PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PDF/F. Farmasi/Farmasi/098114127_full.pdftidak memuat karya...
Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PDF/F. Farmasi/Farmasi/098114127_full.pdftidak memuat karya...
i
VALIDASI METODE DAN PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK TEMBAKAU ROKOK “MEREK X” DENGAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK MENGGUNAKAN STANDAR INTERNAL ASETANILIDA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Is Sumitro
NIM : 098114127
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGJAKARTA
2013
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Hidup seorang laki-laki jangan takut akan segala hal sebab ketakutan hanya akan
menghambat jalanmu, namun juga selalu berpegang pada prinsip yang benar karena
hidup hanyalah hidup jika bermanfaat bagi orang lain”
“Kebaikan belum tentu akan dimengerti orang lain, maka jangan menuntut orang juga
akan mengerti kebaikanmu namun selalulah berbuat baik dan bekerja keras sebab doa
orang tua dan Tuhan selalu menyertaimu”
(Mintju dan Effendi)
Kupersembahkan karyaku ini untuk kedua orang tuaku Mintju dan Effendi, Sahabatku, dan
Almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya susun ini
tidak memuat karya atau bagian dari pekerjaan orang lain, kecuali yang telah
disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya sebuah karya
ilmiah.
Apabila dikemudian hari ditemukan adanya indikasi plagiarisme dalam
naskah yang saya susun ini, maka saya bersedia menanggung segala resiko dan sanksi
sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 10 Juli 2013
Penulis,
Is Sumitro
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangah di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Is Sumitro
Nomor Mahasiswa : 098114127
Demi pengembangan ilmu penegtahuan, saya memberikan kepada perpustakaan
Sanata Dharma karya ilmiah yang berjudul:
“VALIDASI METODE DAN PENETAPAN KADAR EKSTRAK TEMBAKAN DALAM ROKOK “MEREK X” DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK MENGGUNAKAN
STANDAR INTERNAL ASETANILIDA”
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikannya secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Dengan demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 10 Juli 2013 Yang menyatakan
(Is Sumitro)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas cinta kasih, berkat, ijin
dan peryertaan-Nya yang begitu besar, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “Penetapan Kadar Nikotin Dalam Rokok “MEREK X” Dengan Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik Menggunakan Standar
Internal Asetanilida” sebagai salah satu syarat yang harus dipenuhi demi memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan skripsi ini dapat
terselesaikan karena adanya masukan, kritikan, diskusi, arahan, saran, dan bimbingan
dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-
besarnya kepada :
1. Ipang Djurnarko, M.Sc., Apt. Selaku Dekan Fakultas Farmasi Uninversitas Sanata
Dharma Yogyakarta atas teladan seorang pemimpin yang diberikan
2. Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. selaku dosen pembimbing, dosen penguji,
dan pengganti orang tua saya yang telah meluangkan waktunya untuk
memberikan perhatian, bimbingan, masukan, motivasi, kritikan, dan saran selama
penulis berkuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan selama
penelitian serta penyusunan skripsi ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
3. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang memberikan banyak kritik dan
saran yang membangun untuk skripsi ini.
4. Lucia Wiwid Wijayanti, M,Si. selaku dosen penguji yang memberikan banyak
kritik dan saran yang membangun untuk skripsi ini.
5. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing di laboratorium dan
teman selama penelitian skripsi yang telah memberikan masukan, diskusi, saran,
dan dukungan moral kepada penulis selama penelitian skripsi ini.
6. C.M.Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt. sebagai Kaprodi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas teladan kepemimpinan, masukan,
dan saran yang diberikan selama penulis berkuliah dan menyusun naskah.
7. Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. sebagai Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
8. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. atas waktu yang diluangkan untuk
memberikan sedikit masukan diawal penelitian
9. Bimo Adithya, Suparlan, dan Kunto dan segenap staf laboran yang senantiasa
siap membantu dan meluangkan waktunya dalam penyediaan bahan dan alat
selama penelitian.
10. Semua dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas
pengalaman, masukan, keceriaan, semangat, dan persahabatan yang diberikan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
11. Demas dan Eric sebagai rekan kerja dalam penelitian skripsi ini. Terima kasih
atas kesabaran, kepercayaan, kerjasama, persahabatan, canda dan semangat
selama ini.
12. Lucia Shinta R, Sisilia Mirsya A, Metri S.K., Agnes Mutiara, Victor Purnama
Agung, dan Novia Sarwoningtyas sebagai teman seperjuangan dalam satu lantai
Laboratorium Analisis Instrumental.
