PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · dukungan dan keceriaan selama perkuliahan...

�

�

PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU VORSTENLANDEN BAWAH NAUNGAN DAN NA OOGST

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

Skripsi

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh: Dina Christiana Dewi

NIM : 088114014

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

�

�

��

�

PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU VORSTENLANDEN BAWAH NAUNGAN DAN NA OOGST

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

Skripsi

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh: Dina Christiana Dewi

NIM : 088114014

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012


�

�

��

�


�

�

��

�

HALAMAN PERSEMBAHAN

��

��

��

��

Kupersembahkan karyaku ini untuk kedua orang tuaku Yohanes Agus Yunanto,

Veronika Sri Mulyani, Kakaku Mada Prabawa, Sahabatku, Almamaterku


�

�

��

�


�

�

��

�

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah melindungi

dan memberikan berkat rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun

Tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst Secara Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

Keberhasilan penulis dalam menyelesaikan skripsi ini tidak lepas dari

dukungan, bantuan, dan motivasi dari banyak pihak. Penulis mengucapkan terima

kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bapak Jeffry Julianus, M.Si selaku Dosen Pembimbing yang memberikan

saran, masukan, kritikan dan solusi kepada penulis selama penyusunan skripsi

ini.

3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan masukan, kritik, solusi dan motivasi kepada penulis untuk skripsi

ini.

4. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Penguji yang memberikan

masukan, kritik, saran dan solusi yang bermanfaat kepada penulis untuk skripsi

ini.


�

�

��

�

5. Ibu Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

6. PT. Perkebunan Nusantara XIX (Persero) Klaten atas sumbangan daun

tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst yang berguna dalam

penelitian.

7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman sehingga berharga

dalam proses penyusunan skripsi.

8. Seluruh staff laboratorium, keamanan dan kebersihan di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, terutama Mas Bimo, Pak Parlan, dan

Mas Kunto yang telah membantu dan memberikan dukungan selama

pelaksanaan penelitian ini.

9. Perpustakaan Universitas Sanata Dharma atas koleksi buku-buku dan fasilitas

internet sehingga mempermudah penulis dalam memperoleh bahan-bahan yang

dibutuhkan dalam penulisan skripsi ini.

10. Keluargaku tercinta, Bapak Agus Yunanto, Ibu Sri Mulyani, Mas Mada

Prabawa yang tidak pernah berhenti memberikan semangat dan doa sampai

akhirnya terselesaikannya skripsi ini.

11. DF. Fani Rista Maji, Bernadet Brigita dan Leonardus Damar yang selalu

mendukung, menghibur, memberikan perhatian dan menemani penulis dalam

menyelesaikan penulisan skripsi ini.

12. Ayesa Syenina dan Amelia Ernesta selaku teman seperjuangan, sahabat dan

teman berbagi cerita, terima kasih atas semangat, perhatian, motivasi, diskusi

dan doa yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi.


�

�

��

�

13. Teman-teman skripsi nikotin KLT-Densito: Novi, Citra, Helen atas diskusi,

dukungan dan kerjasamanya selama penelitian.

14. Teman-teman di laboratorium : Felicia, Prasilya, Sasa, Susan, Nona, Sari, Tere

dan Wiwi atas dukungan dan keceriaan dalam melakukan penelitian.

15. Teman-teman KKN Alternatif XXXIX Tematik di Desa Pariwiata Pindul atas

keceriaan, kerjasama dan dinamika yang telah diberikan.

16. Teman-teman FST-A dan kelompok praktikum A, terima kasih atas kerjasama,

dukungan dan keceriaan selama perkuliahan dan praktikum.

17. Teman-teman Fakultas Farmasi angkatan 2008, terima kasih atas pengalaman,

keceriaan dan kebersamaan yang tidak bisa terlupakan.

18. Teman-teman Fakultas Farmasi, terima kasih atas kebersamaan.

19. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari masih banyak terdapat kekurangan dalam

penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran

untuk membantu penulis dalam penyempurnaan skripsi ini. Akhir kata, semoga

skripsi ini bermanfaat bagi pembaca.

Yogyakarta, 9 November 2011

Dina Christiana Dewi


�

�

��

�

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... v

LEMBAR PERNYATAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ......... vi

PRAKATA .................................................................................................. vii

DAFTAR ISI ............................................................................................... x

DAFTAR TABEL ....................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xviii

INTISARI .................................................................................................... xix

ABSTRACT ................................................................................................ xx

BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1

A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

1. Permasalahan ................................................................................ 4

2. Keaslian Penelitian ........................................................................ 4

3. Manfaat Penelitian ........................................................................ 4

B. Tujuan Penelitian ................................................................................. 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................... 6

A. Tembakau ............................................................................................. 6

1. Keterangan Botani ........................................................................ 6


�

�

��

�

2. Deskripsi Tanaman ....................................................................... 6

a. Akar .......................................................................................... 6

b. Batang ...................................................................................... 6

c. Daun ......................................................................................... 6

d. Bunga ....................................................................................... 6

e. Buah ......................................................................................... 7

3. Tanaman C3 .................................................................................. 7

B. Nikotin ................................................................................................. 9

Simplisia dan Penanganan Daun Tembakau ........................................ 11

1. Simplisia .......................................................................................... 11

2. Penanganan Daun Tembakau .......................................................... 11

a. Sortasi Pendahuluan .................................................................... 11

b. Penyejunan .................................................................................. 11

3. Curing .............................................................................................. 12

a. Penguningan .............................................................................. 12

b. Pengikatan Warna .................................................................... 12

c. Pengeringan Lembar Daun ....................................................... 12

d. Pengeringan Gagang ................................................................ 12

C. Ekstraksi ............................................................................................... 13

1. Ekstrak .......................................................................................... 13

2. Ekstraksi ........................................................................................ 13

3. Cairan Penyari ............................................................................... 13

4. Soxhlet .......................................................................................... 14


�

�

��

�

5. Penguapan Ekstrak Cair ................................................................ 15

D. Spektrofotometri UV............................................................................ 15

1. Transisi � � �* ............................................................................ 16

2. Transisi n� �* ............................................................................. 16

3. Transisi n��* dan ��* ............................................................. 17

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................... 18

1. Definisi dan Instrumentasi ............................................................ 18

2. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif ................................................ 21

F. Landasan Teori ..................................................................................... 22

G. Hipotesis .............................................................................................. 23

BAB III METODOLOGI PENELITIAN.................................................... 24

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................... 24

B. Variabel ................................................................................................ 24

1. Variabel bebas ............................................................................... 24

2. Variabel tergantung ....................................................................... 24

3. Variabel pengacau ......................................................................... 24

C. Definisi Operasional ............................................................................ 24

D. Bahan Penelitian .................................................................................. 25

E. Alat Penelitian ...................................................................................... 25

F. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 26

1. Pembuatan Buffer Asetat .............................................................. 26

2. Pembuatan Fase Gerak .................................................................. 26

3. Pengambilan dan Pembuatan Sampel ........................................... 26


�

�

��

�

4. Pembuatan Larutan Baku Nikotin ................................................. 26

5. Pembuatan Panjang Gelombang Serapan Maksimum .................. 27

6. Pembuatan Kurva Baku Nikotin ................................................... 27

7. Pembuatan HCl Encer ................................................................... 28

8. Pembuatan NaOH 4 M .................................................................. 28

9. Preparasi Sampel ........................................................................... 28

10. Ekstraksi Daun Tembakau ............................................................ 28

11. Penetapan Kadar Nikotin dalam Sampel ...................................... 29

G. Analisis hasil ........................................................................................ 29

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................... 31

A. Pembuatan Fase Gerak ......................................................................... 31

B. Pengambilan dan Pembuatan Sampel .................................................. 33

C. Pembuatan Larutan Baku Nikotin ........................................................ 35

D. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum .......................... 35

E. Pembuatan Kurva Baku Nikotin .......................................................... 37

F. Ekstraksi Secara Soxhletasi dan Penguapan Ekstrak Cair ................... 38

G. Optimasi Waktu Ekstraksi Nikotin dalam Serbuk Daun Tembakau .... 39

H. Ekstraksi dengan Waktu Optimum 8 jam ............................................ 42

I. Preparasi Sampel .................................................................................. 45

J. Analisis Kualitatif Nikotin ................................................................... 47

K. Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau .. 50

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 54

A. Kesimpulan ...................................................................................... 54


�

�

��

�

B. Saran .............................................................................................. . 54

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 55

LAMPIRAN ................................................................................................ 58

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................... 82


�

�

��

�

DAFTAR TABEL

Tabel I. Karakteristik pelarut yang digunakan dalam KCKT ........... 20

Tabel II. Hasil pengukuran AUC sampel dengan varisi waktu

ekstraksi sampel dengan soxhlet ......................................... 42

Tabel III. Hasil pengukuran AUC ekstraksi serbuk daun tembakau

jenis VBN dan NO dengan soxhlet selama 8 jam ............... 45

Tabel IV. Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun

tembakau kedua sampel ....................................................... 50

Tabel V. Uji Normalitas ..................................................................... 51

Tabel VI. Uji t tidak berpasangan ........................................................ 52


�

�

��

�

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Daun tembakau VBN dan NO .............................................. 7-8

Gambar 2. Struktur alkaloid dalam daun tembakau .............................. 8

Gambar 3. Struktur nikotin .................................................................... 8

Gambar 4. Struktur nikotin dan asetilkolin ........................................... 9

Gambar 5. Jalur biosinesis dengan modifkasi ....................................... 10

Gambar 6. Alat soxhlet .......................................................................... 14

Gambar 7. Diagram tingkat energi elektronik ....................................... 16

Gambar 8. Pengaruh pelarut polar pada transisi � � �*....................... 17

Gambar 9. Pengaruh pelarut polar pada transisi n � �* ....................... 17

Gambar 10. Instrumentasi KCKT ........................................................... 18

Gambar 11. Nikotin dalam bentuk terion ................................................ 33

Gambar 12. Spektra � maksimum 3 seri konsentrasi .............................. 36

Gambar 13. Struktur kromofor cincin piridin ......................................... 37

Gambar 14. Grafik hubungan antara konsentrasi analit dengan AUC .... 37

Gambar 15. Proses ekstraksi dengan alat soxhlet .................................... 38

Gambar 16. Kromatogram optimasi waktu ekstraksi 7, 8, 9, 10 jam ...... 40

Gambar 17. Kromatogram ekstraksi kedua jenis daun tembakau

dengan waktu optimum 8 jam ............................................. 42

Gambar 18. Reaksi antara nikotin dengan asam klorida ......................... 46

Gambar 19. Reaksi antara nikotin hidroklorida dengan NaOH .............. 46

Gambar 20. Struktur bagian polar dan non polar .................................... 47

Gambar 21. Interaksi nikotin dengan fase diam oktadesilsilan ............... 48


�

�

��

�

Gambar 22. Interaksi nikotin dengan fase gerak

buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) .......................... 48

Gambar 23. Kromatogram baku nikotin dan sampel .............................. 49


�

�

��

�

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku nikotin E.Merck ......................... 59

Lampiran 2. Surat keterangan dan infomasi tembakau ....................... 60

Lampiran 3. Perhitungan pergeseran pKa nikotin dan pH .................. 63

Lampiran 4. Perhitungan polaritas fase gerak ..................................... 64

Lampiran 5. Spektrum nikotin ............................................................ 65

Lampiran 6. Hasil Perolehan AUC seri baku nikotin .......................... 66

Lampiran 7. Penimbangan serbuk kering dan ekstrak kental

daun tembakau untuk optimasi lama waktu ekstraksi ... 67

Lampiran 8. Kromatogram hasil optimasi lama waktu ekstraksi

dengan soxhlet ............................................................... 68

Lampiran 9. Penimbangan serbuk kering dan ekstrak kental daun

tembakau untuk optimasi lama waktu ekstraksi ............. 72

Lampiran 10. Kromatogram hasil penetapan kadar nikotin dalam

ekstrak etanolik daun tembakau NO dan VBN ................ 74

Lampiran 11. Perhitungan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik

daun tembakau ................................................................ 77

Lampiran 12. Data Uji Statistik ............................................................. 79

Lampiran 13. Kromatogram blanko pelarut buffer asetat:metanol

: asetonitril (40:54:6) ...................................................... 81


�

�

��

�

PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU VORSTENLANDEN BAWAH NAUNGAN DAN NA OOGST SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK

INTISARI

Nikotin merupakan alkaloid yang ditemukan dalam tanaman tembakau (Nicotiana tabaccum) dan memiliki efek farmakologis yang berpotensi dalam pengobatan. Ekstrak daun tembakau yang mengandung nikotin dapat dijadikan sediaan farmasi. Penelitian ini bertujuan untuk penetapan dan membandingkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik.

