metode analitik yang digunakan untuk penentuan kemurnian dalam

serbuk obat atau penentuan senyawa degradasi dalam sediaan obat jadi.

c. Kategori III

Meliputi metode analitik yang digunakan untuk penentuan sifat – sifat khusus

seperti kecepatan disolusi dan pelepasan obat.

d. Kategori IV

Meliputi metode analitik yang digunakan untuk mengidentifikasi sediaan

farmasi.

Tabel II.Parameter Analitik

Karakteristik

Kinerja

Analitik

Kategori

1

Kategori II Kategori

III

Kategori

IV Kualitatif Kuantitatif

Akurasi Ya * Ya * Tidak

Presisi Ya Tidak Ya Ya Tidak

Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya

LOD Tidak Ya Tidak * Tidak

LOQ Tidak Tidak Ya * Tidak

Linieritas Ya Tidak Ya * Tidak

Range Ya * Ya * Tidak

*Mungkin diperlukan, tergantung sifat uji spesifik yang dilakukan

(Anonim, 2005)


30

G. Kesalahan Metode Analisis Instrumental

Kesalahan atau galat pada metode pada umumnya dapat disebabkan oleh

beberapa faktor yaitu metode dan prosedur analisis zat yang ditentukan, instrumen

yang dipakai, dan faktor individu yang mengerjakan. Kesalahan pada analisis

kimia dibagi menjadi dua macam, yaitu :

1. Kesalahan sistematik

Kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur yakni kesalahan yang

menyimpang secara tetap dari harga kadar yang sebenarnya karena proses

pelaksanaan prosedur analisis. Kesalahan sistematik ini dibagi lagi menjadi dua

macam berdasarkan sumber kesalahan, yaitu :

a. Kesalahan pada metode analisis

Kesalahan ini agak sulit dideteksi karena kesalahan pada metode analisis ini

antara lain disebabkan sifat fisika dan kimia dari reagen yang dipakai tidak

memadai secara ideal. Demikian juga dapat disebabkan oleh reaksi yang tidak

sempurna.

b. Kesalahan individual

Kesalahan ini timbul karena kesalahan individu dalam mengamati dan

membaca instrumen yang sedang dikerjakan.


31

Untuk menghindari kemungkinan terjadinya kesalahan sistematik ini ada

beberapa hal yang harus diperhatkan, yaitu :

1) Kalibrasi instrumen secara berkala

2) Pemilihan metode dan prosedur standar dari badan resmi

3) Pemakaian bahan kimia yang memiliki derajat pro analysis

4) Peningkatan pengetahuan dan kemampuan dari individu yang bekerja di

laboratorium analisis.

2. Kesalahan tidak sistematik

Kesalahan ini disebut juga kesalahan acak yaitu penyimpangan yang tidak

tetap dari hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan oleh fluktuasi

dari instrumen yang digunakan. Kesalahan acak yang disebabkan oleh derau

instrumen tidak dapat diketahui penyebabnya dan juga tidak dikontrol. Pemakaian

instrumen dengan kualitas baik akan dapat menekan harga galat tidak sistematik

ini. Demikian juga pemakaian ilmu statistik untuk perhitungan hasil analisis

diharapkan dapat memperkecil perbedaan dalam menentukan kadar dengan harga

yang sebenarnya (Mulja dan Suharman, 1995).

H. Keterangan Empiris

Salah satu kombinasi obat yang banyak beredar adalah campuran dari

parasetamol, propifenazon, dan kafein yang memiliki kelarutan dalam etanol yang

mirip dan serapan maksimum pada panjang gelombang yang berdekatan sehingga

sulit dipisahkan dengan alat sederhana. KCKT dapat digunakan untuk


32

memisahkan sekaligus menetapkan kadar dari tiap komponen yang sudah

dipisahkan. Campuran ketiganya tersebut akan ditetapkan dengan menggunakan

kondisi KCKT yang optimal. Parameter validitas metode yang diuji meliputi

akurasi (ditinjau dari nilai recovery), presisi (ditinjau dari nilai CV), spesifisitas

(ditinjau dari profil pemisahan pada kromatogram yang menunjukkan pemisahan

hingga baseline untuk ketiga analit), linieritas (ditunjukkan oleh nilai koefisien

korelasi (r) yang diperoleh dari penentuan persamaan kurva baku dengan analisis

regresi linear), dan range (ditunjukkan dari rentang kadar analit terukur yang

memenuhi parameter akurasi dan presisi)


33

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental

deskriptif dengan dua variabel bebas dalam perlakuan pada subyek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel utama

a. Variabel bebas

1) Jenis dan perbandingan fase gerak yaitu metanol : aquabidest dan

metanol : aquabidest : asam asetat glasial.

2) Flow rate fase gerak yang digunakan.

b. Variabel tergantung

1) Pemisahan peak dari parasetamol, propifenazon, dan kafein yang dapat

dilihat dari waktu retensi masing – masing.

2) Validitas metode yang ditinjau dari akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas,

dan range penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam

sampel simulasi.


34

2. Variabel pengacau terkendali

Variabel pengacau terkendali pada percobaan ialah kemurnian pelarut dan

kemurnian senyawa baku yang digunakan. Untuk mengatasinya digunakan pelarut

pro analysi dan bahan kualitas working standard.

C. Definisi Operasional

1. Larutan induk sampel simulasi adalah campuran 50 mg parasetamol, 30 mg

propifenazon, dan 10 mg kafein yang dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.

2. Sampel simulasi kadar rendah adalah campuran parasetamol, propifenazon, dan

kafein yang dibuat dari larutan induk sampel simulasi yang dipipet sebanyak

125 µl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml.

3. Sampel simulasi kadar sedang adalah campuran parasetamol, propifenazon,

dan kafein yang dibuat dari larutan induk sampel simulasi yang dipipet

sebanyak 500 µl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml.

4. Sampel simulasi kadar tinggi adalah campuran parasetamol, propifenazon, dan

kafein yang dibuat dari larutan induk sampel simulasi yang dipipet sebanyak

750 µl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml.

5. Parameter validitas metode analisis yang digunakan yaitu akurasi, presisi,

spesifisitas, linieritas, dan range.

D. Bahan – bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah parasetamol kualitas

working standard (Wenzhou Pharmaceutical Factory), propifenazon kualitas


35

working standard (Vani Chemicals & Intermediates Limited), kafein kualitas

working standard (Brataco Chemika), metanol p.a. (E. Merck), asam asetat glasial

p.a (E.Merck), dan aquabidest (Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma).

E. Alat – Alat Penelitian

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1. Spektrofotometer UV/Vis merek Perkin Elmer Lambda 20

2. Kuvet.

3. Seperangkat sistem KCKT yang terdiri dari :

a. Pompa merek Shimadzu LC-10 AD No. C20293309457 J2.

b. Detektor UV/Vis merek Shimadzu SPD-10 AV No. C20343503697 KG.

c. CBM 101 merek Shimadzu No. C50363502311.

d. Seperangkat komputer merek ACER.

e. Printer merek Hewlett Packard Deskjet 670 C.

f. Injektor jenis katup suntik model 77251.

g. Kolom ODS merek DuPont Instruments Zorbax berdimensi 4,6 mm x 25

cm P.N 880952-702.

4. Syringe merek Hamilton Part. No. 2933087.

5. Alat degasing ultrasonik merek Retsch T640 No. 935922012 EY.

6. Penyaring Whatmann anorganik dan organik.

7. Membrane filter holder merek Whatmann kapasitas 300 ml.

8. Neraca analitik merek Scaltec SBC 22.


36

9. Vakum merek Gast DOA-P104-BN.

10. Penyaring Milipore.

11. Mikropipet 100 – 1000 µl merek Biohit.

12. Seperangkat alat gelas.

F. Tatacara Penelitian

1. Pembuatan larutan baku parasetamol, propifenazon, dan kafein

a. Larutan baku parasetamol

1) Pembuatan larutan baku induk parasetamol

Lebih kurang 50 mg baku parasetamol yang ditimbang seksama

dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.

2) Pembuatan seri larutan baku parasetamol

Larutan baku induk parasetamol dari langkah di atas dipipet 125 µl;

250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan 750 µl lalu dimasukkan dalam labu

ukur 10 ml dan diencerkan dengan metanol hingga tanda sehingga

didapatkan kadar 62,5 ppm; 125,0 ppm; 187,5 ppm; 250,0 ppm; 312,5

ppm; dan 375,0 ppm.

b. Larutan baku propifenazon

1) Pembuatan larutan baku induk propifenazon

Lebih kurang 30 mg baku propifenazon yang ditimbang seksama

dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.


37

2) Pembuatan seri larutan baku propifenazon

Larutan baku induk propifenazon dari langkah di atas dipipet 125 µl;

250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan 750 µl lalu dimasukkan dalam labu

ukur 10 ml dan diencerkan dengan metanol hingga tanda sehingga

didapatkan kadar 37,5 ppm; 75,0 ppm; 112,5 ppm; 150,0 ppm; 187,5

ppm; dan 225,0 ppm.

c. Larutan baku kafein

1) Pembuatan larutan baku induk kafein

Lebih kurang 10 mg baku kafein yang ditimbang seksama dilarutkan

dalam metanol hingga 10 ml.