13. Teman angkatan 2009 yang bersama-sama berjuang dan mengisi sebagian cerita
hidupku, terima kasih atas kebersamaan, diskusi, dan bantuan selama perkuliahan.
14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, atas segala bantuan,
semangat dan doa yang menyertai penulis dari awalnya penelitian hingga
diselesaikannya penulisan skripsi ini.
Penulis merasakan dan menyadari atas kekurangan dalam penyusunan
skripsi ini, karena keterbatasan wawasan dan kemampuan. Penulis dengan senang
hati membuka diri menerima kritik dan saran yang membangun dari semua pihak,
dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan skripsi ini memberikan
manfaat yang berarti bagi para pembaca. Akhir kata, penulis mempersembahkan
skripsi ini demi majunya ilmu pengetahuan farmasi.
Yogyakarta, 10 Juli 2013
Penulis
Is Sumitro
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL…………………………………………………………… i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………………………………. ii
HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………………. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………………….. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………………….. v
LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI…………………………………….. vi
PRAKATA…………………………………………………………………….. vii
DAFTAR ISI…………………………………………………………………... x
DAFTAR TABEL……………………………………………………………… xiv
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………………… xv
DAFTAR LAMPIRAN……….………………………………………………... xvii
INTISARI……………………………………………………………………… xix
ABSTRACT…………………………………………………………………..... xx
BAB I PENGANTAR………………………………………………………...... 1
A. Latar Belakang
1. Permasalahan.………………………………………………………. 4
2. Keaslian Penelitian……………………………………….……….… 5
3. Manfaat Penelitian………………………………………………….. 6
B. Tujuan Penelitian……………………………………………………….. 6
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA………………………………………….. 7
A. Rokok………………………………………………………….……….... 7
1. Pengertian Rokok…………………………………………………… 7
2. Bagian-bagian Rokok……………………………………………….. 8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
B. Tembakau……………………………………………………….……… 9
C. Nikotin……………………………………………………………….… 9
D. Standar Internal………………………………………………….…....... 10
E. Ekstraksi…………………………………………………………...….... 11
1. Ekstraksi………...………………………………………………..... 11
2. Cairan Penyari……………………………………………………... 12
3. Ekstraksi Padat-Cair…………..…………………………………… 12
4. Ekstraksi Cair-Cair……………………………………………….... 13
F. Spektrofotometri UV…………………………………………………... 13
G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)……………………………. 16
1. Definisi dan Instrumentasi……………………………….………… 17
2. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif ……………………….………... 19
H. Validasi Metode Analisis…………………………………..………….. 19
1. Akurasi………………………………………………….………….. 20
2. Presisi………………………………………………………………. 21
3. Selektivitas atau Spesifisitas………………………………………. 22
4. Linearitas………………………………………………………….. 23
5. Rentang……………………………………………………………. 23
I. Landasan Teori…………………………………………………………. 24
J. Hipotesis………………………………………………………………... 25
BAB III METODOLOGI PENELITIAN……………………………………... 26
A. Jenis dan Rancangan Penelitian………………………………………… 26
B. Variabel Penelitian……………………………………………………… 26
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
1. Variabel Bebas……………………………………………….…….. 26
2. Variabel Tergantung……………………………………….….……. 26
3. Variabel Pengacau Terkendali……………………………..……….. 26
C. Definisi Operasional………………………………….…………….…… 27
D. Bahan Penelitian……………………………………….…………….….. 27
E. Alat Penelitian…………………………………….…………………….. 27
F. Tata Cara Penelitian………………………………….…………………. 28
1. Pembuatan Fase Gerak…………………………….…………..……. 28
2. Pembuatan Larutan Baku Standar Internal Asetanilida……………. 29
3. Pembuatan Larutan Baku Nikotin…………………………………... 29
4. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan……………………….. 30
5. Pembuatan Kurva Baku……………………………….……….……. 31
6. Penyiapan Sampel……………….……………………….…………. 31
7. Pembuatan Ekstrak Tembakau Rokok “MEREK X”…….…………. 32
8. Validasi Metode…………………………………………………….. 33
9. Penetapan Kadar Nikotin Dalam Sampel Rokok “MEREK X” ….… 35
G. Analisis Hasil……………………………………………………….…… 36
BAB IV PEMBAHASAN…………………………………………..……….. 38
A. Pembuatan Fase Gerak…………………………………….……..…… 38