Penelitian ini mengikuti jenis dan rancangan penelitian non eksperimental deskriptif. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) menggunakan kolom fase diam oktadesilsilan (C18), fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6), detektor UV pada � maks 260 nm (Ernesta, 2011). Parameter validasi metode meliputi selektifitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang pada konsentrasi 0,05-0,09 ppm (Syenina, 2011).

Hasil penelitian menunjukkan kadar rata-rata nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan adalah 2,790x10-3 % b/b ± 2,744x10-5 dengan nilai CV= 0,9835% dan Na Oogst adalah 1,316x10-3 ± 2,775x10-6 dengan nilai CV = 0,2109%. Nilai CV yang diperoleh memenuhi syarat presisi yang baik yaitu <2%. Hasil analisis statistik menggunakan uji t tidak berpasangan menunjukkan bahwa kadar nikotin rata-rata antara kedua sampel berbeda signifikan. Kata kunci : nikotin, tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan, tembakau Na

Oogst, KCKT fase terbalik, penetapan kadar.


�

�

��

�

DETERMINATION NICOTINE CONTAINED IN ETHANOLIC EXTRACT OF TOBACCO LEAF VORSTENLANDEN UNDER SHADE AND NA OOGST USING REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY

ABSTRACT

Nicotine is an alkaloid found in tobacco (Nicotiana tabaccum) plant and it has pharmacological effects which is potential for medical importance. The extract of tobacco leaves that contains nicotine can be made into pharmaceutical products. This research aims to amount and compare nicotine in ethanolic extract of tobacco leaves Vorstenlanden Under Shade and Na Oogst can be determined by using reversed phase HPLC system that have been optimized and validated. This research is conducted with a descriptive non-experimental plan and design. The HPLC system used for the quantitative analysis of nicotine consists of octadecylsilane (C18) as the stationary phase, mixture of acetate buffer:methanol :acetonitrile (40:54:6), UV detector with � max of 260 nm (Ernesta, 2011). The parameters of method validation used in this research are selectivity, linearity, accuracy, precision and range of concentration 0.05-0.09 ppm (Syenina,2011). The results of this research of average levels of nicotine contained ethanolic extract of tobacco leaves Vorstenlanden Under Shade 2.790x10-3 % w/w ± 2.744 x10-5 with a CV of 0.9835% and Na Oogst 1.316x10-3 %w/w ± 2.775x10-

6 with a CV of 0.2109%. The value of CV obtained qualifies for good precision which is <2%. The results of statistical analysis using unpaired t test showed that amount of nicotine on average between the two samples are significantly different. Key word : nicotine, tobacco Vorstenlanden Under Shade , tobacco Na Oogst,

reversed phase-HPLC, determination.


��

�

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Nikotin merupakan senyawa alkaloid yang banyak ditemukan pada

tanaman tembakau (Nicotiana tabacum) dengan kadar 0,3 sampai 5% dari berat

kering tembakau dari hasil biosintesis di akar dan terakumulasi di daun (Anonim,

2011). Nikotin mampu merangsang pelepasan neurotransmitter (serotonin dan

dopamine) dan menyeimbangkan kerja dari neurotransmitter tersebut, karena jika

terjadi ketidakseimbangan dapat menyebabkan depresi. Selain itu, nikotin

berpotensi dalam mengobati penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson

(Anonim, 2006).

Besarnya potensi nikotin tersebut memiliki peran dalam bidang

kesehatan, sehingga memungkinkan untuk dikembangkan sebagai sediaan farmasi

yang terlebih dahulu dibuat dalam ekstrak.

Varietas Vorstenlanden merupakan salah satu varietas tanaman

tembakau. Varietas Vorstenlanden yang dikembangkan oleh PT. Perkebunan

Nusantara X merupakan keturunan pertama (F1) dari hasil perkawinan galur TV

38 dan G. TV 38 yaitu Timor Vorstenlanden dengan no 38 dan kode G adalah

tembakau yang ditanam di daerah Gayamprit dengan nama Vorsetenlanden

Bawah Naungan (VBN) dan Na Oogst (NO).

VBN ditanam pada bulan Juni mulai panen bulan Juli, diberikan waring

atau naungan, adanya sistem pengairan sedangkan tembakau NO penanaman


��

�

��

�

pada pertengahan bulan September dan mulai panen akhir Oktober, tidak

diberikan waring atau naungan, pengairannya mengandalkan air hujan, namun

jika tidak ada hujan tetap diberikan pengairan buatan. Naungan mempengaruhi

intesitas cahaya matahari pada tanaman tembakau yang berpengaruh pada kadar

nikotin.

Penelitian ini dilakukan untuk analisis kuantitatif kadar nikotin dalam

ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dan mengetahui perdebaan kadar

nikotin dalam ekstrak etanolik kedua daun tembakau. Daun tembakau diektraksi

dengan menggunakan metode soxhletasi dengan cairan penyari etanol. Metode

soxhletasi dipilih karena pengerjaannya mudah, jumlah cairan penyari yang

diperlukan lebih sedikit daripada metode ekstraksi lainnya, proses sirkulasi yang

berkesinambungan sehingga senyawa yang tersari lebih banyak. Cairan penyari

yang digunakan adalah etanol karena dapat melarutkan alkaloid basa, panas yang

dibutuhkan untuk pemekatan lebih rendah (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat

dan Makanan, 1986).

Metode KCKT dipilih untuk menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak

etanolik tembakau karena metode ini selektif dalam memisahkan senyawa

multikomponen dengan hasil pemisahan yang baik, dan waktu yang relatif

singkat. Detektor yang digunakan adalah UV karena nikotin memiliki struktur

kromofor dan memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang teoritis 262

nm (Cordell, 1981).

Penelitian ini merupakan tahap akhir dari serangkaian penelitian

penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau yang meliputi


��

�

��

�

tahap optimasi dan validasi metode. Pada penelitian tentang optimasi metode

penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode

KCKT fase terbalik menggunakan kolom fase diam oktadesilsilan (C18) dan fase

gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6), kecepatan alir 1,2 mL/menit,

detektor UV pada panjang gelombang maksimum 260 nm dengan nilai resolusi

1,5679, tailing factor 1,25, jumlah lempeng teoritis 2247,163 dan nilai HETP

0,0111 (Ernesta, 2011). Pada tahap validasi penetapan kadar nikotin dalam

ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode KCKT fase terbalik memenuhi

parameter selektivitas dengan nilai resolusi (Rs) 1,531, linearitas dengan nilai

koefisien korelasi (r) 0,9996, presisi dan akurasi pada konsentrasi 0,05 dan 0,09

ppm, rentang konsentrasi 0,05-0,09 ppm (Syenina, 2011).


��

�

��

�

1. Permasalahan

Permasalahan yang dapat dirumuskan berdasarkan latar belakang tersebut

antara lain:

a. berapakah kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO?

b. apakah kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO

berbeda bermakna?

2. Keaslian Penelitian

Berdasarkan penelusuran literatur yang dilakukan, maka penetapan kadar

nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dengan metode

KCKT fase terbalik belum pernah dilakukan. Penelitian tentang penetapan kadar

nikotin yang pernah dilakukan adalah penetapan kadar nikotin dalam sampel

biologis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT),

kromatografi gas, spektrofotometri massa, dan kromatografi cair-MS (LC-MS)

(Nakajima, Yamamoto, Kuroiwa, Yokoi, 2000), penetapan kadar nikotin dalam

daun tembakau VBN dan NO dengan metode spektrofotometri UV oleh PT.

Perkebunan Nusantara X (Persero).

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat

memberikan alternatif metode penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik

daun tembakau VBN dan NO yaitu menggunakan metode kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik.

b. Manfaat praktis. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menambah

informasi dalam dunia farmasi dan masyarakat tentang kadar nikotin dalam


�

�

�

�

ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dengan metode kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dan perbandingan kadar antara kedua jenis

tembakau tersebut.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk mengetahui

a. kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan

NO dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik.

b. mengetahui perbedaan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau

VBN dan NO.


�

�

�

�

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tembakau

1. Keterangan Botani

Tanaman tembakau ( Nicotiana tabaccum L. ) termasuk dalam famili

Solanaceae (Cahyono, 1998).

2. Deskripsi tanaman

a. Akar, tanaman tembakau merupakan tanaman berakar tunggang yang

tumbuh tegak ke pusat bumi. Akar tunggangnya dapat menembus tanah

kedalaman 50-75 cm, akar serabutnya dapat menyebar ke samping dan memiliki

bulu-bulu akar. Perakaran akan berkembang baik jika tanahnya gembur, mudah

menyerap air

b. Batang, tanaman tembakau memiliki bentuk batang agak bulat, agak

lunak tetapi kuat, semakin ke ujung semakin kecil. Ruas-ruas batang mengalami

penebalan yang ditumbuhi daun

c. Daun, tanaman tembakau memiliki tulang daun menyirip, bagian tepi

daun agak bergelombang dan licin. Lapisan atas daun terdiri atas lapisan palisade

parenkim dan spongy parenkim pada bagian bawah. Jumlah daun dalam satu

tanaman 28-32 helai (Hanum, 2008).

d. Bunga, tanaman tembakau memiliki bunga yang tersusun dalam

tandan, kelopak banyak buluh dengan banyak gigi yang tidak sama panjang,


��

�

��

�

mahkota bunga yang berbentuk terompet, tepinya berlekuk 5, panjang yang tidak

sama (1 lebih pendek dari yang lainnya)

e. Buah, tanaman tembakau memiliki bakal buah yang berada di atas

dasar bunga dan terdiri atas dua ruang yang dapat membesar. Jika masak pecah

dengan membelah ruang (Tjitroepomo, 1994).

3. Tanaman C3

Cahaya matahari berperan dalam proses fotosintesis, fotorespirasi dan

respirasi suatu. Kebutuhan intesitas cahaya berbeda untuk setiap jenis tanaman

dikenal tiga tipe tanaman yaitu : C3, C4 dan CAM. Tanaman C3 adalah kelompok

tanaman yang memiliki kebutuhan terhadap cahaya matahari rendah. Ketika

tanaman C3 mendapatkan cahaya tinggi/berlebih pada siang hari, stomata

tertutup, fotorespirasi meningkat sehingga 02 diikat oleh Ribulosa Bi Phospat

(RUBP) menghasilkan senyawa Phospho Gliseric Acid (PGA) yang memiliki 3

atom C pada proses pengikatan C02 oleh yang terjadi secara spontan sehingga

energi yang dihasilkan untuk proses fotosintesis rendah (Anonima, 2011).

Naungan yang diberikan pada tanaman tembakau VBN bertujuan untuk

mengurangi intensitas cahaya sebesar 30% sehingga cahaya yang diperoleh

tanaman tersebut sebesar 70% (PT. Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998).

a


��

�

��

�

�

��b�Gambar 1. Daun tembakau (a) VBN dan (b) NO (PT. Perkebunan XIX, 1998)

Nikotin merupakan salah satu alkaloid yang terdapat dalam tanaman

tembakau ( Nicotiana tabaccum L. ). Alkaloid lain yang terdapat dalam tembakau

adalah nornikotin, anatabin dan anabasin.

Gambar 2. Struktur alkaloid dalam daun tembakau (Domino, 1999)

B. Nikotin

N

CH3 Gambar 3. Struktur kimia nikotin

Nikotin merupakan senyawa tak berwarna hingga kuning pucat, bersifat

sangat higroskopis. Nikotin dapat berubah warna (fotodegradasi) menjadi coklat

apabila terkena paparan sinar matahari dan udara. Berbau tajam serasa terbakar.


�

�

�

�

Sangat larut dalam alkohol, kloroform, eter, petroleum eter, kerosin, dan minyak

(The Merck Index, 1989).

Nikotin

N- N+

HCH3

Asetilkolin

�CH3 C

O_

OH2C

H2C N+(CH3)3

Gambar 4. Struktur nikotin dan asetilkolin (Domino, 1999)

Kemiripan nikotin dan asetilkolin terletak pada atom N piridin pada

nikotin yang merupakan pendonor elektron yang memiliki kesamaan dengan keto

oksigen pada gugus asetilkolin. Muatan positif atom N kuarterner pada asetilkolin

memiliki kesamaan muatan positif atom N cincin pirolidin nikotin

(Domino,1999).