2) Pembuatan seri larutan baku kafein

Larutan baku induk kafein dari langkah di atas dipipet 125 µl; 250 µl;

375 µl; 500 µl; 625 µl; dan 750 µl lalu dimasukkan dalam labu ukur 10

ml dan diencerkan dengan metanol hingga tanda sehingga didapatkan

kadar 12,5 ppm; 25,0 ppm; 37,5 ppm; 50,0 ppm; 62,5 ppm; dan 75,0

ppm.

2. Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ialah campuran :

a. Metanol : aquabidest dengan perbandingan 40 : 60; 50 : 50; 60 : 40; dan

70 : 30.

b. Metanol : aquabidest : asam asetat glasial dengan perbandingan 50 : 49 : 1;

60 : 37 : 3; dan 70 : 28,5 : 1,5.


38

Masing – masing perbandingan fase gerak dibuat sesuai dengan volume yang

dibutuhkan kemudian digojog dan disaring dengan penyaring Whatman anorganik

dengan bantuan pompa vakum. Fase gerak kemudian dihilangkan gelembungnya

dengan degassing selama 15 menit.

3. Penentuan panjang gelombang pengamatan antara parasetamol,

propifenazon, dan kafein dengan spektrofotometer UV

Lebih kurang 10 mg baku parasetamol, propifenazon, dan kafein yang

ditimbang seksama dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml. Larutan tersebut

diencerkan hingga kadar 10 ppm untuk tiap zat dan dibaca absorbansinya pada

panjang gelombang 200 – 300 nm dengan spektrofotometer UV. Berdasarkan

kurva panjang gelombang vs absorbansi parasetamol, propifenazon, dan kafein

yang diperoleh, diamati dan ditentukan panjang gelombang overlapping.

4. Pengamatan waktu retensi parasetamol. propifenazon, dan kafein

Larutan baku induk parasetamol, propifenazon, dan kafein masing –

masing dipipet 500 µl lalu diencerkan dengan metanol hingga 10 ml. Larutan

hasil pengenceran tiap zat tersebut disaring dengan millipore dan dihilangkan

gelembungnya dengan degassing selama 15 menit. Kemudian sebanyak 40 μl

larutan tersebut disuntikkan ke dalam KCKT dengan kolom ODS

(4,6 mm x 25 cm); fase gerak yang telah dibuat pada langkah no.2 dan flow rate

tertentu pada panjang gelombang pengamatan yaitu 272 nm. Waktu retensi tiap

analit diamati dari kromatogram yang didapat.


39

5. Optimasi pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein

Lebih kurang 50 mg parasetamol, 30 mg propifenazon, dan 10 mg kafein

ditimbang seksama, lalu dicampur dan dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.

Larutan tersebut dipipet 500 μl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml,

sehingga didapatkan larutan campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein

dengan perbandingan kadar masing – masing ialah 250 ppm : 150 ppm : 50 ppm.

Kemudian larutan tersebut disaring dengan millipore dan dihilangkan

gelembungnya dengan degassing selama 15 menit. Sebanyak 40 μl larutan

campuran disuntikkan ke dalam KCKT dengan kolom ODS (4,6 mm x 25 cm);

fase gerak yang telah dibuat pada langkah no.2 dan flow rate tertentu pada

panjang gelombang pengamatan yaitu 272 nm. Dari hasil kromatogram diamati

waktu retensi masing – masing senyawa pada berbagai perbandingan fase gerak

serta flow rate yang digunakan.

6. Validasi metode analisis

a. Pembuatan kurva baku

Seri kadar larutan baku parasetamol, propifenazon, dan kafein dari langkah

no. 1 yang telah disaring dengan penyaring milipore dan dihilangkan

gelembungnya dengan degassing selama 15 menit diinjeksikan pada sistem

KCKT dengan fase gerak metanol : aquabidest dengan rasio 40 : 60 dan

flow rate 2 ml/menit. AUC (Area Under Curve) untuk tiap peak yang

muncul diamati dari kromatogram yang didapat. Lalu, ditentukan persamaan

regresi linear antara kadar tiap analit terhadap AUC.


40

b. Pembuatan larutan induk campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein

Lebih kurang 50 mg parasetamol, 30 mg propifenazon, dan 10 mg kafein

ditimbang seksama, dicampur, dan dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.

c. Penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam campuran

Larutan campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein dari langkah

no.6b. dipipet 125 μl; 500 μl; dan 750 μl dan diencerkan dengan metanol

hingga 10 ml. Larutan tersebut disaring dengan milipore dan dihilangkan

gelembungnya dengan degassing selama 15 menit, lalu diinjeksikan pada

sistem KCKT dengan fase gerak metanol : aquabidest dengan rasio 40 : 60

dan flow rate 2 ml/menit. AUC (Area Under Curve) tiap peak yang muncul

diamati dari kromatogram yang didapat. Kemudian kadar analit dihitung

dengan memasukkan nilai AUC yang diperoleh dari tiap analit ke dalam

persamaan kurva baku yang telah diperoleh dari analisis regresi linear.

G. Analisis Hasil

Kondisi KCKT yang optimal untuk mendapatkan pemisahan yang baik

dari parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam campuran dapat dilihat dari

profil pemisahan dari kromatogram yang diperoleh dan perhitungan resolusi

(jarak antara dua puncak dibagi dengan rata – rata lebar dasar puncak) dengan

rumus sebagai berikut :

) W(W (1/2)

)(t - )(t Rs

2 1

r1r2


41

Hasil optimasi ini lalu digunakan untuk menentukan kesahihan metode,

yang dinyatakan dengan parameter berikut :

1. Akurasi ditentukan dengan nilai recovery

Recovery = 100%x diketahuikadar

kurkadar teru

2. Presisi diukur dengan Coefficient of variance (CV)

CV = 100%x rata - rata

bakusimpangan

recovery

3. Spesifisitas ditentukan dari profil pemisahan pada kromatogram yang

menunjukkan pemisahan hingga baseline untuk ketiga analit.

4. Linieritas ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari

penentuan persamaan kurva baku dengan analisis regresi linear.

5. Range ditunjukkan oleh rentang kadar analit terukur yang memenuhi kriteria

akurasi dan presisi.


42

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penyiapan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ialah campuran dari metanol :

aquabidest dan metanol : aquabidest : asam asetat glasial yang bersifat polar.

Pemilihan fase gerak tersebut didasarkan pada kondisi kromatografi yang dipilih

yaitu kromatografi partisi fase terbalik, karena ketiga senyawa analit bersifat polar

sehingga untuk mengelusinya dengan cepat digunakan fase gerak yang polar

sesuai dengan kepolaran ketiga senyawa analit, serta menggunakan kolom C-18

yang bersifat non polar agar ketiga analit dapat terpisah akibat perbedaaan

interaksi tiap analit dengan fase diam. Pemilihan fase gerak ini sangat penting

karena dapat mempengaruhi waktu retensi dan pemisahan dari komponen –

komponen yang akan dianalisis. Kedua jenis fase gerak yang digunakan pada

penelitian ini mengandung metanol yang termasuk golongan alkohol karena

ketiga analit mudah larut dalam etanol yang juga termasuk golongan alkohol.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring untuk menghilangkan

partikel yang dapat menyebabkan kerusakan pada pompa serta menyumbat kolom.

Selanjutnya, fase gerak didegas untuk menghilangkan gelembung – gelembung

gas yang terlarut dalam fase gerak, agar tidak terjadi sinyal palsu pada detektor.

Fase gerak yang digunakan ini mengacu pada studi pustaka terhadap jurnal

penelitian Optimization of the RP-HPLC Method for Multicomponent Analgetic

Drug Determination yang ditulis oleh Ivanovic, dkk pada 2003 tentang pemisahan


43

parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan menggunakan fase gerak metanol :

aquabidest pada berbagai rasio berkisar dari (30 : 70 v/v) hingga (65 : 35 v/v).

pada detektor UV 265 nm dan kolom Beckman Ultrasphere ODS 4,6 x 150 mm,

ukuran partikel 5 µm. Fase gerak tersebut juga dimodifikasi dengan asam asetat

glasial untuk menggaramkan kafein sehingga diharapkan dapat terjadi pemisahan

ketiga analit yang lebih optimal.

B. Pembuatan Larutan Baku

Larutan baku induk dari masing – masing komponen uji dibuat dengan

kadar tertentu, yaitu 5000 ppm untuk parasetamol, 3000 ppm untuk propifenazon,

dan 1000 ppm untuk kafein. Pelarut yang digunakan ialah metanol p.a karena

senyawa memiliki kelarutan yang baik dalam metanol. Selain itu syarat pelarut

yang dapat digunakan dalam KCKT ialah kemurniannya tinggi dan dapat mudah

campur dengan fase gerak dan mudah terelusi.