B. Standar Internal Asetanilida……………………………………..……. 40
C. Pemilihan dan Pembuatan Sampel……………………………..……... 46
D. Pembuatan Larutan Baku……………………………………..………. 48
E. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum……………..…… 49
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
F. Pembuatan Kurva Baku Nikotin…………………………………….… 52
G. Ekstraksi Nikotin pada Sampel Rokok “Merek X”………………….... 53
H. Optimasi Ekstraski Nikotin pada Sampel Rokok …………..………… 57
I. Ekstraksi dengan Waktu Optimum 30 menit……………….……….... 60
J. Preparasi Sampel………………………………………………….….. 61
K. Validasi Metode Analsis……………………………..……….………. 61
L. Analisis Kualitatif Nikotin…………………………………………….. 67
M. Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanol Fraksi Kloroform Tembakau Sampel Rokok……………………………………………………...…… 69
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN…………………….………………… 71
DAFTAR PUSTAKA……………………………………….……………….... 72
LAMPIRAN…………………………………………………..……………….. 74
BIOGRAFI PENULIS………………………………………..………………... 94
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut yang digunakan dalam KCKT….. 17
Tabel II. Nilai recovery yang diperbolehkan untuk setiap kadar analit…… 21
Tabel III. Kriteria penerimaan presisi untuk setiap kadar analit…………… 22
Tabel IV. Hasil pengukuran AUC asetanilida dengan ekstraksi dan tanpa
ekstraksi…………………………………..……………………... 45
Tabel V. Jumlah nikotin pada kemasan rokok………………………….…. 47
Tabel VI. Hasil pengukuran AUC nikotin dengan 2 kali ekstraksi dan tanpa
ekstraksi……………………………………………….…...…… 57
Tabel VII. Uji Normalitas…………………………………...…….………. 59
Tabel VIII. Uji T tidak berpasangan………………………………………... 60
Tabel IX. Hasil pengukuran AUC nikotin dan standar asetanilida pada ekstrak
tembakau rokok “MEREK X”……………………………….... 61
Tabel X. Hasil perhitungan resolusi sampel………………………...….. 62
Tabel XI. Hasil persen perolehan kembali (%recovery) baku nikotin….. 64
Tabel XII. Hasil intraday precision………………………………………. 65
Tabel XIII. Hasil interday precision.............................................................. 66
Tabel XIV. Hasil Perhitungan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau rokok
“MEREK X”…………………………………………………... 70
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur kimia nikotin……………………………………… 10
Gambar 2. Diagram tingkat energi elektron…………………………... 14
Gambar 3. Pengaruh pelarut polar pada transisi π π*……………… 15
Gambar 4. Pengaruh pelarut polar pada transisi n π*……………… 15
Gambar 5. Instrumentasi KCKT……………………………………..... 16
Gambar 6. Interaksi TEA dengan gugus silanol pada fase diam (C8).... 39
Gambar 7. Kromatogram ekstrak tembakau rokok “MEREK X” dengan standar
internal asetanilida……………………………………….... 41
Gambar 8. Kromatogram sampel rokok dan asetanilida……………....... 43
Gambar 9. Kromatogram asetanilida hasil ekstraksi dan tanpa ekstraksi.. 44
Gambar 10. Spektra λ maksimum nikotin 3 konsentrasi............................. 49
Gambar 11. Spektra λ maksimum asetanilida 3 konsentrasi……………… 50
Gambar 12. Kromofor nikotin dan asetanilida……………………………. 52
Gambar 13. Grafik hubungan antara konsentrasi nikotin dan asetanilida dengan
AUC…………………………………………………………. 53
Gambar 14. Tingkat protonasi nikotin berdasarkan hubungan dengan pH… 55
Gambar 15. Kromatogram baku nikotin dengan ektraksi dan tanpa ekstraks. 57
Gambar 16. Kurva baku hubungan antara konsentrasi baku nikotin dengan
AUC…………………………………………………………. 63
Gambar 17. Kurvat rentang konsentrasi nikotin yang memenuhi criteria akurasi,
presisi, dan liniearitas……………………………………….. 67
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
Gambar 18. Struktur nikotin………………………………………………… 68
Gambar 19. Kromatogram sampel rokok “Merek X” dan baku nikotin……. 69
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Sertifikat analisis asetanilida……………………………… 75
Lampiran 2. Sertifikat analisis nikotin…………………………………. 76
Lampiran 3. Kromatogram optimasi waktu 10 menit replikasi 1……..... 77
Lampiran 4. Kromatogram optimasi waktu 10 menit replikasi 2………. 78
Lampiran 5. Kromatogram optimasi waktu 10 menit replikasi 3………. 79
Lampiran 6. Kromatogram optimasi waktu 20 menit replikasi 1………. 80
Lampiran 7 Kromatogram optimasi waktu 20 menit replikasi 2……….. 81