Menurut Whagner (2003), asetilkolin (ACh) merupakan satu jenis

neurotransmiter yang berperan dalam regulasi sistem saraf tubuh dan membawa

pesan dari ke otak. Nikotin di dalam tubuh mampu menyalin asetilkolin, sehingga

setiap reseptor yang diarahkan untuk menanggapi asetilkolin merespon nikotin

juga. Dengan cara ini, nikotin dapat memicu pelepasan neurotransmiter lain.

Nikotin dapat memerintah kelenjar adrenal untuk melepaskan adrenalin,

pembuluh darah melepaskan norephinefrin menyebabkan tekanan darah

meningkat. Namun dari beberapa penelitian, nikotin berpotensi untuk terapi

penyakit Alzheimer, demetia Parkinson. Pada penyakit Parkinson, nikotin mampu

meningkatkan kemampuan kognitif dan motorik penderita (Anonimb, 2011).


��

�

��

�

Gambar 5. Jalur biosintesis nikotin dengan modifikasi (Anonim, 2010)

Gambar di atas merupakan jalur biosintesis nikotin. D-glukosa

merupakan produk fotosintesis yaitu sukrosa (karbohidrat disakarida) yang

mengalami hidrolisis menjadi D-glukosa dan fruktosa. D-glukosa tersebut siap

dipecah dalam proses glikolisis menjadi asam piruvat. Asam piruvat akan

dirombak untuk masuk dalam siklus krebs menjadi asetil Co-A. Asetil Co-A

berikatan dengan oksaloasetat dan menghasilkan citrat sampai �-ketoglutarat. �-

ketoglutarat menghasilkan 2 asam amino yaitu L-glutamate dan L-arginin yang


��

�

��

�

menghantarkan ke prekusor biosintesis nikotin yaitu L-ornithine (Salisbury dan

Ross, 1995).

Kadar nikotin yang diperoleh dengan menggunakan metode

spektrofotometri-UV dalam daun tembakau VBN sebesar 1,4135 dan NO sebesar

0,867% (PT.Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998).

C. Simplisia dan Penanganan Daun Tembakau

1. Simplisia

Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang

belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain simplisia

merupakan bahan yang dikeringkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan

Makanan, 1979).

2. Penanganan Daun Tembakau

Kegiatan yang harus dilakukan pada penanganan daun tembakau setelah

dipanen adalah sortasi pendahuluan, penyejunan, pengolahan untuk mendapatkan

hasil akhir yang baik

a. Sorasi pendahuluan, daun tembakau yang telah dipetik dan terkumpul

di tempat yang teduh disortasi terlebih dahulu sebelum tahap pengolahan daun.

Tujun dari sortasi pendahuluan yaitu : memudahkan proses pengolahan dan

memudahkan dalam pengelompokkan ke dalam kualitas menurut mutu

b. Penyejunan, kegiatan penataan daun tembakau dengan cara menusuk

bagian pangkal gagang daun/ibu tulang daun atau pada bagian ruas batang di

antara dua dua daun. Tujuan dari penyejunan yaitu : memudahkan dalam penataan


��

�

��

�

di ruang pengering/pengolahan dan mencegah daun tidak saling melekat ketika

kelembapan tinggi sehingga daun mengering secara merata

c. Curing, proses curing bertujuan melepaskan air dari daun tembakau

dari kadar air 80-90% menjadi 10-15% dan perubahan warna dari zat hijau daun

menjadi warna orange (Cahyono, 1998).

3. Tahapan proses curing

a. Penguningan, proses perubahan warna dari warna hijau menjadi warna

kuning karena hilangnya zat hijau daun ke zat kuning daun dan terjadi penguraian

zat tepung menjadi gula. Perubahan ini terjadi pada suhu 32-42ºC berlangsung

selama 55 sampai dengan 58 jam

b. Pengikatan warna, proses ketika seluruh daun sudah berwarna kuning

orange dari lembar daun sampai tulang daun, maka secara perlahan suhu

dinaikkan. Suhu yang digunakan 43-52ºC waktu yang diperlukan sekitar 18 jam

c. Pengeringan lembar daun, proses ini bertujuan untuk mengurangi

kadar air di dalam lembar daun dengan cara menaikkan suhu 53-62ºC. Ciri-ciri

proses ini, daun sudah terasa kering apabila dipegang, namun tulang daun masih

terasa basah, daun terlihat keriput atau keriting. Waktu yang dibutuhkan lebih

kurang 30-32 jam

d. Pengeringan gagang, proses ini dilakukan pada suhu 63-72ºC yang

memerlukan waktu normal 30-32 jam. Ciri-ciri tahapan ini selesai apabila seluruh

tulang daun sudah kering dan jika ditekuk batangnya akan patah dan berbunyi

krek (Hanum, 2008).


��

�

��

�

D. Ekstraksi

1. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,1995).

Ekstrak tumbuhan merupakan material yang diperoleh dengan cara

menyari bahan tumbuhan dengan pelarut tertentu. Terdapat beberapa jenis ekstrak

yaitu : ekstrak cair, ekstrak kental, dan ekstrak kering (Saifudin, 2011).

2. Ekstraksi

Ekstrak diperoleh dengan cara ekstraksi. Ekstraksi adalah kegiatan

penarikan zat aktif yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat

larut dengan pelarut cair. Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat

dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung

simplisia. Ekstraksi dipengaruhi oleh derajat kehalusan serbuk dan perbedaan

konsentrasi. Jika hanya dengan mencelupkan serbuk simplisia ke dalam pelarut,

maka ekstraksi tidak akan sempurna karena terjadi kesetimbangan antara larutan

zat aktif di luar sel dan larutan zat aktif di dalam sel (Direktorat Jendral

Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).

3. Cairan Penyari

Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor.

Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut : murah dan mudah


��

�

��

�

diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, bereaksi netral, tidak mudah menguap

dan tidak mudah terbakar, selektif yaitu mudah menarik zat berkhasiat yang

dikehendaki, tidak mempengaruhi zat yang berkhasiat dan diperbolehkan oleh

peraturan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).

Etanol dipertimbangkan sebagai penyari karena lebih selektif, kapang

dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20%, tidak beracun, netral, absorpsinya

baik dan panas yang digunakan untuk pemekatan lebih sedikit. Etanol dapat

melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin (Direktorat

Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).

4. Soxhletasi

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah

pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Penyarian dengan

soxhletasi menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif

yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (Direktorat Jendral Pengawasan Obat

dan Makanan, 2000).

Gambar 6. Alat Soxhlet (Anonimc, 2011)


��

�

��

�

Cairan penyari diisikan pada labu alas bulat, serbuk simplisia

ditempatkan pada kertas saring dan diletakkan pada tabung. Cairan penyari

dipanaskan hingga mendidih, kemudian uap penyari akan naik ke atas melalui

pipa samping, kemudian diembunkan kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun

ke labu melalui tabung yang berisi serbuk simplisia. Cairan penyari sambil turun

melarutkan zat aktif serbuk simplisia, karena terdapat sifon sehingga setelah

cairan mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan kembali ke labu (Direktorat

Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).

5. Penguapan Ekstrak Cair

Ekstrak cair yang memiliki konsistensi cair dan kandungan pelarutnya

yang masih tinggi dapat diubah menjadi bentuk ekstrak kental. Proses pengentalan

ini dapat dilakukan melalui penguapan dengan menggunakan alat Vacuum Rotary

Evaporator. Cara kerjanya yaitu perputaran labu dalam sebuah pemanas pada

temperatur dan kecepatan putar tertentu, akan menguapkan cairan yang

terkandung dalam ekstrak. Pengaturan dalamnya pencelupan ke dalam penangas

air, suhu penangas, hampa udara dan suhu pendingin membuat kondisi optimal

dapat terpenuhi sehingga proses pengentalan ekstrak dapat berlangung cepat

(Voight, 1994).

E. Spektrofotometri UV

Spektrofotometri UV adalah teknik analisis spektroskopik yang

menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultra violet dekat (190-380 nm)

dengan memakai instrumen spektrfotometer (Mulja dan Suharman, 1995).


��

�

��

�

Jika suatu molekul dikenakan radiasi elektromagnetik (REM) maka

molekul akan menyerap REM yang energinya sesuai. Interaksi antara molekul

dengan REM akan meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan

tereksitasi. Transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat energi dalam suatu

molekul yaitu transisi ��*, n��*, n��* dan ��*.

Gambar 7. Diagram tingkat energi elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007)

1.Transisi � � �*

Energi yang diperlukan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan energi

sinar yang frekuensinya terletak diantara UV vakum (>180 nm) sehingga kurang

begitu bermanfaat untuk analisis dengan cara spektrofotometri UV-Vis

2. Transisi n� �*

Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung

atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang

diperlukan untuk transisi n� �* lebih kecil dibanding transisi � � �* sehingga

sinar yang diabsorpsi memiliki panjang gelombang lebih panjang (150-250 nm)

3. Transisi n��* dan ��*

Untuk memungkinkan jenis transisi ini, maka molekul organik harus

mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam

gugus tersebut memberikan orbital phi yang diperlukan (Gandjar dan Rohman,

2007).


��

�

��

�

Pelarut dapat mempengaruhi transisi n��* dan ��*, hal ini berkaitan

dengan adanya perbedaan kemampuan pelarut untuk mensolvasi antara keadaan

dasar dengan keadaan tereksitasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 8. Pengaruh pelarut polar pada transisi ��* (Gandjar dan Rohman, 2007)

Molekul yang menunjukkan transisi ��*, keadaan dasar lebih non

polar dibandingkan keadaan eksitasi. Jika pelarut polar digunakan pada molekul

yang mengalami transisi ini, maka menyebabkan pelarut polar berinteraksi lebih

kuat dengan keadaan tereksitasi dibandingkan keadaan dasar, sehingga perbedaan

energi transisi ��* pada pelarut polar ini lebih kecil. Menyebabkan terjadinya

pergeseran panjang gelombang yang lebih besar dibandingkan panjang gelombang

semula (pergeseran bathokromik) (Gandjar dan Rohman, 2007).

Molekul yang menunjukkan transisi n��*, keadaan dasar lebih polar

dibandingkan keadaan tereksitasi. Pelarut akan berikatan hidrogen dengan

pasangan elektron yang tidak berpasangan pada molekul dalam keadaan dasar

dibandingkan pada molekul dalam keadaan tereksitasi (Gandjar dan Rohman,

2007).

Gambar 9. Pengaruh pelarut polar pada transisi n��* (Gandjar dan Rohman, 2007)


��

�

��

�

Terjadinya eksitasi elektronik pada panjang gelombang yang

memberikan absorbansi yang maksimum disebut panjang gelombang maksimum.

Penentuan panjang gelombang maksimum yang tetap dapat digunakan untuk

identifikasi molekul yang bersifat karakteristik sebagai data sekunder, sehingga

spektrum UV-Vis dapat untuk tujuan analisis kualitatif dan kuantitatif (Mulja dan

Suharman, 1995).

F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1. Definisi dan Instrumentasi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa disebut juga

dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk

atau dalam sediaan farmasetik, serta dalam cairan biologis (Rohman, 2009).

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak, pompa,

alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah

penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam

(Rohman, 2009). Instrumentasi KCKT dapat dilihat pada gambar 10.

Gambar 10. Instrumentasi KCKT (Kazakevich and Nair, 1996)

a. Wadah fase gerak dan fase gerak, alat KCKT yang baru dilengkapi

dengan satu atau lebih wadah gelas, yang mengandung 500 mL atau lebih fase


� �

�

� �

�

gerak. Sonikasi (penghilangan gas) biasanya dilakukan terlebih dahulu pada fase

gerak untuk menghilangkan gas yang mungkin terdapat di dalamnya. Adanya gas

dapat menyebabkan flow rate yang tidak reprodusibel serta dapat mengganggu

detektor (Skoog, Holler, Crouch, 1998). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri

atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan

dalam daya elusi dan resolusi

Fase gerak yang sering digunakan adalah campuran metanol atau

asetonotril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk analit yang bersifat asam

atau basa lemah, peranan pH sangat penting karena jika pH fase gerak tidak diatur

maka analit akan mengalami ionisasi sehingga ikatan dengan fase diam akan

menjadi lemah jika dibandingkan dengan bentuk tidak terionisasi, spesies yang

terionisasi akan terelusi lebih cepat (Rohman dan Ganjar, 2007).

Pelarut yang digunakan dalam analisis menggunakan KCKT detektor UV

hendaknya memiliki UV cut-off yang jauh dari panjang gelombang serapan analit.

Hal ini karena pada panjang gelombang tersebut kepekaan detektor UV sangat

lemah (Mulja dan Suharman, 1995). Karakteristik beberapa pelarut yang sering

digunakan pada analisis menggunakan KCKT disajikan pada tabel I.