Larutan untuk seri kurva baku dari masing – masing senyawa dibuat dalam

6 seri kadar yaitu untuk baku parasetamol dibuat dengan kadar 62,5 ppm;

125,0 ppm; 187,5 ppm; 250,0 ppm; 312,5 ppm; dan 375,0 ppm. Untuk baku

propifenazon dibuat dengan kadar 37,5 ppm; 75,0 ppm; 112,5 ppm; 150,0 ppm;

187,5 ppm; dan 225,0 ppm. Sedangkan untuk kafein digunakan kadar 12,5 ppm;

25,0 ppm; 37,5 ppm; 50,0 ppm; 62,5 ppm; dan 75,0 ppm. Masing – masing kadar

tersebut dibuat dari pengenceran larutan baku induk tiap senyawa. Pemilihan seri

kadar kurva baku tersebut dimaksudkan agar kadar masing – masing senyawa

yang terdapat pada sampel simulasi dengan perbandingan 5 : 3 : 1 antara


44

parasetamol, propifenazon, dan kafein dapat tercakup dalam rentang kurva baku

yang digunakan sehingga dapat ditetapkan kadarnya dengan persamaan kurva

baku yang didapatkan.

C. Optimasi Metode KCKT

1. Penentuan panjang gelombang pengamatan dengan spektrofotometri

ultraviolet

Penentuan panjang gelombang pengamatan ini dimaksudkan untuk

menentukan pada panjang gelombang berapa ketiga senyawa yaitu parasetamol,

propifenazon, dan kafein memberikan absorbansi yang cukup besar. Penentuan

panjang gelombang pengamatan ini dilakukan dengan mengukur absorbansi dari

ketiga senyawa masing – masing pada panjang gelombang 200 – 300 nm yang

termasuk dalam panjang gelombang ultraviolet. Kurva serapan dari parasetamol,

propifenazon dan kafein dapat terlihat seperti pada gambar di bawah ini :

Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum parasetamol (a), propifenazon (b), dan

kafein (c)


45

Kurva serapan di atas menunjukkan panjang gelombang pada saat serapan

dari parasetamol maksimal adalah pada 248 nm sedangkan menurut Autherhoff

(1987) serapan maksimal dari parasetamol dalam metanol adalah pada 250 nm.

Untuk propifenazon berdasarkan pengamatan panjang gelombang saat serapannya

maksimal adalah pada 247 nm dan 274 nm, sedangkan menurut Clarke (1986)

serapan maksimal dari propifenazon dalam etanol ialah pada 248 nm dan 277 nm.

Untuk kafein berdasarkan pengamatan panjang gelombang saat serapannya

maksimal adalah pada 272 nm dan menurut Clarke (1986) serapan maksimal dari

kafein dalam etanol adalah pada 273 nm. Hasil pengukuran ini menunjukkan

pergeseran panjang gelombang sebesar 1 hingga 3 nm yang mungkin disebabkan

kondisi pengujian pada saat penelitian berbeda dengan kondisi pengujian pada

literatur yang dapat mempengaruhi absorbansi dari senyawa. Selain itu pelarut

yang digunakan pada penelitian adalah metanol, padahal yang digunakan secara

teoritis untuk propifenazon dan kafein adalah etanol. Menurut Rohman (2007),

penggunaan pelarut yang lebih polar akan menggeser panjang gelombang serapan

maksimum suatu senyawa ke panjang gelombang yang lebih pendek (pergeseran

hipsokromik).

Dari beberapa panjang gelombang pengamatan yang ada, dipilih panjang

gelombang 272 nm dengan alasan pada panjang gelombang tersebut, kafein yang

kadarnya paling kecil dalam campuran dapat terdeteksi dengan baik. Pada panjang

gelombang tersebut nilai serapan dari kafein optimal, sedangkan serapan dari

kedua senyawa yang lain yaitu parasetamol dan propifenazon kurang optimal


46

tetapi tetap dapat terdeteksi dengan baik karena kadarnya dalam campuran yang

cukup tinggi.

2. Pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan kafein dan

optimasi pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein

Pengamatan waktu retensi (tr) dari parasetamol, propifenazon dan kafein

dilakukan pada tiap perbandingan fase gerak metanol : aquabidest yaitu (70 : 30),

(60 : 40), (50 : 50), dan (40 : 60) serta metanol : aquabidest : asam asetat glasial

(70 : 28,5 : 1,5), (60 : 37 : 3), dan (50 : 49 : 1) dengan flow rate 0,5 ml/menit;

1 ml/menit; 1,5 ml/menit; dan 2 ml/menit. Pola pemisahan dari tiap perbandingan

fase gerak yang digunakan berbeda – beda. Hal tersebut dapat dilihat dari hasil

pengamatan waktu retensi dari parasetamol, kafein, dan propifenazon yang

ditampilkan dalam tabel berikut :


47

Tabel III. Pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan kafein

pada berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate tertentu Komposisi Fase

Gerak

Flow rate

(ml/menit)

tR

parasetamol

(menit)

tR

kafein

(menit)

tR

propifenazon

(menit)

Keterangan

Metanol :

aquabidest

70 : 30 0,5 6,341 7,972 7,995 tidak

terpisah

sempurna

60 : 40 0,5 6,376 8,229 9,675 tidak

terpisah

sempurna

50 : 50 0,5 6,420 & 6,729 8,783 13,583 peak ganda

parasetamol 1,0 3,352 & 3,457 4,511 6,870 peak ganda

parasetamol 40 : 60 1,0 3,637 5,245 12,933 Rs

parasetamol

– kafein =

2,477

1,5 2,469 3,540 8,409 Rs

parasetamol

– kafein =

1,617

2,0 1,816 2,534 5,850 Rs

parasetamol

– kafein =

1,306

Metanol :

aquabidest

: asam

asetat

glasial

70 :

28,5 :

1,5

0,5 6,067 & 6,343 7,938 7,962 tidak

terpisah

sempurna

60 :

37 :

3

0,5 6,360 8,078 8,989 tidak

terpisah

sempurna

50 :

49 :

1

0,5 6,487 & 6,752 8,709 13,108 peak ganda

parasetamol

Pemisahan yang terjadi pada kolom KCKT dipengaruhi oleh koefisien

partisi dari senyawa yang dianalisis terhadap fase gerak dan fase diam. Hal

tersebut secara langsung dipengaruhi oleh interaksi yang terjadi antara senyawa

analit dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan. Interaksi antara

parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam campuran dengan fase diam

merupakan ikatan van der Waals antara gugus non polar yang ada pada ketiga

senyawa tersebut dengan fase diamnya yaitu C-18. Namun, interaksi yang terjadi


48

sangat rumit dan susah digambarkan sehingga hanya dapat ditunjukkan gugus non

polar yang ada pada ketiga senyawa tersebut ialah sebagai berikut :

N

NN

N

O

O

N

O

H

OH

c

O

N

N

ba

Gambar 15. Gugus non polar pada parasetamol (a); kafein (b); dan propifenazon (c) yang

berinteraksi dengan kolom ODS

Semakin banyak gugus non polar yang ada dalam suatu senyawa maka

dapat diperkirakan bahwa senyawa tersebut terikat lebih kuat dengan fase

diamnya yang bersifat non polar sehingga waktu retensinya lebih panjang. Dalam

penelitian ini, propifenazon memiliki gugus non polar paling banyak sehingga

interaksi dengan fase diamnya paling kuat dan akan terelusi paling lama.

Parasetamol memiliki gugus non polar yang paling sedikit sehingga waktu

elusinya paling cepat di antara ketiga senyawa analit. Hal tersebut sesuai dengan

teori tentang koefisien partisi (Skoog dkk., 1994) di mana senyawa dengan

koefisien partisi kecil akan lebih cepat keluar dari kolom karena kadar linarut

dalam fase geraknya lebih banyak sehingga dapat lebih cepat terelusi. Untuk

memisahkan ketiganya dapat dilakukan dengan mengganti jenis kolom maupun

fase gerak yang digunakan. Namun, pada penelitian hanya dilakukan perubahan


49

komposisi fase gerak yang digunakan karena keterbatasan jenis kolom yang ada di

laboratorium.

Hasil pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan kafein

pada fase gerak metanol : aquabidest (70 : 30) pada flow rate 0,5 ml/menit

menunjukkan bahwa parasetamol terelusi lebih dulu, setelah itu kafein dan

propifenazon. Kafein dan propifenazon belum dapat memisah. Hal ini dapat

dilihat dari kromatogram di bawah ini :

Gambar 16. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase

gerak metanol : aquabidest (70 : 30) flow rate 0,5 ml/menit

Kromatogram tersebut hanya dapat menggambarkan dua puncak dari tiga

senyawa yang ada. Pada tr = 6,337 merupakan peak parasetamol dan pada tr =

7,991 merupakan peak gabungan dari propifenazon dan kafein. Peningkatan laju

alir tidak dilakukan karena hanya akan memperpendek waktu retensi yang

diperoleh akan tetapi tidak akan memberikan perbedaan yang lebih besar sehingga

pemisahan yang diperoleh masih kurang baik.


50

Kemudian, dilakukan running dengan fase gerak metanol : aquabidest

(60 : 40) pada flow rate 0,5 ml/menit. Penggunaan fase gerak metanol : aquabidest

dengan rasio 60 : 40 dimaksudkan untuk mengurangi komposisi metanol dalam

fase gerak sehingga dapat mengurangi afinitas propifenazon terhadap fase gerak.

Propifenazon mudah larut dalam metanol tapi sukar larut dalam air, sedangkan

kafein memiliki kelarutan dalam air yang lebih baik daripada propifenazon.