Lampiran 8. Kromatogram optimasi waktu 20 menit replikasi 3….….... 82
Lampiran 9. Kromatogram optimasi waktu 30 menit replikasi 1……..... 83
Lampiran 10. Kromatogram optimasi waktu 30 menit replikasi 2….….. 84
Lampiran 11. Kromatogram optimasi waktu 30 menit replikasi 3……... 85
Lampiran 12. Kromatogram optimasi waktu 40 menit replikasi 1……... 86
Lampiran 13. Kromatogram optimasi waktu 40 menit replikasi 2….….. 87
Lampiran 14. Kromatogram optimasi waktu 40 menit replikasi 3….….. 88
Lampiran 15. Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 1……… 89
Lampiran 16. Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 2…….... 90
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
Lampiran 17. Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 3…….. 91
Lampiran 18. Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 4…….. 92
Lampiran 19. Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 5…….. 93
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xix
VALIDASI METODE DAN PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK TEMBAKAU
ROKOK “MEREK X” DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
MENGGUNAKAN STANDAR INTERNAL ASETANILIDA
Is Sumitro
098114127
INTISARI
Telah dilakukan penelitian tentang validasi metode dan penetapan kadar nikotin
dalam ekstrak tembakau rokok “Merek X” dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) fase terbalik menggunakan standar internal asetanilida. Penelitian ini bertujuan
untuk mengetahui validitas metode dan kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak
tembakau rokok “MEREK X”.
Penelitian ini mengikuti jenis dan rancangan penelitian non eksperimental
deskriptif. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) menggunakan kolom fase diam oktil
silika (C8), fase gerak metanol : ammonium asetat + TEA 0,1% (70 : 30), kecepatan alir 1
mL/menit, dan detector UV pada panjang gelombang 260 nm. Pada validasi KCKT fase
terbalik memenuhi parameter selektivitas (Rs = 2,929), linearitas (r = 0,999893), akurasi dan
presisi pada rentang kadar sampel 40-60 µg/mL.
Hasil penelitian menunjukan kadar rata-rata nikotin dalam ekstrak tembakau
rokok “Merek X” adalah 0.57385 ± 0.007224 %b/b dengan nilai CV = 1,2588%. Nilai CV yang
diperoleh memenuhi syarat presisi yang baik yaitu <2%.
Kata kunci : nikotin, ekstrak tembakau rokok “Merek X”, KCKT fase terbalik,
asetanilida, penetapan kadar, validasi metode.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xx
ABSTRACT
A study concerned the determination amount of nicotine in cigarettes “BRAND X” by reversed phase high performance liquid chromatography with standar internal acetanilide. This study aims to determine amount nicotine in tobacco extract cigarettes “BRAND X”.
This research is conducted with a descriptive non-experimental plan and design. The HPLC system used for quantitative analysis of nicotine consists of octyl silica (C8) as the stationary phase, mixture of methanol : ammonium acetate + TEA 0,1% (70:30) as mobile phase, and UV detector with λ max of 260 nm. The parameters of method validation used in this research are selectivity (Rs = 2,929), liniearity (r = 0,999), resulted good accuracy and precision (intraday and interday) in range concentrations 40- 60 µg/mL.
The results of this research of average levels of nicotine contained in tobacco extract cigarettes “BRAND X” is 0.57385 ± 0.007224 %w/w with value of CV = 1,2588%. Values of CV obtained qualified good precision is < 2%.
Keywords: nicotine, tobacco extract cigarettes “BRAND X”, reversed phase HPLC, acetanilide, quantitative, method validation.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Rokok merupakan produk yang banyak dikonsumsi masyarakat luas, data
WHO (World Health Organization) mencatat bahwa perokok aktif di Indonesia
mencapai jumlah 62,8 juta orang pada tahun 2011 (WHO, 2011). Kandungan
senyawa kimia dalam rokok yang menyebabkan ketergantungan adalah nikotin.
Nikotin memiliki Lethal Dose sebesar 40 sampai 60 mg (0,5-1,0 mg/kg) pada
manusia dewasa dan kosentrasi nikotin dalam darah lebih besar dari 5 mg/L akan
menyebabkan kematian (Clarke, 2003).