��

�

��

�

Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut yang digunakan dalam KCKT Pelarut Indeks

polaritas

Nilai eluotropik UV cut-

off (nm) Alumina C18 Silika

Heksan 0.1 0.01 - 0.00 195

Sikloheksan 0.2 0.04 - - 200

Toluen 2.4 0.29 - 0.22 284

Tertrahidrofuran 4.0 0.45 3.7 0.53 212

Etil Asetat 4.4 0.58 - 0.48 256

Aseton 5.1 0.56 8.8 0.53 330

Metanol 5.1 0.95 1.0 0.7 205

Asetonitril 5.8 0.65 3.1 0.52 190

Dimetilformamida 6.4 - 7.6 - 268

Dimetilsulfoksida 7.2 0.62 - - 268

Air 10.2 - - - 190

b. Pompa, dalam alat KCKT pompa yang memenuhi syarat wadah pelarut,

yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya

mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan alir 3 mL/menit (Rohman, 2009).

c. Tempat penyuntikan sampel, sampel-sampel cair dan larutan

disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan

menuju kolom. (Gandjar dan Rohman, 2007).

d. Kolom, kolom merupakan bagian KCKT yang terdapat fase diam di

dalamnya. Oktadesilsilan (C18) merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang

rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih

sesuai untuk pelarut yang bersifat polar (Rohman, 2009).


��

�

��

�

Pada KCKT fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,

silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.

Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus

silanol (Si-OH). ODS atau C18 merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang

rendah, sedang, maupun tinggi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan

waktu retensi yang bervariasi karena adanya kandungan air yang digunakan

(Gandjar dan Rohman, 2007).

e. Detektor, persyaratan detektor KCKT adalah sensitivitas yang tinggi,

rentang sensitivitas (10-8 – 10-15 analit/detik), kestabilan dan reprodusibilitas yang

baik memberikan respon yang linier terhadap konsentrasi analit, dapat bekerja dari

temperatur kamar sampai 400oC, tidak terpengaruh oleh perubahan temperatur

dan kecepatan dari fase gerak, mudah didapat dan mudah dioperasikan, selektif

terhadap berbagai macam analit di dalam fase gerak, tidak merusak sampel, dapat

menghilangkan zone broadening dengan adanya pengaruh minimal internal

volume (Mulja dan Suharman, 1995).

2. Analisis Kualititatif dan Kuantitatif

Analisis kualitatif KCKT berupa pengamatan waktu retensi (tR) senyawa

baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi

secara berurutan dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan waktu

pengoperasian antara keduanya sekecil mungkin (Gandjar dan Rohman, 2007).

Untuk KCKT kuantifikasi dapat dilakukan dengan mengukur tinggi

puncak atau dengan luas puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis


��

�

��

�

dasar ke puncak maksimum. Sedangkan luas puncak diukur sebagai hasil kali

tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2) (Gandjar dan Rohman, 2007).

G. Landasan Teori

Tanaman tembakau merupakan kelompok tanaman C3. Tanaman C3

adalah tanaman yang kebutuhan terhadap intensitas cahaya rendah. Cahaya

matahari berperan dalam proses fotorespirasi, fotosintesis dan respirasi tumbuhan.

Pada siang hari tanaman C3 (tanaman tembakau) mendapatkan intensitas cahaya

yang tinggi menyebabkan terjadinya pengikatan CO2 secara spontan oleh RDP hal

ini disebabkan O2 lebih banyak sehingga CO2 yang berperan dalam proses

fotosintesis sedikit, karbohidrat (CH2O)n yaitu D-glukosa hasil hidrolisis dari

sukrosa sebagai produk fotosintesis dan substrat respirasi berkurang sehingga L-

ornithine yang dihasilkan dari tahap Glikolisis dan Siklus Krebs sebagai prekusor

biosintesis nikotin berkurang.

Tanaman tembakau VBN adalah tanaman yang diberikan naungan

sehingga intensitas cahaya yang diterima lebih sedikit dibandingkan tembakau

NO yang tidak diberi naungan.

Proses ektraksi dengan menggunakan soxhlet menghasilkan ekstrak daun

tembakau yang mengandung nikotin. Nikotin memiliki efek farmakologis yang

menguntungkan yaitu mampu meningkatkan kemampuan kognitif dan motorik.

Nikotin memiliki kromofor pada cincin piridin sehingga dapat dideteksi

kadarnya menggunakan spekrofotometri-UV, diperoleh kadar nikotin terdapat

dalam daun tembakau VBN sebesar 1,413% dan NO sebesar 0,867%.


��

�

��

�

Metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dapat

digunakan untuk menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau

VBN dan NO karena metode ini selektif dalam memisahkan senyawa

multikomponen dengan waktu yang relatif singkst. Metode KCKT fase terbalik

ini telah dioptimasi dan divalidasi.

Penetapan kadar dilakukan dengan membandingkan nilai AUC (Area

Under Curve) antara sampel ekstrak etanolik daun tembakau dengan AUC standar

baku nikotin. Persamaan kurva baku nikotin yang didapat merupakan kurva

hubungan antara konsentrasi baku nikotin dengan nilai AUC yang dihasilkan,

dinyatakan dengan y = bx + a, dimana y adalah AUC dan x adalah kadar nikotin,

maka AUC sampel dimasukkan dalam persamaan, kemudian kadar dari sampel

nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dapat diketahui.

H. Hipotesis

Terdapat perbedaan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau

VBN dan NO.


�

�

��

�

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini mengikuti jenis penelitian non eksperimental deskriptif,

karena tidak terdapat intervensi terhadap subyek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanolik daun tembakau VBN

dan NO.

2. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar nikotin yang terdapat

dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO.

3. Variabel pengacau pada penelitian ini adalah

a. kemurnian pelarut, sehingga digunakan pelarut pro analysis yang memilki

kemurnian tinggi.

b. larutan baku nikotin yang bersifat mudah teroksidasi oleh udara dan

cahaya, diatasi dengan menggunakan alumunimum untuk menutupi alat-

alat gelas.

c. pH pelarut dan fase gerak yang dikendalikan dengan buffer pada pH 4.

C. Definisi Operasional

1. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang digunakan dalam

penelitian ini menggunakan kolom fase diam oktadesilsilan (C18) dan


��

�

��

�

komposisi fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) dengan

kecepatan alir 1,2 mL/menit.

2. Ekstrak etanolik daun tembakau yang digunakan adalah VBN dan NO.

3. Kadar nikotin dalam 1 gram ekstrak dinyatakan dalam satuan % b/b ± SD.

D. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas pro

analysis kecuali dinyatakan lain yakni baku nikotin (E. Merck), ammonium asetat

(E. Merck), natrium asetat (E. Merck), asam asetat glasial (E. Merck), asetonitril

(E. Merck), metanol (E. Merck), natrium hidroksida 4M (E. Merck), kloroform (E.

Merck), asam klorida (teknis), etanol (teknis), aquades, aquabides dan ekstrak

etanolik daun tembakau VBN dan NO.

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan adalah Spektrofotometer UV-Vis (merek Optima

SP-300 Plus), seperangkat alat KCKT fase terbalik terdiri : pompa (merek

Shimadzu LC-10 AD No.C20293309457 J2) dengan sistem elusi gradien, detektor

UV-Vis (merek Shimadzu SPD 10 AV No.C20343502697 KG), kolom C-18

merek Bondapack C-18 dengan panjang kolom 25 cm No.P61271BO2,

seperangkat alat komputer (merek Dell Vostro 220, printer merek HP D2566),

alat ultrasonikator (Retsch tipe T640 no 935922013), membran filter Whatman

ukuran pori 0,45 �m dan diameter 47 mm, nerca analitik merek Ohaus, milipore,

mikropipet, indikator pH, seperangkat alat gelas.


��

�

��

�

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan buffer asetat (pH 4)

Buffer asetat dibuat dengan cara menimbang 0,1683 g ammonium asetat,

0,5599 g natrium asetat dan diambil 0,406 mL asam asetat glasial. Ketiga zat

tersebut dimasukkan ke dalam labu takar 250,0 mL kemudian dilarutkan dengan

aquabides hingga batas tanda. (Larutan buffer ini harus selalu dibuat baru untuk

mencegah tumbuhnya mikroorganisme).

2. Pembuatan fase gerak

Campuran fase gerak yang digunakan untuk penelitian ini adalah

campuran buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6). Masing-masing larutan fase

gerak disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman dengan bantuan

pompa vakum, kemudian diultrasonikasi selama 15 menit.

3. Pengambilan dan pembuatan sampel

Sampel yang digunakan berupa lembaran daun tembakau kering VBN dan

NO. Teknik pengambilan yaitu daun tembakau diambil secara acak mewakili

setiap deret tanaman tembakau di lahan PT. Perkebunan Nusantara X (Persero)

Klaten, dan dilakukan proses penyerbukan.

4. Pembuatan larutan baku nikotin

a. Pembuatan larutan stok nikotin. Larutan stok nikotin 2 ppm dibuat

dengan cara mengambil sebanyak 10 �L baku nikotin dan dimasukkan dalam labu

ukur 5,0 mL. Encerkan dengan fase gerak hingga tanda.

b. Pembuatan seri larutan baku nikotin. Lima seri larutan baku nikotin

dibuat dengan konsentrasi 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,09 ppm dengan cara


��

�

��

�

mengambil larutan stok nikotin dengan mikropipet sebanyak 25; 75; 125; 175;

225 �L, dimasukkan dalam labu ukur 5,0 mL dan diencerkan dengan fase gerak

(buffer asetat:metanol: asetonitril) hingga tanda. Larutan disaring dengan milipore

dan diawaudarakan selama 15 menit.

5. Penetapan � maksimum

Tiga seri larutan baku nikotin dengan konsentrasi 0,005; 0,007; 0,009

ppm. Masing-masing konsentrasi dibaca absorbansinya pada panjang gelombang

225-325 nm. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang

memberikan serapan terbesar dan sama pada 3 seri konsentrasi larutan baku

nikotin.

6. Pembuatan kurva baku nikotin

Seri larutan baku dengan konsentrasi 0,01; 0,03; 0,05; 0,07 dan 0,09

ppm, masing-masing larutan disaring dengan menggunakan milipore kemudian

diultrasonikasi selama 15 menit dan 20 µL dari masing-masing larutan

diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam C18 dan fase gerak

buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) pada kecepatan alir 1,2 mL/menit. Dari

kromatogram diperoleh luas area nikotin untuk masing-masing konsentrasi. Luas

area ini kemudian diplotkan terhadap konsentrasi nikotin untuk memperoleh

regresi linear dengan persamaan y = bx + a.


��

�

��

�

7. Pembuatan HCl encer

Asam klorida pekat (HCl P) 22,6 mL dimasukkan dalam labu takar 10,0

mL kemudian encerkan dengan aquabidest hingga tanda.

8. Pembuatan NaOH 4 M

Natrium hidroksida pro analisis (NaOH p.a) ditimbang sebanyak 4 g dan

dimasukkan dalam labu takar 25,0 mL larutkan dan encerkan dengan aquabidest

hingga tanda.

9. Preparasi Sampel

Ekstrak kental daun tembakau VBN dan NO ditimbang kurang lebih

seksama 1 g, dilarutkan dalam 10 mL asam klorida encer dengan bantuan

ultrasonikator selama 30 menit hingga semuanya larut. Kemudian larutan

ditambah 10 mL kloroform dalam corong pisah, dilakukan penggojogan selama 5

menit hingga terbentuk 2 lapisan, lapisan kloroform (fase bawah) dibuang.

Kemudian ditetesi NaOH 4M hingga pH larutan 11-12, setelah itu ditambahkan

10 mL kloroform lanjutkan ekstraksi selama 5 menit. Lapisan kloroform diuapkan

di ruang asam hingga semua kloroform teruapkan (tersisa residunya). Residu

kemudian dilarutkan dengan fase gerak ke dalam labu takar 5,0 mL dan

diencerkan dengan cara pipet 100 �L larutan ke dalam labu takar 10,0 mL hingga

tanda. Saring dengan milipore dan diawaudarakan selama 15 menit. Dilakukan

replikasi lima kali dari kedua jenis sampel.