Sehingga diharapkan dengan menurunkan komposisi metanol dalam fase gerak

dapat terjadi pemisahan peak kafein dari peak propifenazon. Hasil yang didapat

adalah sebagai berikut :



Pada tr = 6,376 merupakan peak parasetamol; pada tr = 8,229 merupakan

peak kafein; dan pada tr = 9,675 merupakan peak propifenazon. Dari hasil

kromatogram yang didapat terlihat masih terjadi sedikit tumpang tindih antara


51

peak kafein dan propifenazon yang.disebabkan masih terlalu tingginya komposisi

metanol dalam fase gerak ini.

Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan pengamatan pemisahan ketiga

analit pada fase gerak metanol : aquabidest dengan rasio 50 : 50 pada flow rate

0,5 ml/menit dengan harapan peak kafein dan propifenazon dapat terpisah karena

perbedaan afinitas kedua zat tersebut terhadap fase gerak yang digunakan. Berikut

ini adalah kromatogram yang diperoleh :



Pada tr = 6,400 dan 6,722 merupakan peak parasetamol; pada tr = 8,776

merupakan peak kafein; dan pada tr = 13,323 merupakan peak propifenazon

Berdasarkan kromatogram yang didapat, diketahui peak kafein dan propifenazon

telah terpisah sempurna, namun terjadi peak ganda pada peak parasetamol.

Terjadinya peak ganda pada peak parasetamol mungkin disebabkan kurang

sesuainya fase gerak yang digunakan atau kurang tingginya flow rate. Sehingga


52

berdasarkan dugaan tersebut, dilakukan peningkatan flow rate menjadi 1

ml/menit. Diharapkan dengan adanya peningkatan flow rate dapat mempercepat

tercapainya keseimbangan interaksi antara fase gerak, fase diam, dan analit yang

terjadi dalam kolom, sehingga dapat mencegah terbentuknya peak ganda pada

peak parasetamol. Berikut ini adalah kromatogram yang diperoleh :




merupakan peak kafein; dan pada tr = 6,957 merupakan peak propifenazon Dari

kromatogram yang didapat, diketahui peak parasetamol tetap menunjukkan peak

ganda. Sehingga disimpulkan rasio fase gerak yang digunakan memang masih

belum sesuai.

Berdasarkan hasil running yang sudah dilakukan menggunakan fase gerak

metanol : aquabidest yang belum dapat menghasilkan pemisahan yang baik, maka

dilakukan modifikasi fase gerak dengan menggunakan asam asetat glasial hingga


53

pH fase gerak berkisar antara 3 hingga 4 untuk menggaramkan kafein yang

bersifat basa dengan reaksi sebagai berikut :

COH

O

CH3

N

NN

N

O

O

H3C

CH3

CH3

H+

CH3CO

O-

N

NNH

N

O

O

H3C

CH3

CH3 CO

O

CH3

H+

+

+

Gambar 20. Penggaraman kafein oleh asam asetat glasial

Hasil penggaraman kafein tersebut diperkirakan dapat meningkatkan

kelarutan kafein dalam fase gerak yang mengandung aquabidest sehingga dapat

lebih cepat terelusi dan terpisah dari propifenazon. Berikut adalah hasil running

dengan fase gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (70 : 28,5 : 1,5) pada

flow rate 0,5 ml/menit :


gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (70 : 28,5 : 1,5) flow rate 0,5

ml/menit


54

Kromatogram tersebut hanya dapat menggambarkan dua puncak dari tiga

senyawa yang ada. Pada tr = 6,067 dan 6,343 merupakan peak parasetamol dan

pada tr = 7,962 merupakan peak gabungan dari propifenazon dan kafein. Peak

ganda pada peak parasetamol dapat disebabkan oleh fase gerak yang tidak sesuai.

Sedangkan tumpang tindih yang terjadi pada peak propifenazon dan kafein

dikarenakan komposisi metanol dalam fase gerak masih terlalu tinggi sehingga

kafein masih belum dapat terpisah dari propifenazon yang mudah larut dalam

metanol. Maka, dilakukan running menggunakan fase gerak dengan komposisi

metanol yang lebih rendah yaitu metanol : aquabidest : asam asetat glasial dengan

rasio 60 : 37 : 3 pada flow rate 0,5 ml/menit dengan harapan adanya kenaikan

jumlah air akan memudahkan larutnya garam kafein yang terbentuk dari reaksi

basa kafein dengan asam asetat glasial sehingga kafein lebih cepat terelusi dan

dapat terpisah sempurna dari propifenazon. Namun, didapatkan hasil sebagai

berikut :


gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (60 : 37 : 3) flow rate 0,5

ml/menit


55


peak kafein; dan pada tr = 8,989 merupakan peak propifenazon. Peak kafein

mengalami pengurangan waktu retensi dibandingkan waktu retensinya pada saat

running dengan fase gerak metanol : aquabidest (60 : 40) namun propifenazon

juga mengalami hal yang sama, bahkan pengurangan waktu retensinya lebih

signifikan. Hal ini mungkin disebabkan terjadinya penggaraman propifenazon

oleh asam asetat glasial dengan reaksi sebagai berikut :

Gambar 23. Penggaraman propifenazon oleh asam asetat glasial

Propifenazon yang telah tergaramkan tersebut akan meningkat

polaritasnya dan jadi lebih mudah larut dalam air yang ada dalam fase gerak

sehingga dapat keluar dari kolom ODS dengan lebih cepat.

Kemudian dilakukan running dengan fase gerak metanol : aquabidest :

asam asetat glasial (50 : 49 : 1) dan dialirkan pada flow rate 0,5 ml/menit untuk

melihat apakah penambahan asam asetat glasial dapat menghilangkan peak ganda

parasetamol yang terjadi pada saat running dengan fase gerak metanol :

aquabidest (50 : 50). Hasilnya adalah sebagai berikut :


56


gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (50 : 49 : 1) flow rate 0,5

ml/menit


merupakan peak kafein; dan pada tr = 13,108 merupakan peak propifenazon. Peak

parasetamol masih menunjukkan peak ganda yang mungkin disebabkan rasio fase

gerak yang belum sesuai atau kondisi kolom yang diduga mengalami penurunan

kinerja.

Pengggunaan asam asetat glasial untuk modifikasi fase gerak ternyata

tidak memberikan hasil seperti yang diharapkan. Berdasarkan hal tersebut, maka

kembali dilakukan pengamatan pemisahan pada fase gerak metanol : aquabidest

dengan rasio 40 : 60 dan flow rate 1,0 ml/menit. Flow rate yang digunakan tidak

lagi dimulai dari 0,5 ml/menit melainkan 1,0 ml/menit dengan tujuan

mempercepat keluarnya analit dari kolom demi meningkatkan efisiensi waktu,

serta memperuncing bentuk peak dari ketiga analit. Berikut ini adalah

kromatogram yang diperoleh :


57




peak kafein; dan pada tr = 13,162 merupakan peak propifenazon. Dari

kromatogram di atas, dapat terlihat peak parasetamol, kafein, dan propifenazon

telah terpisah sempurna dengan resolusi peak parasetamol – kafein (yang

merupakan peak yang paling dekat jaraknya dibanding peak kafein –

propifenazon) sebesar 2,477; namun waktu yang dibutuhkan oleh sampel untuk

sepenuhnya keluar dari kolom mencapai lebih dari 15 menit. Pemisahan dengan

menggunakan KCKT dapat dikatakan efisien apabila terjadi dalam waktu kurang

dari 15 menit, sehingga pemisahan yang tergambar pada kromatogram di atas

dapat disimpulkan sebagai pemisahan yang kurang efisien. Selain itu, bentuk peak

propifenazon yang tidak runcing pada kromatogram di atas dapat disebabkan oleh

kurang cepatnya keseimbangan interaksi yang tercapai antara fase gerak, fase

diam, dan analit yang terjadi dalam kolom akibat kurang tingginya flow rate yang


58

digunakan. Maka, berdasarkan pertimbangan di atas, dilakukan peningkatan flow

rate menjadi 1,5 ml/menit yang diperkirakan dapat memperbaiki bentuk peak

propifenazon yang tidak runcing serta mempercepat keluarnya seluruh sampel

dari kolom untuk meningkatkan efisiensi waktu pemisahan. Hasilnya dapat dilihat

pada kromatogram berikut :




peak kafein; dan pada tr = 8,590 merupakan peak propifenazon. Pada

kromatogram di atas, terlihat bentuk peak parasetemol dan kafein sudah cukup

runcing, sedangkan peak propifenazon masih kurang runcing meskipun waktu

yang dibutuhkan oleh sampel untuk sepenuhnya keluar dari kolom sudah kurang

dari 15 menit, serta resolusi peak parasetamol – kafein sebesar 1,617. Sehingga

dilakukan running pada flow rate yang lebih tinggi lagi, yaitu pada 2,0 ml/menit

untuk memperuncing bentuk peak propifenazon. Hasilnya dapat dilihat pada

kromatogram berikut :


59




peak kafein; dan pada tr = 5,850 merupakan peak propifenazon. Dari kromatogram

tersebut dapat disimpulkan bahwa waktu retensi yang diperoleh lebih singkat,

pemisahannya cukup baik dengan nilai resolusi peak parasetamol – kafein sebesar

1,306 serta bentuk ketiga peak yang cukup runcing. Berdasarkan hasil optimasi

yang dilakukan, diperoleh kondisi yang optimal ialah sebagai berikut :

Instrumen : Shimadzu LC-10 AD

Kolom : ODS merek DuPont Instruments Zorbax berdimensi

4,6 mm x 25 cm P.N 880952-702

Fase gerak : metanol : aquabidest (40 : 60)

Flow rate : 2,0 ml/menit

AUFs/Attenuation : 0,01/8

Detektor : UV pada 272 nm


60

D. Penetapan Kadar Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein

dalam Sampel Simulasi

1. Pembuatan Kurva Baku

Kurva baku parasetamol dibuat dengan kadar 62,5 ppm; 125,0 ppm; 187,5

ppm; 250,0 ppm; 312,5 ppm; dan 375,0 ppm, untuk propifenazon dibuat dengan

kadar 37,5 ppm; 75,0 ppm; 112,5 ppm; 150,0 ppm; 187,5 ppm; dan 225,0 ppm.