Masyarakat umum yang menjadi konsumen rokok biasanya mengetahui
kandungan nikotin dalam tiap bungkus rokok dengan melihat informasi yang
terdapat pada bungkusan rokok, dengan informasi kandungan nikotin dalam tiap
bungkus rokok ini dapat menjadi dasar patokan berapa banyak nikotin yang
terserap dalam tubuh saat merokok. Namun informasi dalam bungkus rokok
tentang kadar nikotin masih perlu diteliti kembali tentang kebenaran informasinya
yang diperlukan untuk penjaminan mutu produk rokok dari kadar nikotinnya.
Pencantuman kadar nikotin dalam rokok sesuai dengan peraturan
pemerintah no 109 tahun 2012 dimana terdapat pada pasal 10 disebutkan “setiap
orang yang memproduksi produk tembakau berupa Rokok harus melakukan
pengujian kandungan kadar nikotin dan tar perbatang untuk varian yang
diproduksi” dan pada pasal 19 “ Setiap orang yang memproduksi dan /atau
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
mengimpor produk tembakau berupa rokok wajib mencantumkan informasi
kandungan kadar nikotin dan tar sesuai hasil pengujian sebagaimana dimaksud”
(Peraturan Pemerintah RI, 2012).
Dengan melakukan pengujian kadar nikotin dalam tiap batang rokok,
secara tidak lansung dapat membantu pemerintah dalam memastikan kadar
nikotin dalam rokok. Selain dari penjaminan mutu kadar nikotin dalam rokok,
konsumen rokok juga perlu untuk dipenuhi hak konsumennya terkait kebenaran
informasi nikotin dalam rokok.
Hak konsumen ini tercantum pada Undang-Undang Republik Indonesia
nomor 8 tahun 1999, dimana pasal 4 yang berbunyi “Hak konsumen adalah hak
atas informasi yang benar, jelas dan jujur mengenai kondisi dan jaminan barang
dan/atau jasa” ( Undang-Undang RI, 1999).
Rokok “Merek X” yang akan dianalisis dipilih berdasarkan kadar nikotin
yang tinggi dibanding rokok sejenis dan juga dari jumlah konsumen yang banyak.
Kadar nikotin yang tercantum pada label kemasan yang tinggi ini diharapkan
dapat mudah untuk mendapatkan hasil ekstraksi dan pengukuran yang baik terkait
kadar nikotin dalam rokok.
Rokok yang akan dianalisis kadar nikotinnya, nantinya akan diekstraksi
dan didapatkan ekstrak kental rokok. Untuk meningkatkan kadar nikotin dalam
ekstrak kental rokok tersebut maka dipilih metode ekstraksi yang dapat
menghasilkan ekstrak dengan kandungan nikotin yang maksimal. Metode yang
digunakan adalah campuran metode ekstraksi padat-cair dan metode ekstraksi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
cair-cair. Dimana tahap pertama metode ekstraksi padat-cair dapat berfungsi
untuk mengekstraksi senyawa nikotin dengan maksimal yang menjadi acuan
adalah metode ektraksi dari jurnal “Determination of Nicotine From Tobacco by
LC-MS-MS” ( Vlase, Filip, Mindrutau dan Leucuta, 2005). Tahap selanjutnya
dilakukan metode ekstraksi cair-cair untuk melakukan clean up terhadap senyawa
ekstrak yang telah dihasilkan, sehingga diharapkan hasil kadar nikotin lebih
maksimal dan terpisah dari zat pengotornya yang menjadi acuan adalah metode
ekstraksi cair-cair dari penelitian “Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak
Etanolik Daun Tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan NA OOGST Secara
KCKT Fase Terbalik” (Dewi, 2012). Cairan penyari yang digunakan adalah etanol
karena dari sifat nikotin yang dapat larut dalam etanol.
Standar internal digunakan untuk mencegah kesalahan dalam pengukuran
karena proses metode yang cukup panjang dengan sampel uji yang cukup kecil
kosentrasinya (Basset,1994). Proses ektraksi pada penetapan kadar nikotin dalam
rokok “MEREK X” cukup panjang karena adanya proses clean up ekstrak yang
berulang-ulang sehingga mencegah hilangnya senyawa nikotin yang banyak
digunakan satandar internal. Pemilihan asetanilida sebagai standar internal
mengacu pada jurnal “Improved highly sensitive method for determination of
nicotine and cotinine in human plasma by high performance liquid
chromatography” ( Nakajima, Yamamoto, Kuroiwa, dan Yokoi, 2000).
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dipilih untuk
menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau pada rokok “MEREK X”,
karena metode ini selektif dalam memisahkan senyawa multi-komponen dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
hasil pemisahan yang baik, dan waktu relatif singkat. Detektor yang digunakan
adalah UV, karena nikotin memiliki struktur kromofor dan memiliki serapan
maksimum pada panjang gelombang tertentu (Cordell, 1981).