10. Ekstraksi daun tembakau

a.Optimasi lama waktu ekstraksi. Serbuk daun tembakau VBN dan NO

ditimbang kurang lebih seksama 20 g. Kemudian dibungkus dengan kertas saring


� �

�

� �

�

dan dimasukkan dalam tabung soxhlet dengan 130 ml etanol teknis 96% dalam

LAB. Optimasi lama waktu ekstraksi dilakukan pada waktu 7; 8; 9; dan 10 jam

dengan suhu waterbath 80-90 ºC. Filtrat yang didapat diuapkan dengan vacuum

rotary evaporator pemanas waterbath pada suhu 65 ºC selama 10 menit hingga

diperoleh ekstrak agak kental dan dituangkan dalam cawan porselin. Diuapkan di

atas waterbath suhu 80ºC. Didapat ekstrak kental tembakau.

b. Ekstraksi daun tembakau hasil optimasi. Dilakukan prosedur yang

sama dengan optimasi lama waktu ekstraksi dengan menggunakan waktu optimal

ekstraksi selama 8 jam.

11. Penetapan Kadar Nikotin dalam Sampel

Sampel yang dipreparasi diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam sistem

KCKT yang telah dioptimasi sehingga didapatkan kromatogram sampel dan

dibaca AUC dari masing-masing replikasi. Masukkan hasil AUC ke persamaan

regresi linear baku nikotin dari hasil validasi sehingga diperoleh kadar sampel.

G. Analisis Hasil

Analisis kualitatif dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan

baku nikotin. Analisis kuantitatif dapat dihitung dengan memasukkan AUC

sampel ke dalam persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva baku nikotin

hasil validasi y = bx + a. sehingga didapat kadarnya. Satuan kadar nikotin adalah

%b/b ± SD.

Selanjutnya dilakukan analisis statistik dilakukan untuk melihat apakah kadar

nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO berbeda bermakna


��

�

��

�

atau tidak. Uji statistik yang digunakan adalah uji normalitas Shapiro-Wilk untuk

mengetahui data yang diperoleh normal atau tidak, uji t tidak berpasangan untuk

mengetahui kadar yang diperoleh dari kedua sampel tersebut berbeda bermakna

atau tidak.

�


�

�

��

�

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan

NO dapat dianalisis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT) fase terbalik karena metode yang digunakan telah dioptimasi dan

divalidasi terlebih dahulu pada awal penelitian.

Pada tahap optimasi diperoleh kondisi optimum yaitu kolom fase diam

oktadesilsilan (C18) dan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6),

kecepatan alir 1,2 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang maksimum

260 nm dengan nilai resolusi 1,5679, tailing factor 1,25; jumlah lempeng teoritis

2247,163 dan nilai HETP 0,0111 (Ernesta, 2011).

Pada tahap validasi metode diperoleh bahwa metode KCKT fase terbalik

memenuhi parameter validasi meliputi selektifitas dengan nilai resolusi (Rs)

1,531, linearitas dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,9996, presisi dan akurasi

pada konsentrasi 0,05 dan 0,09 ppm. Metode KCKT fase terbalik ini memenuhi

kriteria validasi metode pada rentang konsentrasi 0,05-0,09 ppm (Syenina, 2011).

A. Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari hasil

optimasi yaitu buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6). Berdasarkan

kepolarannya, sistem kromatografi yang digunakan adalah sistem kromatografi

fase terbalik karena fase gerak lebih polar dibandingkan fase diam oktadesilsilan.


��

�

��

�

Menurut (Kazakevich, 2007) fase gerak yang paling sering digunakan untuk

pemisahan KCKT fase terbalik adalah modifikasi metanol dan asetonitril karena

memiliki eluent strenght yang kuat. Metanol memiliki eluent strenght 1,0

sedangkan asetonitril memiliki eluent strenght 3,1. Semakin besar nilai eluent

strenght, semakin besar kemampuan elusinya sehingga waktu retensi dari sampel

menjadi semakin singkat.

Buffer asetat adalah salah satu komponen dalam fase gerak yang

digunakan dalam penelitian ini terdiri dari asam lemah (asam asetat glasial) dan

basa konjugatnya (natrium asetat dan amonium asetat) yang bertujuan agar nikotin

(senyawa yang akan dianalisis) mudah terion. Pemilihan buffer berdasarkan nilai

pKa dari senyawa yang akan dianalisis. Menurut Kazakevich dan LoBrutto

(2007), pH buffer yang digunakan ± 2 unit dari pKa analit agar analit berada

dalam bentuk tunggal yakni bentuk terion atau bentuk molekul utuh.

Nikotin memiliki nilai pKa 8,5 (Landoni, 1991). Dalam penelitian ini,

buffer asetat dibuat pada pH 4. Campuran fase gerak terdapat 54 % metanol dan

6% asetonitril. Setiap penambahan 10 % senyawa organik mengalami penurunan

pH yaitu 0,2 unit sehingga pKa nikotin mengalami pergeseran 7,3 dan pH dari

buffer asam mengalami pergeseran sebanyak 1,2 unit ke atas. Pada penelitian ini,

pH dari buffer yang digunakan 2 unit di bawah pKa nikotin agar nikotin menjadi

bentuk terion sehingga lebih cepat terelusi oleh fase gerak (Kazakevich dan

LoBrutto, 2007). Sehingga pH dari buffer asetat maksimum 4,1 agar nikotin tetap

dalam bentuk terion.


��

�

��

�

N

N

CH3

H2O / H+

N

NH3C H

+

Gambar 11. Nikotin dalam bentuk terion

Masing-masing komponen dari fase gerak disaring menggunakan kertas

Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan partikel asing

dalam larutan fase gerak yang dapat menyumbat kolom, kemudian larutan

diawaudarakan menggunakan ultrasonikator untuk menghilangkan gelembung

udara yang mempengaruhi tekanan pada pompa KCKT yang berpengaruh pada

waktu retensi.

B. Pengambilan dan Pembuatan Sampel

Tujuan penelitian ini adalah untuk membandingkan kadar nikotin dalam

ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO. Teknik pengambilan yaitu daun

tembakau diambil secara acak mewakili setiap deret tanaman tembakau di lahan

PT. Perkebunan Nusantara X (Persero) Klaten.


adalah tanaman yang kebutuhan terhadap intensitas cahaya rendah. Pemberian

naungan pada tanaman tembakau untuk mengurangi intensitas cahaya sebesar

30%, sehingga intensitas cahaya yang diperoleh tanaman tembakau sebesar 70%

(PT.Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998).


��

�

��

�

Kadar nikotin yang terdapat pada berat kering tembakau 0,6-3% dengan

proses biosintesis di akar dan terakumulasi di daun, sehingga pada penelitian ini

bagian tanaman tembakau yang digunakan adalah bagian daun.

Proses pembuatan simplisia merupakan salah faktor untuk menjamin

keseragaman senyawa aktif, keamanan dan kegunaan. Proses pembuatan simplisia

meliputi : sortasi basah, pencucian, perajangan dan pengeringan (Direktorat

Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1985). Tahap penanganan daun

tembakau setelah dipanen tidak jauh berbeda dengan proses pembuatan simplisia

meliputi : sortasi pendahuluan dengan cara memisahkan daun tembakau

berdasarkan ukuran dan kecacatan daun yang bertujuan memperoleh keseragaman

mutu, tahap selanjutnya penyejunan dan proses curing. Tahapan tersebut tidak

dilakukan oleh peneliti, melainkan dilakukan oleh PT. Perkebunan Nusantara X,

sehingga daun tembakau VBN dan NO untuk penelitian ini sudah diperoleh berupa

lembaran daun tembakau yang berwarna orange dan kering.

Proses penyerbukan daun tembakau untuk memperkecil ukuran partikel.

Proses penyerbukan daun tembakau dilakukan di Lembaga Pusat Penelitian

Terpadu (LPPT) UGM dengan ukuran lubang pengayakan serbuk 1mm. Tujuan

dari pengayakan untuk memperoleh serbuk sedikit halus, tidak lolos dari kertas

saring yang akan digunakan untuk ekstraksi. Menurut Farmakope Indonesia edisi

IV, ukuran lubang pengayak 1,00 mm menunjukkan nomor pengayak 18. Derajat

halus serbuk dalam Farmakope Indonesia edisi III dinyatakan dengan nomor

pengayak. Apabila derajat halus suatu serbuk dinyatakan dengan satu nomor,

dimaksudkan bahwa semua serbuk dapat melalui pengayak dengan nomor


��

�

��

�

tersebut. Nomor pengayak 18 berarti semua serbuk dapat melalui pengayak nomor

18.

C. Pembuatan Larutan Baku

Larutan baku nikotin dibuat dengan melarutkan sejumlah tertentu baku

nikotin E.merck dalam pelarut. Pelarut yang digunakan adalah sama dengan fase

gerak yaitu buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6), untuk menghindari

terjadinya perbedaan solvent strength antara pelarut dan fase gerak. Solvent

strenght merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi waktu retensi.

Pembuatan larutan stok baku nikotin dengan konsentrasi 2 ppm,

kemudian dibuat 5 seri konsentrasi larutan baku nikotin yaitu : 0,01; 0,03; 0,05;

0,07 dan 0,09 ppm.

D. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk memperoleh

panjang gelombang analisis yang dapat memberikan serapan maksimum dari

nikotin. Penetapan panjang gelombang nikotin dilakukan dengan menggunakan

spektrofotometer UV pada rentang panjang gelombang 225 – 325 nm karena

menurut Cordell panjang gelombang maksimum nikotin 262 nm. Pengukuran

�maks dilakukan pada 3 seri konsentrasi yaitu rendah (0,005 ppm), tengah (0,007

ppm), dan tinggi (0,009 ppm). Dapat dilihat hasil spektra panjang gelombang

nikotin dari 3 seri konsentrasi pada gambar 12.


��

�

��

�

Gambar 12. A = konsentrasi 0,005 ppm absorbansi 0,205, � maksimum 260 nm; B =

konsentrasi 0,007 ppm, absorbansi 0,333, , � maksimum 260 nm dan C = konsentrasi 0,009 ppm, absorbansi 0,374, � maksimum 260 nm

Dari ketiga gambar spektra nikotin yang diperoleh terlihat bahwa bentuk

spektra yang dihasilkan pada tiga level konsentrasi sama. Panjang gelombang

yang menghasilkan serapan maksimum nikotin terletak pada 260 nm. Menurut

Mulja, 1995 penentuan panjang gelombang maksimum yang pasti (tepat) dapat

digunakan sebagai data sekunder (analisis kualitatif).

Syarat suatu senyawa dapat dianalisis oleh spektrofotometer UV adalah

memiliki kromofor. Nikotin memiliki kromofor pada cincin piridin.


��

�

��

�

�

Gambar 13. Kromofor cincin piridin

E. Pembuatan Kurva Baku Nikotin

Pembuatan kurva baku telah dilakukan pada tahap validasi. Kurva baku

menunjukkan hubungan antara AUC dengan konsentrasi analit pada beberapa seri

baku. Dalam penelitian ini dibuat tiga replikasi kurva baku, kemudian dipilih

persamaan regresi linear yang memberikan nilai koefisien korelasi (r) dengan

kriteria r � 0,999 (Center for Drug Evaluation and Research, 1994). Diperoleh

persamaan regresi linear y = 20708810x + 82847,5 dengan nilai koefisien korelasi

yaitu 0,9996. Persamaan regresi linear ini digunakan untuk menghitung kadar

nikotin dalam ekstrak daun tembakau.

Berdasarkan grafik hubungan pada gambar (14) antara konsentrasi analit

(baku nikotin) dan AUC baku terlihat bahwa semakin meningkatnya konsentrasi

baku nikotin, semakin meningkat AUC baku.

Gambar 14. Grafik hubungan antara konsentrasi nikotin dengan AUC


��

�

��

�

F. Ekstraksi secara Soxhletasi dan Penguapan Ekstrak Cair

Serbuk daun tembakau diekstraksi dengan metode soxhletasi dengan cara

sejumlah serbuk dijahit dengan menggunakan kertas saring agar tetesan-tetesan

dari cairan penyari dapat membasahi kertas saring sehingga dapat menyari serbuk

daun tembakau tersebut. Cairan penyari yang digunakan adalah etanol 96% karena

nikotin larut dalam etanol, sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif

yang optimal dan tidak beracun (Voight, 1994). Prinsip metode soxhletasi adalah

pemanasan yang menyebabkan cairan penyari naik ke atas, diembunkan oleh

pendingin menjadi tetesan-tetesan yang akan turun ke tabung berisi sebuk yang

telah dibungkus kertas saring. Cairan penyari akan menetes melarutkan zat aktif

jika volume tetesan telah mencapai permukaan, seluruh pelarut akan turun

kembali ke labu alas bulat sehingga sirkulasi terjadi berulang-ulang yang akan

menghasilkan penyarian yang baik.