Sedangkan untuk kafein dibuat dengan kadar 12,5 ppm; 25,0 ppm; 37,5 ppm; 50,0

ppm; 62,5 ppm; dan 75,0 ppm. Tiap seri kadar baku tersebut kemudian

diinjeksikan pada KCKT dengan sistem seperti di atas. Untuk menentukan kurva

baku yang akan digunakan dari masing – masing senyawa, maka dilakukan

replikasi sebanyak 3 kali. Adapun persamaan untuk masing – masing kurva baku

dari parasetamol, propifenazon dan kafein dapat dilihat pada tabel IV, V dan VI

berikut ini :

Tabel IV. Data Kurva Baku Parasetamol

Baku parasetamol

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC

63,0500 433277 62,2375 375404 62,7375 363578

126,1000 782447 124,4750 736919 125,4750 744345

189,1500 1158864 186,7125 1148448 188,2125 1138321

252,2000 1645115 248,9500 1555291 250,9500 1521173

315,2500 2030640 311,1875 1979372 313,6875 1905797

378,3000 2514297 373,4250 2323369 376,4250 2260491

B = 6632,3462 B = 6369,1628 B = 6080,5615

A = -36153,0000 A = -34268,8667 A = -12893,1333

r = 0,9986 r= 0,9996 r = 0,9999

SE = 47038,9469 SE = 23093,1561 SE = 11593,8110


61

Gambar 28. Kurva baku parasetamol (replikasi 3)

Tabel V. Data Kurva Baku Propifenazon

Baku propifenazon



37,5500 534864 37,1625 584806 36,9500 426220

75,1000 908171 74,3250 880325 73,9000 815260

112,6500 1297158 111,4875 1349126 110,8500 1250126

150,2000 1760441 148,6500 1852736 147,8000 1710807

187,7500 2230475 185,8125 2159391 184,7500 2264568

225,3000 2653911 222,9750 2706848 221,7000 2829904

B = 11432,7031 B = 11494,7041 B = 13011,4247

A = 61627,0000 A = 93770,2000 A = -133221,6667

r = 0,9991 r = 0,9969 r = 0,9973

SE = 38495,1921 SE = 69505,9370 SE = 74641,2891

Gambar 29. Kurva baku propifenazon (replikasi 1)


62

Tabel VI. Data Kurva Baku Kafein

Baku kafein



12,1250 197727 12,5375 162383 11,2000 181499

24,2500 347263 25,0750 340703 22,4000 308807

36,3750 545312 37,6125 512751 33,6000 465661

48,5000 731223 50,1500 802826 44,8000 647505

60,6250 1001288 62,6875 950287 56,0000 803060

72,7500 1105900 75,2250 1120367 67,2000 961379

B = 15761,6518 B = 15744,1891 B = 14193,8852

A = -14099,6000 A = -42655,2000 A = 4918,2000

r = 0,9956 r = 0,9962 r = 0,9991

SE = 37797,8862 SE = 35909,8330 SE = 14419,9999

Gambar 30. Kurva baku kafein (replikasi 3)

Persamaan kurva baku dari parasetamol, propifenazon, dan kafein yang

diperoleh dari hasil 3 kali replikasi semuanya memiliki koefisien korelasi (r) yang

lebih besar dari nilai r tabel dengan derajat bebas (df) 4 dan taraf kepercayaan

99% yaitu 0,917 sehingga dapat dikatakan semua persamaan kurva baku yang

diperoleh tersebut dapat digunakan untuk menetapkan kadar sampel. Koefisien

korelasi (r) merupakan parameter linieritas dari suatu persamaan regresi linier di

mana nilainya semakin mendekati satu menunjukkan semakin baik linieritas


63

persamaan yang diperoleh sehingga semakin baik hubungan antara peningkatan

kadar dan peningkatan respon yang didapat. Respon yang dimaksudkan di sini

ialah nilai AUC (Area Under Curve). Namun hanya persamaan kurva baku yang

memiliki nilai r yang paling mendekati satu dan memiliki nilai SE yang paling

kecil yang digunakan untuk menetapkan kadar tiap komponen dalam simulasi

sampel. Nilai SE yang kecil dipilih karena menunjukkan penyimpangan yang

kecil pula. Persamaan kurva baku yang dipilih untuk menetapkan kadar campuran

parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah y = 6080,5615 x – 12893,1333

untuk parasetamol; y = 11432,7031 x + 61627,0000 untuk propifenazon; dan

y = 14193,8852 x + 4918,2000 untuk kafein.

2. Penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam

campuran sampel simulasi dan validasi metode

Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon,

dan kafein dalam campuran yang sesuai dengan perbandingan dalam komposisi

dalam tablet yang beredar di pasaran yaitu dengan perbandingan 5 : 3 : 1. Larutan

induk sampel simulasi yang digunakan pada penelitian ini dibuat dari baku

parasetamol sebanyak 50 mg, baku propifenazon 30 mg, dan baku kafein 10 mg

yang dicampur dan dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml. Dengan demikian,

diharapkan hasil yang diperoleh dapat menggambarkan hal yang sama dengan

hasil yang diperoleh dari penetapan kadar ketiga komponen tersebut dalam sampel

yang sesungguhnya dan data yang diperoleh dapat menggambarkan validitas dari

metode yang diperoleh. Penetapan kadar dilakukan pada tingkat kadar rendah,


64

sedang, dan tinggi; masing – masing sebanyak 3 kali replikasi untuk menentukan

akurasi dan presisi dari tiap hasil yang diperoleh. Nilai kadar dari tiap komponen

pada masing – masing sampel simulasi diperoleh dengan cara memasukkan nilai

AUC dari masing – masing senyawa pada tiap replikasi ke dalam persamaan

kurva baku masing – masing senyawa sehingga diperoleh hasil sebagai berikut :

Tabel VII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar

rendah Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

94,856 – 111,787%

SE = 5,099

= 101,868%

CV = 5,006%

1 347666 59,2970 4743,761 5001 94,856

2 361834 61,6271 4930,165 4982 98,960

3 413976 70,2023 5616,18 5024 111,787

Tabel VIII. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi

kadar rendah

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

85,792 – 98,084%

SE= 3,807

= 90,558%

CV = 4,204%

1 441931 33,2646 2661,166 3031 87,798

2 436798 32,8156 2625,248 3060 85,792

3 485223 37,0513 2964,100 3022 98,084

Tabel IX. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar rendah

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

100,591 – 118,654%

SE = 5,991

= 106,671%

CV = 5,616%

1 173958 12,2470 979,7571 974 100,591

2 175876 12,3821 990,5674 983 100,770

3 216961 15,2766 1222,1320 1030 118,654


65

Validasi yang dilakukan pada penelitian ini termasuk dalam kategori I

menurut USP 28 karena penelitian yang dilakukan merupakan metode analisis

kuantitatif untuk menetapkan kadar zat aktif dalam sediaan farmasi. Validitas

metode yang digunakan pada penelitian ini ditentukan berdasarkan parameter

akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas, dan range. Namun, parameter yang

difokuskan pada validasi yang dilakukan pada penelitian ini adalah akurasi dan

presisi yang diperoleh, karena parameter spesifisitas dapat dilihat langsung dari

hasil pemisahan yang terjadi, linieritas dapat dilihat dari nilai r (koefisien korelasi)

kurva baku, dan untuk parameter range ditentukan dari rentang kadar analit

terukur yang telah memenuhi kriteria parameter akurasi dan presisi. Parameter

akurasi dinyatakan dengan nilai recovery atau perolehan kembali, sedangkan

parameter untuk presisi dinyatakan dengan nilai CV (coefficient of variation).

Pada penetapan kadar yang telah dilakukan, rentang recovery yang

diperoleh adalah 94,856 – 111,787% untuk parasetamol dan 85,792 – 98,084%

untuk propifenazon. Nilai rentang recovery ini tidak memenuhi kesepakatan untuk

sampel dengan rasio besar yaitu 95 – 105% (Mulja dan Hanwar, 2003). Untuk

kafein memiliki rentang recovery yaitu 100,591 – 118,654% dan menurut Mulja

dan Hanwar (2003) untuk senyawa dengan rasio kecil rentang recovery yang

dianjurkan adalah 90 – 110% sehingga rentang dari hasil penelitian untuk kafein

juga dapat dikatakan tidak memenuhi persyaratan. Hasil ini menunjukkan bahwa

metode yang digunakan memiliki akurasi yang kurang baik pada penetapan kadar

ketiga analit dalam sampel simulasi kadar rendah.