Penelitian ini merupakan tahap lanjutan dari serangkaian penelitian kadar
nikotin ekstrak tembakau dalam rokok “MEREK X” yang meliputi tahap
optimasi, validasi metode, dan penetapan kadar nikotin dalam sampel rokok
“Merek X”. Pada penelitian tentang optimasi metode KCKT fase terbalik
didapatkan metode KCKT yang optimal dengan menggunakan kolom fase diam
OktilSilika (C8) dan fase gerak Metanol : Ammonium asetat 10mM + TEA 0,1%
(70 : 30), kecepatan alir 1 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang 262
nm (Antonius, 2013). Metode analisis yang digunakan perlu divalidasi terlebih
dahulu agar hasil analisis yang dilakukan nantinya dapat dipercaya dan dapat
diterima. Parameter-paramater validasi yang digunakan, yaitu selektivitas,
linearitas, akurasi, presisi, dan rentang. Tahap akhir dilakukan penetapan kadar
nikotin dalam ekstrak tembakau rokok “MEREK X”.
1. Permasalahan
Permasalahan yang dapat dirumuskan berdasarkan latar belakang tersebut
antara lain:
a. Apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik yang
menggunakan fase diam oktil silika (C8) dan fase gerak metanol : ammonium
asetat 10 mM + TEA 0,1% (70:30) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
penetapan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau rokok “MEREK X” memenuhi
parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan
rentang ?
b. Berapakah kadar nikotin dalam ekstrak tembakau rokok “MEREK X”?
2. Keaslian Penelitian
Berdasarkan penelusuran literatur yang telah dilakukan, penetapan kadar
nikotin yang pernah dilakukan adalah penetapan kadar nikotin dalam sampel
biologis menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), kromatografi
gas, spektrofotometri massa, dan kromatografi cair MS (LC-MS) (Nakajima,
Yamamoto, Kuroiwa, Yokoi, 2000); penetapan kadar nikotin dalam macam-
macam merek rokok (Alali dan Massadeh, 2003); penetapan kadar nikotin dalam
tembakau dengan metode LC-MS-MS (Vlase, Filip, Mindrutau, dan Leucuta,
2005); validasi metode KCKT fase terbalik pada penetapan kadar nikotin dalam
ekstrak etanolik daun tembakau (Syenina, 2011); penetapan kadar nikotin dalam
ekstrak etanolik daun tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan NA OOGST
secara KCKT Fase Terbalik (Dewi, 2012); optimasi komposisi dan kecepatan alir
fase gerak sistem KCKT fase terbalik pada penetapan kadar nikotin dalam rokok
“Merek X” menggunakan standar internal asetanilida (Antonius, 2013).
Validasi metode dan penetapan kadar nikotin ekstrak etanol pada rokok
“Merek X” dengan standar internal asetanilida metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) fase terbalik dengan menggunakan fase diam OktilSilika (C8) dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
fase gerak Metanol : Ammonium asetat 10mM+ TEA 0,1% (70:30) belum pernah
dilakukan.
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Metodologis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi
alternatif metode dalam penentuan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau rokok
“MEREK X” yaitu menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) fase terbalik dengan standar internal asetanilida.
b. Manfaat Praktis. Hasil penelitian ini dapat menambah informasi
tentang parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan
rentang serta kadar nikotin dalam ekstrak tembakau rokok “MEREK X” dengan
metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik menggunakan
standar internal asetanilida.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk mengetahui :
a. Validitas metode KCKT fase terbalik yang menggunakan fase diam
oktil silika (C8) dan fase gerak metanol:ammonium asetat 10 mM + TEA 0,1%
(70:30) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit pada penetapan kadar nikotin dalam
ekstrak tembakau rokok “MEREK X” dengan melihat parameter validasi yaitu
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang.
b. Kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak tembakau rokok “Merek
X”
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Rokok
1. Pengertian Rokok
Rokok merupakan suatu produk yang dibungkus oleh kertas berbentuk
seperti silinder dengan panjang mendekati 90 mm, ketika dibakar dan dihisap asap
dari tembakau atau rokok tersebut maka mulailah terjadinya absorpsi dari nikotin
menuju tubuh (Stratton,2001). Terdapat sekitar empat ribu macam zat kimia
dalam rokok yang terdiri dari komponen gas (85%) dan sisanya merupakan
partikel. Diantara ribuan zat kimia tersebut setidaknya dua ratus senyawa
dinyatakan berbahaya bagi kesehatan.Beberapa zat kimia darisekitar empat ribu
zat tersebut ialah nikotin, gas karbon monoksida, nitrogen oksida, nitrogen
sianida, amoniak, benzaldehid, benzen, dan metanol. Racun utama pada rokok
adalah tar, nikotin, dan karbon monoksida (Ma’arif, 2012).