Gambar 15. Proses ekstraksi dengan alat soxhlet

Tahap selanjutnya dilakukan penguapan ekstrak cair karena kandungan

pelarutnya masih tinggi. Penguapan ekstrak dengan meggunakan vacuum rotary

evaporator (VRE) mempercepat penguapan pelarut. Pada penelitian ini, suhu


� �

�

� �

�

yang digunakan adalah 65ºC yang dilakukan selama 10 menit. Setelah diperoleh

ekstrak cair yang lebih pekat hasil evaporasi, dipekatkan kembali dengan

diuapkan di atas waterbath pada suhu 80ºC hingga diperoleh ekstrak kental.

Sampel dalam cawan ditutup aluminium foil dan disimpan dalam desikator.

G. Optimasi Waktu Ekstraksi Nikotin dalam Serbuk Daun Tembakau

Tujuan dari optimasi waktu ekstraksi nikotin dari serbuk daun tembakau

untuk mendapatkan waktu ekstraksi yang paling optimum sehingga nikotin

terekstraksi seluruhnya. Metode yang digunakan untuk penelitian ini adalah

soxhletasi karena pengerjaannya mudah, cepat, cairan penyari yang digunakan

lebih sedikit daripada metode ekstraksi lain dan secara langsung diperoleh hasil

ekstraksi yang lebih pekat (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan,

1986).

Variasi optimasi waktu ekstraksi pada penelitian ini adalah 7; 8; 9; 10

jam. Optimasi waktu 7 jam digunakan sebagai waktu optimasi terendah karena

dilakukan orientasi ekstraksi terlebih dahulu selama 5 jam diperoleh hasil yaitu

cairan penyari yang terdapat pada tabung soxhlet berwarna hijau tua (pekat).

Berdasarkan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan (1986), optimasi

dikatakan sempurna jika cairan penyari pada tabung soxhlet tidak berwarna.

Ekstrak kental dari masing-masing waktu ekstraksi dikumpulkan, dilanjutkan

preparasi sampel dan diinjek ke instrument KCKT. Diperoleh hasil kromatogram

dan respon AUC pada gambar 16.


��

�

��

�

A

B

C

D


��

�

��

�

E

F

G

H

Keterangan gambar 16 = A: 7 jam-1, B: 7 jam-2, C: 8 jam-1, D: 8 jam-2,

E: 9 jam-1, F: 9 jam-2, G: 10 jam-1, H: 10 jam-2


��

�

��

�

Tabel II. Hasil pengukuran AUC sampel dengan variasi waktu ekstraksi sampel dengan soxhlet

Waktu (jam)

7 A 7 B 8 A 8 B 9 A 9 B 10 A 10 B

AUC 1072305 1135700 1228904 123771 916992 942139 659037 644588

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada gambar 15 dan tabel II

menunjukkan peningkatan respon AUC pada 7 jam ekstraksi ke 8 jam ekstraksi,

dan terjadi penurunan respon AUC pada 9 jam ekstraksi dan 10 jam ekstraksi,

maka waktu optimum proses ekstraksi dengan soxhlet adalah 8 jam karena

menghasilkan respon AUC paling tinggi. Hal ini dimungkinkan terdapat pengaruh

lama waktu ekstraksi terhadap stabilitas dari nikotin. Suhu yang harus

diperhatikan dalam panci pemanas antara 85 – 87ºC, proses ekstraksi terjadi

secara berkesinambungan. Pelarut diperbolehkan berada di dalam refluks selama 8

jam (Raymond et al., 1991).

H. Ekstraksi dengan Waktu Optimum 8 jam

Berdasarkan data yang diperoleh dari optimasi waktu ekstraksi,

dilanjutkan dengan ekstraksi Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst

dengan waktu optimum ekstraksi selama 8 jam. Hasil kromatogram dan respon

AUC dari kedua sampel dapat dilihat pada gambar 17 dan tabel III.

A


��

�

��

�

B

C

D

E


��

�

��

�

F

G

H

I


��

�

��

�

J Gambar 16 = A:NO 1; B:NO 2; C:NO 3; D:NO 4; E:NO 5; F:VBN 1; G:VBN 2; H:VBN 3;

I:VBN 4; J:VBN 5.

Tabel III. Hasil pengukuran AUC ekstraksi serbuk daun tembakau jenis VBN dan NO dengan soxhlet selama 8 jam

Replikasi AUC

Na Oogst Vorstenlanden 1 627977 1258549

2 628873 1232800

3 626067 1231498

4 628265 1238593

5 628560 1232771

I. Preparasi Sampel

Ekstrak etanolik daun tembakau terdapat senyawa alkaloid selain nikotin

misalnya anabasin, anatabin, dan nornikotin. Ekstraksi dilakukan untuk

meminimalkan campuran senyawa yang terdapat dalam ekstrak daun tembakau.

Sampel yang berupa ekstrak kental ditimbang ± 1 gram dilarutkan dalam HCl

encer dengan bantuan ultrasonikator selama 30 menit. Pada tahap ini nikotin yang

terkandung dalam sampel akan bereaksi dengan asam klorida membentuk nikotin

hidroklorida yang larut dalam fase air, kemudian ditambahkan kloroform

sebanyak 10 mL, diekstraksi menggunakan corong pisah. Penambahan kloroform

untuk menarik senyawa-senyawa non polar.


��

�

��

�

N

N

CH3

+

N

NH3C HHCl

nikotin asam klorida nikotin hidroklorida

-Cl+

�Gambar 18 . Reaksi antara nikotin dengan asam klorida

Fase air yang mengandung nikotin hidroklorida ditampung dan

ditambahkan 8 mL NaOH 4 M mencapai pH 11-12, agar nikotin hidroklorida

kembali dalam suasana basa atau ke bentuk molekulnya�� Sehingga dengan

penambahan kloroform yang kedua nikotin akan terlarut dalam fase kloroform.

N

N

H3C H+-Cl

�� + NaOH

�

N

N

CH3

+ NaCl + H2OGambar 19. Reaksi antara nikotin hidroklorida

dengan NaOH

Penambahan 10 ml kloroform dan diekstraksi menggunakan corong pisah

(5 menit), kemudian fraksi kloroform ditampung dan diuapkan di ruang asam

hingga tersisa residu nikotin, karena titik didih nikotin adalah 247°C sehingga

nikotin tidak ikut menguap bersama kloroform. Residu dilarutkan menggunakan

fase gerak dan dilakukan pengenceran sepuluh kali lipat untuk memperoleh

respon analit yang masuk dalam area under curve (AUC) kurva baku . Pada

larutan sampel masih terdapat senyawa lain yang larut dalam fase kloroform yang

akan dipisahkan pada analisis menggunakan KCKT. Larutan sampel disaring

dengan penyaring millipore dan diawaudarakan dengan utrasonikator untuk

Nikotin hidroklorida NaOH Nikotin


��

�

��

�

menghilangkan gelembung udara, adanya gelembung udara dapat menggangu

mengganggu proses pemisahan sampel.

J. Analisis Kualitatif Nikotin

Waktu retensi atau waktu tambat yang dinyatakan dalam satuan waktu

(menit) merupakan parameter analisis kualitatif dalam KCKT. Waktu retensi

adalah waktu yang dibutuhkan analit saat diinjek sampai keluar dari kolom dan

terdeteksi oleh detektor (Mulja dan Suharman, 1995).

Waktu retensi (tR) suatu analit sangat dipengaruhi oleh interaksi analit

dengan fase diam dan fase gerak. Jika waktu retensi analit semakin singkat maka

interaksi analit lebih besar dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam.

Dalam penelitian ini, fase diam yang digunakan kolom oktadesilsilan (C18) yang

bersifat non polar dan fase gerak yang digunakan adalah buffer

asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) bersifat lebih polar dibandingkan fase diam.

Dari sistem kromatografi fase terbalik, senyawa polar akan terelusi terlebih

dahulu daripada senyawa non polar sehingga waktu retensinya lebih singkat.

Dilihat dari strukturnya pada gambar (20), nikotin memiliki bagian polar

dan non polar. Bagian polar terdapat pada cincin piridin dan pirolidin dan bagian

non polar terdapat pada metil.

�Gambar 20. Struktur nikotin dengan bagian polar dan non polar

��

�

��


��

�

��

�

Nikotin memiliki bagian polar yang akan berinteraksi melalui interaksi

hidrogen dengan fase gerak, sedangkan bagian non polarnya akan berinteraksi

secara Van der Waals dengan rantai alifatis fase diam oktadesisilan (C18).

Gambar 21. Interaksi nikotin dengan fase diam oktadesilsilan (C18)

Nikotin akan berinteraksi dengan fase gerak buffer

asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) melalui interaksi hidrogen dan ionik. Interaksi

hidrogen terjadi pada atom nitrogen cincin piridin, sedangkan interaksi ionik

terjadi pada atom nitrogen cincin pirolidin yang terprotonasi karena suasana asam

dari buffer asetat. Karena interaksi hidrogen dan ionik lebih kuat dibandingkan

interaksi Van der Waals antara bagian non polar nikotin dengan fase diam,

sehingga nikotin dapat terelusi dari kolom.

��

�� !��


� �

�

� �

�

N

N+

Ch3

H

HO

H3C HO

H CH3

HO

H3CH

O- NH4+

OH

CH3C O

Amonium asetat

AquaOH

H H C CH3

Metanol

Asetonitril

OC

CH3OAsam asetat

Interaksi ionik

= Interaksi hidrogen

ONa C

O

CH3

Natrium asetat

�Gambar 22. Interaksi nikotin dengan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6).

Hasil validasi pada gambar (22) diperoleh kromatogram baku nikotin

dengan tR yaitu 2,017 menit dan hasil penetapan kadar diperoleh kromatogram

sampel dengan tR pada puncak I yang hampir sama dengan baku pada puncak I

yaitu 1,970 menit, dapat dipastikan adanya nikotin dalam sampel ekstrak daun

tembakau. Menurut Snyder, kondisi kromatografi seperti kecepatan alir,

temperatur, komposisi fase gerak dan tekanan yang stabil menghasilkan tR yang

stabil pula. Variasi waktu retensi yang diperbolehkan <0,02-0,05 menit.

�

a


��

�

��

�

b

Gambar 23. (a) kromatogram baku nikotin tR = 2,017 menit dan (b) kromatogram sampel ekstrak etanolik daun tembakau tR = 1,970 menit

Ketika analisis penetapan kadar nikotin pump pressure pada instrument

KCKT 115 kgf/cm2 berbeda dengan validasi metode 110 kgf/cm2, hal ini

disebabkan karena penggunaan kolom yang bergantian oleh 2 kelompok sehingga

pressure tidak stabil. Semakin besar tekanan semakin singkat waktu retensinya,

karena semakin kuat kemampuan fase gerak untuk mendorong analit (nikotin)

keluar dari kolom. Data yang diperoleh benar karena tR sampel lebih singkat

dibandingkan tR baku.

K. Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau VBN dan NO

Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dihitung

berdasarkan persamaan kurva baku yang diperoleh dari validasi. Presisi yang

dinyatakan dengan nilai koefisien variasi (CV) merupakan parameter dalam

mengukur suatu metode untuk mendapatkan hasil yang reprodusibel. Perhitungan

kadar nikotin dari kedua sampel pada tabel berikut :

Tabel IV. Perhitungan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau kedua sampel


��

�

��

�

Jenis ekstrak Replikasi Kadar %b/b

Keterangan

Na Oogst

1 0,001316 Rata-rata =1,316 x 10-3

SD = ± 2,775 x 10-6

CV = 0,2109%

2 0,001318 3 0,001311 4 0,001317 5 0,001317

Vorstenlanden

Bawah Naungan

1 0,002838 Rata-rata = 2,790 x 10-3

SD = ± 2,744 x 10-5

CV = 0,9835%

2 0,002776 3 0,002773 4 0,002790 5 0,002775

Data penetapan kadar diperoleh rata-rata kadar nikotin dalam ekstrak

etanolik daun tembakau Vorstenlenden Bawah Naungan 2,790 x 10-3 ± 2,744 x 10-

5 % b/b dengan nilai CV = 0,9835% dan Na Oogst adalah 1,316 x 10-3 ± 2,775x10-

6 % b/b dengan nilai CV = 0,2109 %. Kadar nikotin yang didapatkan dalam

penelitian ini merupakan kadar nikotin dalam 1 gram ekstrak yang digunakan,

dengan demikian kelemahan dalam penelitian ini adalah tidak dilakukan

penimbangan terhadap jumlah total ekstrak kental tembakau yang dihasilkan

dalam sekali ekstraksi sebelum dilakukan preparasi sampel sebanyak 1 gram.