66

Pada penetapan kadar ini, diperoleh nilai CV sebesar 5,006% untuk

parasetamol; 4,204% untuk propifenazon; dan 5,616% untuk kafein. Nilai ini

tidak memenuhi syarat presisi yang baik yaitu harga CV < 2% untuk zat aktif

yang merupakan kadar analit yang besar dalam campuran (Harmita, 2004),

sehingga metode ini juga memiliki presisi yang kurang baik pada penetapan kadar

ketiga analit dalam sampel simulasi kadar rendah.

Selanjutnya, dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan

kafein pada sampel simulasi kadar sedang dengan hasil seperti pada tabel berikut :

Tabel X. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar

sedang Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery

= 95,741 – 98,759%

SE= 0,947

= 96,877%

CV = 0,978%

1 1442792 239,3998 4787,996 5001 95,741

2 1486883 246,6509 4933,019 4995 98,759

3 1448156 240,2819 4805,639 4999 96,132

Tabel XI. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar

sedang

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

97,760 – 101,220%

SE= 1,121

= 98,983%

CV = 1,132%

1 1759032 148,4693 2969,385 3031 97,967

2 1795726 151,6788 3033,577 2997 101,220

3 1757686 148,3515 2967,031 3035 97,760


67

Tabel XII. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar

sedang Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

105,556 – 109,397%

SE= 1,218

= 107,980%

CV = 1,128%

1 715838 50,0863 1001,727 949 105,556

2 788289 55,1907 1103,814 1009 109,397

3 779949 54,6031 1092,063 1002 108,988

Berdasarkan tabel tersebut dapat dilihat bahwa rentang recovery yang

diperoleh adalah 95,741 – 98,759% untuk parasetamol dan 97,760 – 101,220%

untuk propifenazon. Nilai rentang recovery ini memenuhi kesepakatan untuk

sampel dengan rasio besar yaitu 95 – 105% (Mulja dan Hanwar, 2003). Untuk

kafein memiliki rentang recovery yaitu 105,556 – 109,397 % dan menurut Mulja


dianjurkan adalah 90 – 110% sehingga rentang dari hasil penelitian untuk kafein

dapat dikatakan memenuhi persyaratan. Hasil ini menunjukkan bahwa metode

yang digunakan memiliki akurasi yang baik untuk pengukuran kadar ketiga analit

dalam sampel simulasi kadar sedang.

Sedangkan, nilai CV yang diperoleh adalah 0,978% untuk parasetamol;

1,132% untuk propifenazon; dan 1,128% untuk kafein. Nilai CV ketiga analit

tersebut memenuhi syarat presisi yang baik yaitu harga CV < 2% untuk zat aktif

yang merupakan kadar analit yang besar dalam campuran (Harmita, 2004). Hasil

ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki presisi yang baik untuk

pengukuran kadar ketiga analit dalam sampel simulasi pada kadar sedang.


68

Kemudian, dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan

kafein pada sampel simulasi kadar tinggi untuk menentukan akurasi dan

presisinya dengan hasil seperti pada tabel berikut :

Tabel XIII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi

kadar tinggi Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

92,517 – 97,608%

SE= 1,498

= 94,775%

CV = 1,580%

1 2213225 366,1040 4881,387 5001 97,608

2 2134216 353,1103 4708,138 4998 94,200

3 2097955 347,1469 4628,625 5003 92,517

Tabel XIV. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi

kadar tinggi

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

96,109 – 102,425%

SE= 2,025

= 98,386%

CV = 2,058%

1 2723590 232,8376 3104,501 3031 102,425

2 2588580 221,0285 2947,046 3050 96,624

3 2531417 216,0285 2880,380 2997 96,109

Tabel XV. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar tinggi

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

104,250 – 107,377%

SE= 0,969

= 106,166%

CV = 0,913%

1 1113029 78,0696 1040,928 974 106,871

2 1197138 83,9953 1119,937 1043 107,377

3 1108044 77,7184 1036,245 994 104,250

Berdasarkan tabel tersebut dapat dilihat rentang recovery yang diperoleh

adalah 92,517 – 97,608% untuk parasetamol dan 96,109 – 102,425 % untuk


69

propifenazon. Nilai rentang recovery parasetamol tidak memenuhi kesepakatan

untuk sampel dengan rasio besar yaitu 95–105% (Mulja dan Hanwar, 2003).

Sedangkan, nilai rentang recovery propifenazon memenuhi kesepakatan untuk

sampel dengan rasio besar yaitu 95–105% (Mulja dan Hanwar, 2003). Untuk

kafein memiliki rentang recovery yaitu 104,250 – 107,377% dan menurut Mulja


dianjurkan adalah 90–110% sehingga rentang dari hasil penelitian untuk kafein

dapat dikatakan memenuhi persyaratan. Hasil ini menunjukkan bahwa metode

yang digunakan memiliki akurasi yang kurang baik pada penetapan kadar

parasetamol dalam sampel simulasi kadar tinggi, namun memiliki akurasi yang

cukup baik pada penetapan kadar propifenazon dan kafein dalam sampel simulasi

kadar tinggi.

Sedangkan, nilai CV yang diperoleh adalah 1,580% untuk parasetamol;

2,058% untuk propifenazon; dan 0,913% untuk kafein. Nilai CV propifenazon

tidak memenuhi syarat presisi yang baik yaitu harga CV < 2% untuk zat aktif

yang merupakan kadar analit yang besar dalam campuran (Harmita, 2004),

sedangkan nilai CV parasetamol dan kafein memenuhi syarat CV < 2%. Hasil ini

menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki presisi yang kurang baik

pada penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar tinggi, namun

memiliki presisi yang cukup baik pada penetapan kadar parasetamol dan kafein

dalam sampel simulasi kadar tinggi. Dari hasil analisis tersebut menunjukkan

bahwa metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan kondisi seperti yang


70

digunakan untuk menetapkan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam

sampel simulasi pada kadar tinggi memiliki akurasi dan presisi yang kurang baik.

Parameter linieritas metode ini telah dipenuhi berdasarkan nilai koefisien

korelasi kurva baku ketiga analit yang didapat yaitu lebih besar dari 0,999

(Harmita, 2004). Nilai koefisien korelasi baku parasetamol sebesar 0,9999; nilai

koefisien korelasi baku propifenazon sebesar 0,9991; dan nilai koefisien korelasi

baku kafein sebesar 0,9991.

Sedangkan parameter range merupakan rentang kadar analit terukur yang

telah memenuhi kriteria parameter akurasi dan presisi. Range untuk parasetamol

berkisar antara 239,3998 – 246,6509 ppm; range untuk propifenazon berkisar

antara 148,3515 – 151,6788 ppm; dan range untuk kafein berkisar antara

50,0863 – 83,9953 ppm

.


71

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :

1. Kondisi yang optimal untuk memisahkan komponen parasetamol,

propifenazon, dan kafein dalam campuran ialah sebagai berikut :


Kolom : ODS merek DuPont Instruments Zorbax berdimensi

4,6 mm x 25 cm P.N 880952-702





2. Metode penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein pada sampel

simulasi kadar sedang dengan KCKT dengan kondisi di atas memiliki akurasi

yang baik dilihat dari nilai recovery untuk parasetamol dan propifenazon

95–105% dan untuk kafein 90–110%; presisi yang baik untuk penetapan kadar

parasetamol, propifenazon, dan kafein dilihat dari nilai CV < 2%; spesifisitas

yang baik ditunjukkan oleh profil pemisahan ketiga analit; linieritas yang baik

ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) kurva baku ketiga analit yang

bernilai > 0,999; dan range untuk parasetamol berkisar antara

239,3998 – 246,6509 ppm; range untuk propifenazon berkisar antara


72

148,3515 – 151,6788 ppm; dan range untuk kafein berkisar antara

50,0863 – 83,9953 ppm

B. Saran

Perlu dilakukan analisis multikomponen terhadap sampel yang beredar di

pasaran yang mengandung tiga komponen di atas dengan menggunakan metode

pada penelitian ini.


73

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1989, The Merck Index an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and

Biologicals, 11th

ed., 7784, Merck & Co. Inc., Rahway N. J., USA.

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 254, 649, 753, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Anonim, 2005, The United States Pharmacopeia 28th edition, 2748-2751, United

States Pharmacopeial Convention,Inc., Rockville.

Auterhoff, K., 1987, Identifikasi Obat, 165, 176, ITB Press, Bandung.

Azizahwati, 2000, Swamedikasi secara Aman dan Bijaksana, terutama dalam

Penanganan Batuk dan Pilek., Seminar Swamedikasi Khusus Dalam

Penanganan Batuk dan Pilek, Depok 23 September 2000, Universitas

Indonesia, Depok.

Clarke, E.G.C., 1986, Isolation and Identification of Drugs, 2nd edition, 234, 465,

538, The Pharmaceutical Press, London.