Ada dua jenis rokok yaitu rokok yang berfilter dan tidak berfilter. Filter
pada rokok terbuat dari bahan busa serabut sintesis yang berfungsi menyaring
nikotin. Rokok biasanya dijual dalam bungkusan berbentuk kotak atau kemasan
kertas yang dapat dimasukkan dengan mudah kedalam kantong. Sejak beberapa
tahun terakhir, bungkusan-bungkusan tersebut juga umumnya disertai pesan
kesehatan yang memperingatkan perokok akan bahaya kesehatan yang dapat
ditimbulkan dari merokok, misalnya akan ke penyakit paru-paru atau serangan
jantung(Geiss dan Kotzias, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
2. Bagian-Bagian Rokok
a. Cigarette paper
Kertas rokok (Cigarette paper) terbuat dari bahan kertas selulosa hasil
dari pengolahan serat kain contoh flax atau hemp, atau dari serat kayu. Kertas
rokok ini mampu untuk dilewati udara sehingga dapat memudahkan untuk proses
pembakaran tembakau (Geiss dan Kotzias, 2007).
b. Filter
Filter atau penyaring, umumnya terdapat pada kebanyakan rokok apalagi
pada rokok berfilter. Bagian rokok filter ini terbuat dari asetat selulosa atau tow.
Bagian filter ini mempunyai fungsi sebagai penjebak nikotin dan tar ketika asap
rokok dihisap melewati bagian filter. Fungsi kerja dari filter ini bergantung pada
bagian ventilasi filter dimana diatur oleh tipping paper, selanjutnya bagian ini
akan mengatur kemampuan udara melewati bagian filter juga bersamaan akan
menangkap senyawa nikotin, tar serta senyawa lain (Geiss dan Kotzias, 2007).
B. Tembakau
Tanaman tembakau (Nicotina tabaccum L.) termasuk dalam family
terong-terongan (Solanaceae) (Cahyono,1998).
a. Akar, tanaman tembakau merupakan tanaman berakar tunggang yang
tumbuh tegak ke pusat bumi. Akar tunggangnya dapat menembus tanah
kedalaman 50-75 cm, akar serabutnya dapat menyebar kesamping dan memiliki
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
bulu-bulu akar. Perakaran akan berkembang baik jika tanahnya gembur, mudah
menyerap air.
b.Batang, tanaman tembakau memiliki bentuk batang agak bulat, agak
lunak tetapi kuat, semakin keujung semakin kecil.Ruas-ruas batang mengalami
penebalan yang ditumbuhi daun.
c.Daun, tanaman tembakau memiliki tulang daun menyirip, bagian tepi
daun agak bergelombang dan licin. Lapisan atas daun terdiri atas lapisan palisade
parenkim dan spongy parenkim pada bagian bawah. Jumlah daun dalam satu
tanaman 28-32 helai (Hanum, 2008).
C. Nikotin
Nikotin merupakan golongan alkaloid yang diperoleh dari daun tanaman
temabakau (Nicotina tabacum L.).Senyawa ini tidak berwarna, mudah menguap,
sangat higroskopis, jika teroksidasi oleh udara atau cahaya akan berubah menjadi
warna coklat. Senyawa ini larut dalam etanol, eter , kloroform serta memiliki titik
didih sekitar 247oC, dengan indeks refraktif sebesar 1,5280. Nikotin dapat
diesktraksi dengan pelarut organic yang bersifat alkalis (Clarke, 2003).
Nikotin mengandung dua jenis gugus amin tersier yang bersifat basa
dengan pKa cincin piridin adalah 3,04 sedangkan pKa pada cincin pirolidin adalah
7,84. Nilai pKa pada cincin aromatik lebih rendah dikarenakan efek hibridisasi sp2
(Gorrod dan Jacob, 1999).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Hibridisasi sp2 digunakan bila suatu atom karbon membentuk ikatan
rangkap, ikatan rangkap menggambarkan satu ikatan sigma yang kuat dan satu
ikatan pi yang lemah. Ikatan pi akan membuat elektron lebih mudah bergerak
antar ikatan melalui ikatan ini dan juga membuat suatu molekul mempunyai
bentuk yang kaku (Fessenden dan Fessenden, 1986).