Setelah diperoleh nilai CV dari kedua sampel, maka dilanjutkan uji

statistik yang bertujuan untuk mengetahui data yang diperoleh berbeda bermakna

atau tidak. Syarat dilakukan uji t tidak berpasangan adalah data yang didapatkan

merupakan data yang terdistribusi normal, oleh karena itu dilakukan uji

normalitas terlebih dahulu. Uji normalitas data yang digunakan adalah Shapiro-

Wilk dengan nilai kemaknaan (p) > 0,05. Shapiro-Wilk digunakan karena jumlah

sampel pada penelitian ini � 50 (Dahlan, 2009).


��

�

��

�

Pada tabel V dapat disimpulkan data kadar kedua ekstrak tembakau

terdistribusi normal karena pada tabel Sig. VBN memiliki nilai p = 0,454 dan NO

nilai p = 0,126.

Tabel V. Uji Normalitas Tests of Normality

jenis

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Kadar VBN .310 5 .130 .908 5 .454

NO .319 5 .106 .824 5 .126

a. Lilliefors Significance Correction

Tahap selanjutnya untuk mengetahui rata-rata kadar nikotin dalam

ekstrak etanolik daun tembakau jenis VBN dan NO berbeda bermakna atau tidak,

maka dilakukan uji uji t tidak berpasangan dengan taraf kepercayaan 95%.

Dari tabel VI diperoleh hasil bahwa varians data kedua jenis ekstrak

sama karena memiliki nilai p >0,05 yang ditunjukkan dengan Sig. 0,059. Untuk

mengetahui data kedua kelompok berbeda bermakna atau tidak, ditunjukkan

dengan kolom sig.(2-tailed) baris kedua (equal variences not assummed) jika p

<0,05 terdapat perbedaan bermakna.

Tabel VI. Uji t tidak berpasangan

��

� ��

��

��

��

� �

� �

��

��!��"��


��

�

��

�

� �

#� ��$%� ��

��$%�

&'�

��

�(�

� ��

"��

��%��

"�� ) �� * ��

+��

��

��

,%-..� %/�� 00�%�'1� -� %///� %//0,1,2//� %////0'..1� %//0,,20�0� %//0�/./,��

��

��

��

��

� �

00�%�'1� ,%/-'� %///� %//0,1,2//� %////0'..1� %//0,,/202� %//0�/-�-,�

Kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak etanolik daun tembakau

Vorstenlanden Bawah Naungan lebih besar daripada daun tembakau Na Oogst

hal ini disebabkan besarnya pengaruh cahaya.


adalah tanaman yang kebutuhan terhadap intensitas cahaya rendah. Proses

fotosintesis menghasilkan karbohidrat (CH2O)n sebagai produk fotosintesis yang

bertindak sebagai substrat respirasi. Jalur biosintesis nikotin diawali tahap

glikolisis D-glukosa selanjutnya siklus krebs. D-glukosa dan D-fruktosa adalah

hasil hidrolisis sukrosa dengan bentuan enzim invertase. Glikolisis adalah

perombakan glukosa menjadi asam piruvat, selanjutnya asam piruvat menjadi

asetil CoA sebagai substrat untuk daur Krebs. Salah satu hasil asetil CoA yang

berikatan dengan oksaloasetat adalah asam �-ketoglutarat, menghasilkan salah

satu senyawa pemula/prekusor asam amino yaitu L-arginin, menghantarkan ke

prekusor biosintesis pada nikotin yaitu L-ornithine.


��

�

��

�

Dari penjelasan di atas, reaksi yang terjadi dipengaruhi oleh adanya kerja

enzim yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi (katalis) dan lebih spesifik

sehingga reaksi yang terjadi dapat dikendalikan dengan terbentuknya senyawa

tertentu (Salisbury dan Ross, 1995). Salah satu faktor yang mempengaruhi

aktivitas enzim adalah cahaya yang berpengaruh terhadap suhu. Pada suhu yang

melebihi atau dibawah suhu normal enzim, kerja enzim tidak efektif sehingga

tidak tersedia cukup substrat yang memiliki energi untuk bereaksi.

Dapat disimpulkan bahwa fungsi naungan pada tanaman VBN adalah

mengurangi intensitas cahaya yang berpengaruh terhadap efektifitas kerja enzim

sehingga menghasilkan substrat yang lebih banyak sehingga nikotin yang

terbentuk lebih besar. Sehingga kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun

tembakau VBN lebih besar daripada daun tembakau NO.


�

�

��

�

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Dari hasil penelitian yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa rata-rata kadar

nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN = 2,790x10-3± 2,744x10-5

% b/b dan Na Oogst = 1,316x10-3± 2,775x10-6 % b/b.

2. Hasil analisis statistik kadar nikotin dalam ekstrak etanolik kedua daun

tembakau berbeda bermakna yaitu daun tembakau VBN lebih besar

dibandingkan daun tembakau NO.

B. Saran

1. Ditambahkan Standar Internal dalam preparasi sampel untuk penetapan kadar

nikotin sebagai faktor koreksi .

2. Perlu dilakukan penimbangan terhadap berat total jumlah ekstrak kental yang

dihasilkan dalam sekali ekstraksi sehingga kadar yang didapat setara berat

serbuk daun tembakau yang diekstraksi.


�

�

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2010, Biosynthesis of Alkaloid Derived From Ornithine, Lysine and Nicotine,http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map01064.html, diakses tanggal 27 Oktober 2011.

Anonim (a), 2011, Tanaman C3, www.litbang.deptan.go.id/unker/one/462, diakses

tanggal 23 Desember 2011. Anonim (b), 2011, Nicotine for Alzheimer’s, http://www.wchstv.com/newsroom/

healthy forlife/2450.shtml, diakses tanggal 7 September 2011. Anonim (c), 2011, Soxletat extractor, http://www.sst.ums.edu.mydatafileiw7zkh8 wepCp, diakses tanggal 7 Maret 2011. Cahyono, B., Drs., 1998, Tembakau Budidaya dan Analisis Usaha Tani, Kanisius,

Yogyakarta, pp. 9-10. Center for Drug Evaluation and Research, 1994, Reviewer Guidance Validation of

Chromatographic Methods, Food and Drug Admisnistration, Rockville, pp. 12.

Cordell, Geoffrey,A., 1981, Introduction to Alkaloids, John Willey&Sons., Inc.,

Canada, pp.85. Dahlan, M.S., 2009, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika,

Jakarta, pp.45-57, 53, 60-65. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1979, Farmakope Indonesia,

jilid III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.XXX, 9, 777.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1985, Cara Pembuatan

Simplisia, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.1-22. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1986, Sediaan Galenik,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia

jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 7, 1134. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 2000, Parameter Stander

Umum Ekstrak Tumbuhan Obat cetakan I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 1, 10-11.


�

�

�

�

Domino, E.F., 1999, Pharmacological Significance of Nicotine, in Gorrod, J.W.,

and Jacob, P., Analytical Determination of Nicotine and Their Compounds and Their Metabolites, Chapter 1, Elsevier, Italy, pp. 5, 14.

Ernesta, A., 2011, Optimasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase T

Terbalik Pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Gandjar, I. G. Dan Rohman, A., 2007, Kimia FarmasiAnalisis, PustakaPelajar,

Yogyakarta, pp. 230-234, 344-345, 381. Hanum, C., 2008, Teknik Budidaya Tanaman jilid 3, Teknik Budidaya Tembakau

bab X, Direktorat Jenderal Manajemen Pendidikan Dasar dan Menegah Departemen Pendidikan Nasional, Jakarta, pp.425, 431-435.

Harborne, J.B., 1987, Phitochemical methods, diterjemahkan oleh Padmawinata,

Kosasih dan Soediro, Iwang, hal. 19-21, Penerbit ITB, Bandung. Whagner, H.L., 2003, The Health Effects of Nicotine and Smoking, in Triggle,

D.J., Nicotine-Drugs the Straight Facts, Chapter 3, University Pofessor School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences State University of New York, Buffalo, pp. 45-48.

Kar, A., 2005, Pharmaceutical Drug Analysis, New Age Publications, India, pp.

454, 462. Kazakevich, Y., dan LoBrutto R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists,

John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 15, 192. . Landoni, J.H., 1991, Nicotine, http://www.inchem.org/documents/pims/chemical/ nicotine.htm#SectionTitle:32%20Chemical%20structure, diakses tanggal 18

Februari 2011. Mulja, M. danSuharman, 1995, Analisis Instrumental, UniversitasAirlangga,

Surabaya, pp. 26, 31, 259. PT. Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998, Tembakau Vorstenlanden, PT.

Pekebunan Nusantara XIX (Persero) Bidang Penelitian, Klaten. Raymond, W.R., Hale, R.W., 1991, United States Patents Process For Isolating

Plant Extract Fractions, Philip Morris Incorporated, New York, pp. 11-12.


��

�

��

�

Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry, Sixth edition,

Saunders College Publishing, USA, pp. 386. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC

MethodDevelopment, Second edition., Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 313, 507.

Syenina, A., 2011, Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase

Terbalik pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

The Merck Index, 1989, The Merk Index An Encyclopedia OF Chemicals, Drugs

and Biological, Eleventh edition, Merck & Co., Inc., USA, pp.6434. Tjitrosoepomo, Gembong, 1994, Taksonomi Tanaman Obat-Obatan, Universtitas

Gadjah Mada Press, Yogyakarta, pp. 341-342. Voight, 1994, Lehrbuch Der Pharmazeutischen Technologie, diterjemahkan oleh

Soewandhi, S.N., hal. 579-580, Universitas Gajah Mada Press.


��

�

LAMPIRAN


�

�

�

�

��0%� ��3��& 4 3(�5+��+��

�

�

�

�

�

�

�


��

�

��

�

��'%��+��$��5+��6��

�

7 %7�89�:*; 3; �; * �3; 383�<�&7�8��84 (�

:�"3; = �7�; �� 3; �

7�; �� 3; �9�3 �; �

>�%�7��+�; �%0� ��%?#@&/'1'(�.'''.2�9��1,00��A��5�$B+��C ��+�%��

Klaten, 29 Agustus 2011

No : KC – INSIP/11.262 Lampiran : -,-. Hal : Bahan Penelitian (Tembakau Jenis VBN dan NO) Kepada : Yth. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Di Yogyakarta

Menindaklanjuti hasil konsultasi Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang melalukan penelitian, dengan ini kami berikan bahan penelitian berupa krosok daun tembakau jenis VBN dan NO serta data pendukung lainnya. Demikian untuk dipergunakan sebagai bahan penelitian.

Penelitian Klaten,

( Erna Anastasia D.E.,SP )

Nopeg.00101480 Tindasan :

1. Sdr. Dina Christiana Dewi 2. Sdr. Amelia Ernesta 3. Sdr. Ayesa Syenina 4. Sdr. Helena Angelina 5. Sdr. Novi Chairio 6. Sdr. Citra Dewi Ariani


��

�

��

�

TEMBAKAU Vorstenlanden Bawah Naungan (VBN)

Tembakau VBN mulai penanaman Juni dan mulai panen Juli. Pemanenan

dilakukan 3 hari sekali 2 lembar daun, jumlah daun per pohon 22 lembar daun.

Panen dilakukan kira-kira 40 hari sampai daun tembakau habis.

Data Pengamatan Pertumbuhan Tanaman Tembakau VBN MT.TAHUN : 2010/2011

Nomor Pengamatan Contoh daun 1 1 Tinggi tanaman (cm) 170 2 Jumlah daun (lembar) 22 3 Besar batang (cm) 1,7 4 Panjang daun (cm) 60 5 Lebar daun (cm) 37 6 Indek daun (cm) 0,62 7 Luas daun (g/cm) 1,494,35 8 Panjang ruas (cm) 10 9 Tebal daun (cm) 0,2

Foto Daun Tembakau VBN

�

�

�

�

�


��

�

��

�

Tembakau Na Oogst (NO)

Tembakau NO mulai penanaman pertengahan September dan mulai panen akhir

Oktober. Pemanenan dilakukan 3 hari sekali 2 lembar daun, jumlah daun per

pohon 22 lembar daun. Panen dilakukan kira-kira 40 hari sampai daun tembakau

habis.