Dimitrovska, A., Trajkovic-Jolevska, S., Nancovska, A., dan Ilievska, M., 1995,

Determination of Propyphenazone, Paracetamol, Caffeine and

Codeine Phosphate with Thin Layer Chromatography, Bulletin of the

Chemists and Technologists of Macedonia, 14, 1, 39-41.

Gritter, R.J, Bobbit, J.M., Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi

diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi II, 186, 199, 200,

206, ITB, Bandung.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya, 5-25, Departemen Farmasi FMIPA UI, Depok.

Harris, D.C., 1999, Quantitative Chemical Analysis, 2nd

ed., 648, W.H.Freeman

and Company, New York.

Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern, 21-25, PT Remaja Rosdakarya, Bandung.

Ivanovic, D., Medenica, M., Malenovic, A., Jancic, B., Misljenovic, Dj., 2003,

Optimization of the RP-HPLC Method for Multicomponent

Analgetic Drug Determination., Boll Chim Farm., 142(9), 386-9.

Johnson, E.L., dan Stevenson, R., 1978, Basic Liquid Chromatography,

diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 6, 9, 22, ITB, Bandung.


74

Kuwana, 1980, Physical Methods in Modern Chemical Analysis, 13, Academic

Press, New York.

Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik

(Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga,

Vol.III,No.2,71-76, Universitas Airlangga Press, Surabaya.

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 6-11, 26, 31, 34

Universitas Airlangga, Surabaya.

Munson, J.W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan

oleh Harjana, Parwa.B,15, 33-34, Universitas Airlangga Press,

Surabaya.

Nair, H.M. and Bonelli, E.J., 1988, Basic Gas Chromatography,diterjemahkan

oleh Kosasih Padmawinata,4,19, ITB,Bandung.

Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, 6, 18-21, 28, 31-32, UGM,

Yogyakarta.

Raffa, R.B., 2006, Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 21st

edition, 1542, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia.

Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, 229 – 250, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta

Sastrohamidjojo, 2002, Kromatografi, edisi kedua, 71, Liberty Yogyakarta,

Yogyakarta.

Settle, F.A., 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical

Chemistry, 150-151, Prentice Hall PTR, Upper Saddle River, New

Jersey.

Skoog, D.A., West, D.M, Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry : An

Introduction, 6th

edition, 490, Harcourt Brace College Publishers ,

Orlando, Florida.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L, 1997, Practical HPLC Method

Development, 2nd ed., 208-209, 252, 695-697, John Willey & Sons

Inc., New York.

Watson, 1999, Pharmaceutical Analysis, 98, 238, Churchill Livingstone, London.

Willard, H.H., Merritt, Jr., Dean, J.A, and Settle Jr, F.A, 1988, Instrumental

Methods of Analysis, 7th edition, 614-615, Wadsworth Publishing

Company, California.


75

Yanuar, A., Hayun, Suryadi, M.T., Henry, A., dan Wulandari, R., 2003, Program

Komputer Analisis Multikomponen untuk Obat Flu dan Analgesik-

Antiinflamasi, Laporan Penelitian, FMIPA Universitas Indonesia,

Depok.


76

Lampiran 1

Sertifikat Analisis Parasetamol


77

Lampiran 2

Sertifikat Analisis Propifenazon


78


79

Lampiran 3.

Sertifikat Analisis Kafein


80

Lampiran 4. Skema pembuatan larutan baku parasetamol dan contoh perhitungan

kadar larutan baku yang digunakan

a. Skema pembuatan

Timbang seksama ± 50 mg parasetamol

↓

Larutkan dalam metanol ad 10 ml (Larutan induk PCT)

↓

Pipet larutan induk PCT sebanyak 125 µl; 250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan

750 µl

↓

Encerkan dengan metanol ad 10,0 ml

b. Perhitungan seri baku parasetamol (replikasi 3)

• Bobot parasetamol hasil penimbangan = 0,05019 g = 50,19 mg

• Kadar parasetamol dalam larutan induk PCT = 50,19 mg/10ml = 5019 ppm

• Seri larutan baku parasetamol :

Volume pemipetan Perhitungan

(Kadar dalam larutan induk PCT x pengenceran )

125 µl 5019 ppm x

10

125,0= 62,7375 ppm

250 µl 5019 ppm x

10

250,0= 125,4750 ppm

375 µl 5019 ppm x

10

375,0= 188,2125 ppm

500 µl 5019 ppm x

10

500,0= 250,9500 ppm

625 µl 5019 ppm x

10

625,0= 313,6875 ppm

750 µl 5019 ppm x

10

750,0= 376,4250 ppm


81

Lampiran 5. Skema pembuatan larutan baku propifenazon dan contoh

perhitungan kadar larutan baku yang digunakan

a. Skema pembuatan

Timbang seksama ± 30 mg propifenazon

↓

Larutkan dalam metanol ad 10 ml (Larutan induk PPZ)

↓

Pipet larutan induk PPZ sebanyak 125 µl; 250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan

750 µl

↓


b. Perhitungan seri baku propifenazon (replikasi 1)

• Bobot propifenazon hasil penimbangan = 0,03004 g = 30,04 mg

• Kadar propifenazon dalam larutan induk PPZ = 30,04 mg/10ml = 3004 ppm

• Seri larutan baku propifenazon :


(Kadar dalam larutan induk PPZ x pengenceran )

125 µl 3004 ppm x

10

125,0= 37,5500 ppm

250 µl 3004 ppm x

10

250,0= 75,1000 ppm

375 µl 3004 ppm x

10

375,0= 112,6500 ppm

500 µl 3004 ppm x

10

500,0= 150,2000 ppm

625 µl 3004 ppm x

10

625,0= 187,7500 ppm

750 µl 3004 ppm x

10

750,0= 225,3000 ppm


82

Lampiran 6. Skema pembuatan larutan baku kafein dan contoh perhitungan

kadar larutan baku yang digunakan

a. Skema pembuatan

Timbang seksama ± 10 mg kafein

↓

Larutkan dalam metanol ad 10 ml (Larutan induk KFN)

↓

Pipet larutan induk KFN sebanyak 125 µl; 250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan

750 µl

↓


b. Perhitungan seri baku kafein (replikasi 3)

• Bobot kafein hasil penimbangan = 0,00896 g = 8,96 mg

• Kadar kafein dalam larutan induk KFN = 8,96 mg/10ml = 896 ppm

• Seri larutan baku kafein :


(Kadar dalam larutan induk KFN x pengenceran )

125 µl 896 ppm x

10

125,0= 11,2000 ppm

250 µl 896 ppm x

10

250,0= 22,4000 ppm

375 µl 896 ppm x

10

375,0= 33,6000 ppm

500 µl 896 ppm x

10

500,0= 44,8000 ppm

625 µl 896 ppm x

10

625,0= 56,0000 ppm

750 µl 896 ppm x

10

750,0= 67,2000 ppm


83

Lampiran 7. Kromatogram Larutan Kurva Baku Parasetamol


Kolom : DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6 mm x 25 cm

P.N. 880952-752.





Larutan Baku Parasetamol 62,7375 ppm


84




85




86



87

Lampiran 8. Kromatogram Larutan Kurva Baku Propifenazon



P.N. 880952-752.





Larutan Baku Propifenazon 37,5500 ppm


88




89




90



91

Lampiran 9. Kromatogram Larutan Kurva Baku Kafein



P.N. 880952-752.





Larutan Baku Kafein 11,2000 ppm


92




93




94



95

Lampiran 10. Skema pembuatan sampel simulasi dan contoh perhitungan

kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam sampel simulasi

a. Skema pembuatan

Timbang seksama ± 50 mg baku parasetamol; 30 mg baku propifenazon dan

10 mg baku kafein

↓

Campur dan larutkan dalam metanol ad 10 ml (larutan induk sampel simulasi)

↓

Pipet larutan induk sampel simulasi sebanyak :

125 µl (sampel simulasi kadar rendah);

500 µl (sampel simulasi kadar sedang);

750 µl (sampel simulasi kadar tinggi)

↓

Encerkan dengan metanol ad 10 ml

↓

Saring dengan Millipore dan degassing selama 15 menit

↓

Injeksikan pada KCKT

b. Contoh perhitungan kadar parasetamol dalam sampel simulasi

1) Kadar teoritis parasetamol dalam sampel simulasi (contoh sampel simulasi

kadar rendah 1)

Berat penimbangan = 50,01 mg dilarutkan dalam 10 ml metanol (yang di

dalam larutan induk sampel simulasi terlarut propifenazon dan kafein juga

dengan perbandingan parasetamol : propifenazon : kafein = 5 : 3 : 1) dan

diencerkan dengan cara mengambil 125 µl larutan tersebut dan dilarutkan

dalam metanol ad 10 ml.


96

Kadar parasetamol dalam larutan induk sampel simulasi

= ppmml

mg,5001

10

0150

Kadar terhitung parasetamol dalam larutan sampel simulasi kadar rendah

= ppm,ml

lx

ml

mg,512562

10

125

10

0150

2) Kadar terukur parasetamol hasil penelitian pada sampel simulasi (contoh

sampel simulasi kadar rendah 1)

Nilai AUC dari peak parasetamol dimasukkan ke dalam persamaan kurva

baku yang diperoleh yaitu untuk parasetamol y = 6080,5615x – 12893,1333

untuk mendapatkan kadar terukur parasetamol dalam larutan uji kemudian

dikalikan faktor pengenceran 10000/125 (sampel simulasi kadar rendah) untuk

mendapatkan kadar terukur parasetamol dalam larutan induk sampel simulasi.

Contoh :

Nilai AUC pada sampel simulasi kadar rendah no.1 = 347666

Persamaan kurva baku parasetamol (AUC vs konsentrasi (ppm)) :

y = 6080,5615x – 12893,1333

Perhitungan :

Kadar parasetamol dalam larutan uji :

347666 = 6080,5615x – 12893,1333

x = 59,2970 ppm

kadar parasetamol dalam larutan induk sampel simulasi =

59,2970 ppm x l

l

125

10000= 4743,7610 ppm


97

Recovery sampel =

simulasi sampellarutanpadalparasetamoteoritiskadar

simulasi sampelinduklarutandalamlparasetamoterukurkadarX100%

%,%xppm

ppm,856094100

5001

76104743

Kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar rendah Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

94,856 – 111,787%

SE = 5,099

= 101,868%

CV = 5,006%

1 347666 59,2970 4743,761 5001 94,856

2 361834 61,6271 4930,165 4982 98,960

3 413976 70,2023 5616,18 5024 111,787

Kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar sedang

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery

= 95,741 – 98,759%

SE= 0,947

= 96,877%

CV = 0,978%

1 1442792 239,3998 4787,996 5001 95,741

2 1486883 246,6509 4933,019 4995 98,759

3 1448156 240,2819 4805,639 4999 96,132

Kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar tinggi

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

92,517 – 97,608%

SE= 1,498

= 94,775%

CV = 1,580%

1 2213225 366,1040 4881,387 5001 97,608

2 2134216 353,1103 4708,138 4998 94,200

3 2097955 347,1469 4628,625 5003 92,517


98

c. Contoh perhitungan kadar propifenazon dalam sampel simulasi

1) Kadar teoritis propifenazon dalam sampel simulasi (contoh sampel simulasi

kadar rendah 1)

Berat penimbangan = 30,31 mg dilarutkan dalam 10 ml metanol (yang di

dalam larutan induk sampel simulasi terlarut parasetamol dan kafein juga

dengan perbandingan parasetamol : propifenazon : kafein = 5 : 3 : 1) dan

diencerkan dengan cara mengambil 125 µl larutan tersebut dan dilarutkan

dalam metanol ad 10 ml.

Kadar propifenazon dalam larutan induk sampel simulasi

= ppmml

mg,3031

10

3130

Kadar terhitung propifenazon dalam larutan sampel simulasi kadar rendah

= ppm,ml

lx

ml

mg,887537

10

125

10

3130

2) Kadar terukur propifenazon hasil penelitian pada sampel simulasi (contoh

sampel simulasi kadar rendah 1)

Nilai AUC dari peak propifenazon dimasukkan ke dalam persamaan kurva

baku yang diperoleh yaitu untuk propifenazon y = 11432,7031x + 61627,0000

untuk mendapatkan kadar terukur propifenazon dalam larutan uji kemudian

dikalikan faktor pengenceran 10000/125 (sampel simulasi kadar rendah) untuk

mendapatkan kadar terukur propifenazon dalam larutan induk sampel

simulasi.


99

Contoh :


Persamaan kurva baku propifenazon (AUC vs konsentrasi (ppm)) :

y = 11432,7031x + 61627,0000

Perhitungan :

Kadar propifenazon dalam larutan uji :

441931 = 11432,7031x + 61627,0000

x = 33,2646 ppm

kadar propifenazon dalam larutan induk sampel simulasi =

36,2646 ppm x l

l

125

10000= 2661,1660 ppm

Recovery sampel =

simulasi sampellarutanpadaonpropifenazteoritiskadar

simulasi sampelinduklarutandalamonpropifenazterukurkadarX100%

%,%xppm

ppm,798087100

3031

16602661

Kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar rendah Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

85,792 – 98,084%

SE= 3,807

= 90,558%

CV = 4,204%

1 441931 33,2646 2661,166 3031 87,798

2 436798 32,8156 2625,248 3060 85,792

3 485223 37,0513 2964,100 3022 98,084


100

Kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar sedang Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

97,760 – 101,220%

SE= 1,121

= 98,983%

CV = 1,132%

1 1759032 148,4693 2969,385 3031 97,967

2 1795726 151,6788 3033,577 2997 101,220

3 1757686 148,3515 2967,031 3035 97,760

Kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar tinggi

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

96,109 – 102,425%

SE= 2,025

= 98,386%

CV = 2,058%

1 2723590 232,8376 3104,501 3031 102,425

2 2588580 221,0285 2947,046 3050 96,624

3 2531417 216,0285 2880,380 2997 96,109

d. Contoh perhitungan kadar kafein dalam sampel simulasi

1) Kadar teoritis kafein dalam sampel simulasi (contoh sampel simulasi kadar

rendah 1)

Berat penimbangan = 9,74 mg dilarutkan dalam 10 ml metanol (yang di dalam

larutan induk sampel simulasi terlarut parasetamol dan kafein juga dengan

perbandingan parasetamol : propifenazon : kafein = 5 : 3 : 1) dan diencerkan

dengan cara mengambil 125 µl larutan tersebut dan dilarutkan dalam metanol

ad 10 ml.

Kadar kafein dalam larutan induk sampel simulasi

= ppmml

mg,974

10

749


101

Kadar terhitung kafein dalam larutan sampel simulasi kadar rendah

= ppm,ml

lx

ml

mg,175012

10

125

10

749

2) Kadar terukur kafein hasil penelitian pada sampel simulasi (contoh sampel

simulasi kadar rendah 1)

Nilai AUC dari peak kafein dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang

diperoleh yaitu untuk kafein y = 14193,8852x + 4918,2000 untuk

mendapatkan kadar terukur kafein dalam larutan uji kemudian dikalikan faktor

pengenceran 10000/125 (sampel simulasi kadar rendah) untuk mendapatkan

kadar terukur kafein dalam larutan induk sampel simulasi.

Contoh :


Persamaan kurva baku kafein (AUC vs konsentrasi (ppm)) :

y = 14193,8852x + 4918,2000

Perhitungan :

Kadar kafein dalam larutan uji :

173958 = 14193,8852x + 4918,2000

x = 12,2470 ppm

kadar kafein dalam larutan induk sampel simulasi

= 12,2470 ppm x l

l

125

10000= 979,7571 ppm


102

Recovery sampel

= simulasi sampellarutanpadaonpropifenazteoritiskadar

simulasi sampelinduklarutandalamonpropifenazterukurkadarX100%

= %,%xppm

ppm,5910100100

974

7571979

Kadar kafein dalam sampel simulasi kadar rendah Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

100,591 – 118,654%

SE = 5,991

= 106,671%

CV = 5,616%

1 173958 12,2470 979,7571 974 100,591

2 175876 12,3821 990,5674 983 100,770

3 216961 15,2766 1222,1320 1030 118,654

Kadar kafein dalam sampel simulasi kadar sedang

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

105,556 – 109,397%

SE= 1,218

= 107,980%

CV = 1,128%

1 715838 50,0863 1001,727 949 105,556

2 788289 55,1907 1103,814 1009 109,397

3 779949 54,6031 1092,063 1002 108,988

Kadar kafein dalam sampel simulasi kadar tinggi

Sampel

AUC Kadar

terukur

(ppm)

Kadar

terukur

dalam

larutan

induk

(ppm)

Kadar

teoritis

larutan

induk

(ppm)

Recovery

(%)

Rentang recovery =

104,250 – 107,377%

SE= 0,969

= 106,166%

CV = 0,913%

1 1113029 78,0696 1040,928 974 106,871

2 1197138 83,9953 1119,937 1043 107,377

3 1108044 77,7184 1036,245 994 104,250


103

Lampiran 11. Kromatogram Sampel

Sampel simulasi kadar rendah

Sampel 1


104

Sampel 2

Sampel 3


105

Sampel simulasi kadar sedang

Sampel 1


106

Sampel 2

Sampel 3


107

Sampel simulasi kadar tinggi

Sampel 1


108

Sampel 2

Sampel 3


109

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Validasi Penetapan Kadar

Campuran Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein

dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase

Terbalik” ini memiliki nama lengkap Adrian Rendy

Irmanto. Penulis dilahirkan di Sleman pada tanggal 8

Juni 1987 sebagai anak sulung dari empat bersaudara

dari pasangan Sugeng Irmanto dan Yenny. Pendidikan

formal yang pernah ditempuh yaitu TK Pangudi Luhur

Yogyakarta (1991-1993), SD Pangudi Luhur

Yogyakarta (1993-1999), SLTP Stella Duce 1 Yogyakarta (1999-2002), SMUN 3

Yogyakarta (2002-2005), dan pada tahun 2005 melanjutkan pendidikan di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama masa kuliah,

penulis pernah menjadi asisten dosen pada Praktikum Analisis Makanan dan

Praktikum Kromatografi. Selain kegiatan akademik, penulis juga pernah

mengikuti beberapa kegiatan non – akademik, antara lain ikut dalam kepanitiaan

Insadha 2006 dan sumpahan apoteker angkatan XIII.


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · ii validasi penetapan kadar campuran...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · ii validasi penetapan kadar campuran...