Data Pengamatan Pertumbuhan Tanaman Tembakau NO MT.TAHUN : 2010/2011

Nomor Pengamatan Contoh daun B 1 Tinggi tanaman (cm) 100 2 Jumlah daun (lembar) 22 3 Besar batang (cm) 1,8 4 Panjang daun (cm) 44 5 Lebar daun (cm) 28 6 Indek daun (cm) 0,64 8 Panjang ruas (cm) 6 9 Tebal daun (cm) 0,28

Foto daun Na Oogst

��

�

�

�


��

�

��

�

Lampiran 3. Perhitungan pergeseran pKa nikotin dan pH buffer

berdasarkan Kazakevich dan LoBrutto (2007)

Untuk senyawa basa dengan setiap penambahan pelarut senyawa organik

sebanyak 10% terjadi pergeseran Ph 0,2 unit ke bawah.

Cara-cara menghitung :

1. Menghitung ke bawah pergeseran pKa nikotin :

pKa nikotin = 8,5

pelarut organik dalam sistem 60% (metanol:asetonitril = 54:6), sehingga

0,2 x 6 = 1,2

8,5 – 1,2 = 7,3

2. Menghitung pH agar nikotin dalam bentuk ionik :

pH = -2 unit pKa nikotin

7,3 – 2 = 5,3

3. Pergeseran ke atas pH dari buffer dengan penambahan pelarut organik :

0,2 x 6 = 1,2

4. Menghitung pH maksimum buffer yang dibuat agar nikotin dalam bentuk

terion :

5,3 – 1,2 = 4,1. Sehingga pH buffer yang dibuat � 4,1

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�


��

�

��

�

Lampiran 4. Perhitungan Kepolaran Fase Gerak

Diketahui:

Asetonitril dengan log P = 0,17 ; indeks polaritas = 5,8

Metanol dengan log P = -0,027 ; indeks polaritas = 5,1

Aquabidest dengan indeks polaritas = 10,2

Fase gerak : Buffer asetat : metanol : asetonitril (40 : 54 : 6)

Indeks polaritas =

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�


�

�

�

�

Lampiran 5. Spektrum Nikotin

�

�

�

A = konsentrasi 0,005 ppm absorbansi 0,205, � maksimum 260 nm;

B = konsentrasi 0,007 ppm, absorbansi 0,333, , � maksimum 260 nm;

C = konsentrasi 0,009 ppm, absorbansi 0,374, � maksimum 260 nm

�

�

�

�

�

�


�

�

�

�

Lampiran 6. Hasil Perolehan AUC seri baku nikotin

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi (ppm)

AUC Konsentrasi (ppm)

AUC Konsentrasi (ppm)

AUC

0,01 312810 0,01 385360 0,01 293732 0,03 599259 0,03 753585 0,03 719507 0,05 1042346 0,05 1205207 0,05 1092432 0,07 1395814 0,07 1646918 0,07 1522805 0,09 1780515 0,09 2098121 0,09 1962964 A = 93157,55 B = 18659825 r = 0,9985 y = 18659825x + 93157,55

A = 138124,45 B = 21594275 r = 0,9993 y = 21594275x + 138124,45

A = 82847,5 B = 20708810 r = 0,9996 y = 20708810x + 82847,5

��

�

Grafik hubungan antara konsentrasi nikotin dengan AUC

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�


��

�

��

�

Lampiran 7. Penimbangan Serbuk Kering dan Ekstrak Kental Daun

Tembakau Untuk Optimasi Lama Waktu Ekstraksi

Penimbangan serbuk kering tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan

(Jam) 7 -A 7-B 8-A 8-B 9-A 9-B 10-A 10-B

Timbangan kasar

Beker kosong (g) 62,53 44,89 58,23 45,09 58,24 58,23 61,19 45,09

Beker + serbuk (g) 82,54 64,90 78,24 65,10 78,24 78,24 81,20 65,10

Timbangan analitik

Beker + serbuk (g) 82,5492 64,9028 78,2490 65,1108 78,2435 78,2437 81,2062 65,1025

Beker + sisa (g) 62,5488 44,9024 58,2488 45,1103 58,2439 58,2435 61,2059 45,1022

Berat serbuk (g) 20,0004 20,0004 20,0002 20,0005 19,9996 20,0002 20,0003 20,0003

Penimbangan ekstrak kental tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan

(Jam) 7 -A 7-B 8-A 8-B 9-A 9-B 10-A 10-B

Timbangan kasar

Beker kosong (g) 62,53 61,23 63,68 54,66 33,42 63,15 63,37 62,53

Beker + serbuk (g) 63,64 62,34 64,79 55,77 34,42 64,31 64,79 63,65

Timbangan analitik

Beker + serbuk (g) 63,6467 62,2326 64,7937 55,7743 33,4205 64,3116 64,7943 63,6555

Beker + sisa (g) 62,6466 62,2324 63,7933 54,7741 32,4203 63,3115 63,7942 62,6552

Berat serbuk (g) 1,0001 1,0002 1,0004 1,0002 1,0002 1,0001 1,0001 1,0003


��

�

��

�

Lampiran 8. Kromatogram hasil optimasi ekstraksi dengan soxhletasi selama

7,8,9 dan 10 jam (replikasi 2x)

a. Kromatogram waktu ekstraksi 7 jam A

b. Kromatogram waktu ekstraksi 7 jam B


�

�

�

�

c. Kromatogram waktu ekstraksi 8 jam A

d. Kromatogram waktu ekstraksi 8 jam B


��

�

��

�

e. Kromatogram ekstraksi 9 jam A

f. Kromatogram ekstraksi 9 jam B


��

�

��

�

g. Kromatogram waktu ekstraksi 10 jam A

h. Kromatogram waktu ekstraksi 10 jam B

Hasil pengukuran AUC sampel dengan variasi waktu ekstraksi sampel dengan soxhlet

Waktu (jam)

7 A 7 B 8 A 8 B 9 A 9 B 10 A 10 B

AUC 1072305 1135700 1228904 123771 916992 942139 659037 644588


��

�

��

�

Lampiran 9. Penimbangan Serbuk Kering dan Ekstrak Kental Daun

Tembakau VBN dan NO untuk Penetapan Kadar Jenis tembakau Berat awal Berat serbuk Diameter saringan

VBN 961 gram 871,79 gram 1 mm

NO 1817 gram 1686,84 gram 1 mm

1. Penimbangan serbuk kering tembakau VBN

Replikasi I II III IV V

Timbangan kasar

Beker kosong 58,23 g 45,09 g 44,89 g 49,12 g 44,89 g

Beker + serbuk 78,24 g 65,10 g 64,90 g 69,22 g 64,90 g

Timbangan analitik


Beker + sisa 58,2488 g 45,1103 g 44,9043 g 49,2255 g 44,9020 g

Berat serbuk 20,0002 g 20,0005 g 20,0004 g 20,0001 g 20,0007 g

Penimbangan ekstrak kental tembakau VBN


Timbangan kasar



Timbangan analitik


Beker + sisa 63,7933 g 54,7751 g 44,8949 g 62,4110 g 49,1940 g



��

�

��

�

2. Penimbangan serbuk kering daun tembakau Na Oogst


Timbangan kasar



Timbangan analitik


Beker + sisa 49,2052 g 54,6616 g 49,1982 g 49,1925 g 49,1962 g


Penimbangan ekstrak kental tembakau Na Oogst


Timbangan kasar



Timbangan analitik


Beker + sisa 61,1554 g 62,2900 g 44,8807 g 54,6455 g 45,1174 g



��

�

��

�

Lampiran 10. Kromatogram Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak

Etanolik Daun Tembakau VBN dan Na Oogst

a) Na Oogst Replikasi 1

b) Na Oogst Replikasi 2

c) Na Oogst Replikasi 3


��

�

��

�

d) Na Oogst Replikasi

e) Na Oogst Replikasi 5

f) VBN Replikasi 1

g) VBN Replikasi 2


��

�

��

�

h) VBN Replikasi 3

i) VBN Replikasi 4

j) VBN Replikasi 5


��

�

��

�

Lampiran 11. Perhitungan kadar nikotin

1. Contoh Perhitungan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau

Seluruh fase kloroform diuapkan dalam almari asam, kemudian dilarutkan dalam

5 mL pelarut. Diambil 100 µL dan diencerkan dalam labu ukur 10,0 mL dengan

pelarut hingga tanda.

A. Diperoleh AUC VBN 1 = 1258549, kemudian dimasukkan dalam persamaaan

kurva baku Y = 20708810x + 82847,5.

Y = 20708810x + 82847,5

1258549 = 20708810x + 82847,5

B. Untuk mengetahui nikotin dalam 5 mL, maka

Kadar dinyatakan dalam % b/b


��

�

��

�

2. Data Perhitungan Kadar

3. Tabel Kadar Nikotin

Jenis ekstrak Replikasi Kadar %b/b Keterangan

Na Oogst

1 0,001316 Rata-rata = 1,316 x 10-3

SD = ± 2,775 x 10-6

CV = 0,2109%

2 0,001318 3 0,001311 4 0,001317 5 0,001317

Vorstenlanden Bawah Naungan

1 0,002838 Rata-rata = 2,790 x 10-3

SD = ± 2,744 x 10-5

CV = 0,9835%

2 0,002776 3 0,002773 4 0,002790 5 0,002775

AUC kadar (ppm) (µg/ml) µg/g

(dalam5ml)

%b/b

(g/100 g)

VBN 1 1258549 0,056773 5,677301 5,677301 28,37516 0,002838

VBN 2 1232800 0,05553 5,552963 5,552963 27,75926 0,002776

VBN 3 1231498 0,055467 5,546676 5,546676 27,72506 0,002773

VBN 4 1238593 0,055809 5,580936 5,580936 27,89631 0,002790

VBN 5 1232771 0,055528 5,552823 5,552823 27,75024 0,002775

NO 1

627977

0,026324

2,632356

2,632356

13,15915

0,001316

NO 2 628873 0,026367 2,636682 2,636682 13,18077 0,001318

NO 3 626067 0,026231 2,623132 2,623132 13,11304 0,001311

NO 4 628265 0,026337 2,633746 2,633746 13,1661 0,001317

NO 5 628560 0,026352 2,635171 2,635171 13,17322 0,001317


� �

�

� �

�

Lampiran 12. Data Uji Statistik

1. Uji Normalitas

Tests of Normality

jenis

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

kadar VBN .310 5 .130 .908 5 .454

NO .319 5 .106 .824 5 .126

a. Lilliefors Significance Correction

Uji normalitas data yang digunakan adalah Shapiro-Wilk dengan nilai

kemaknaan (p) > 0,05, kadar kedua ekstrak tembakau terdistribusi normal karena

pada tabel Sig. VBN memiliki nilai p = 0,454 dan NO nilai p = 0,126.


��

�

��

�

2. Uji t tidak berpasangan

Independent Samples Test

Levene's

Test for

Equality of

Variances t-test for Equality of Means

95% Confidence Interval of

the Difference

F Sig. t df

Sig. (2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error

Difference Lower Upper

kadar Equal variances

assumed

4.833 .059 119.527 8 .000 .001474600 .000012337 .001446151 .001503049

Equal variances

not assumed

119.527 4.082 .000 .001474600 .000012337 .001440616 .001508584

Varians data kedua jenis ekstrak sama karena memiliki nilai p >0,05

yang ditunjukkan dengan Sig. 0,059. Data kedua kelompok berbeda bermakna

ditunjukkan dengan kolom sig.(2-tailed) baris kedua (equal variences not

assummed) jika p <0,05 terdapat perbedaan bermakna.


��

�

��

�

Lampiran 13. Kromatogram Blanko Pelarut

Buffer Asetat:aMetanol:Asetonitril (40:54:6)

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�


��

�

��

�

�

�


��

�


��

�

�

BIOGRAFI PENULIS

SD Maria Asumpta Klaten (1996-2002), SLTP Pangudi Luhur 1 Klaten (2002-2005), SMA Negeri 1 Klaten (2005-2008) dan pada tahun 2008 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dhrma Yogyakarta. Selama kuliah penulis mengikuti kegiatan dan organisasi antara lain : panitia pelantikan apoteker angkatan XIX dan XX, pengabdian masyarakat bersama dosen tentang Hipertensi dan Diabetes Melitus, sebagai committe dalam program pertukaran pelajar 2010 dan asisten dosen mata kuliah praktikum Kromatografi (2011).

Penulis skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau Jenis VBN dan NO Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” memiliki nama lengkap Dina Christiana Dewi. Penulis lahir di Klaten pada tanggal 29 Desember 1989 sebagai putri kedua pasangan Agus Yunanto dan Sri Mulyani. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Indriayasana, TK Maria Asumpta Klaten (1995-1996), SD Maria Asumpta Klaten (1996-2002),

�

�


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · dukungan dan keceriaan selama perkuliahan...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · dukungan dan keceriaan selama perkuliahan...