Gambar 1. Struktur kimia nikotin (Clarke, 1969 ).
D. Standar Internal
Standar internal merupakan suatu senyawa yang ditambahkan pada suatu
prosedur kerja analisis dalam penetapan kadar secara spektroskopi dan
kromatografi. Senyawa yang dilibatkan berupa sejumlah bahan
pembanding(standar internal) kepada senyawa yang akan diukur dengan
konsentrasi yang diketahui. Fungsi dari standar internal ini adalah untuk
mencegah kesalahan dalam pengukuran karena proses metode yang cukup
panjang dengan sampel uji yang cukup kecil konsentrasinya ( Basset, 1994 ).
Syarat-syarat yang diperlukan senyawa untuk menjadi standar internal
pada metode kromatografi cair kinerja tinggi ( KCKT ) adalah senyawa tersebut
harus dapat terelusi dari komponen lain yang terdapat pada ekstrak campuran
sampel dan dapat dibaca hasil kromatogramnya, serta tidak ada kandungan
senyawanya dalam sampel. Senyawa standar internal yang terelusi peak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
kromatogramnya harus mendekati senyawa yang ingin dianalisis untuk
meminimalisir efek instrumental drift.Senyawa harus stabil secara kimia dan
fisika terhadap metode yang digunakan.Akurasi dan presisi yang baik didapatkan
dari peak kromatogram senyawa standar internal yang mendekati peak senyawa
analit.Senyawa standar internal harus dapat secara keseluruhan terpisah dari
senyawa analit saat dipisahkan secara kromatografi. Senyawa standar internal
harus memiliki kemiripan sifat kimia dan fisika dengan analit yang akan dianalisis
( Boyd, 2008 ).
E. Ekstraksi
1. Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat
aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang
sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau
serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi syarat yang telah
ditetapkan ( Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,1995 ).
Ekstrak tumbuhan merupakan material yang diperoleh dengan cara
menyari sampel tumbuhan dengan pelarut tertentu. Terdapat beberapa jenis
ekstrak yaitu : ekstrak cair, ekstrak kental, dan ekstrak kering (Direktorat Jendral
Pengawasan Obat dan Makanan,2000).
Ekstrak diperoleh dengan cara ekstraksi. Ekstraksi adalah kegiatan
penarikan zat aktif yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat
larut dengan suatu pelarut cair. Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
dapat dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung
simplisia. Ekstraksi dipengaruhi oleh derajat kehalusan serbuk dan perbedaan
konsentrasi. Jika hanya dengan mencelupkan serbuk simplisia kedalam pelarut,
maka ekstraksi tidak akan sempurna karena terjadi kesetimbangan antara larutan
zat aktif di luar sel dan larutan zat aktif di dalam sel (Direktorat Jendral
Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).
2. Cairan Penyari
Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor.
Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut : murah dan mudah
diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, bereaksi netral, dan tidak mudah
terbakar, selektif yaitu mudah menarik zat berkhasiat yang dikehendaki, tidak
mempengaruhi zat yang berkhasiat dan diperbolehkan oleh peraturan.
Etanol dipertimbangkan sebagai penyari karena lebih selektif, kapang
dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20%, tidak beracun, netral, absorpsinya
baik dan suhu yang digunakan untuk pemekatan lebih rendah. Etanol dapat
melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin (Direktorat
Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).
3. Ekstraksi padat-cair
Untuk ekstraksi padat-cair ini, prosedur yang paling sering dijumpai
adalah ekstraksi senyawa dari bentuk sediaan padat. Prosedur ini merupakan
prosedur yang sederhana karena melibatkan pemilihan pelarut atau gabungan
pelarut yang secara ideal akan melarutkan secara sempurna senyawa yang akan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
dianalisis dan hanya sedikit melarutkan senyawa lain yang akan mengganggu
analisis lebih lanjut, misalkan akan mengganggu pemisahan pada kromatografi.
Kebanyakan prosedur ini dilakukan dengan terlebih dahulu menggerus
matriks padat hingga diperoleh serbuk yang halus lalu dilanjutkan dengan
ekstraksi pelarut, penyaringan, atau sentrifugasi untuk menghilangkan partikulat
(Moldoveanu dan David, 2002).
4. Ekstraksi cair-cair ( liquid-liquid extraction, LLE)
Ekstraksicair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel
atau clean-up sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen
matriks yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Di
samping itu, ekstraksi pelarut juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada
dalam sampel dengan jumlah kecil sehingga tidak memungkinkan atau
menyulitkan untuk deteksi atau kuantifikasinya
Analit-analit yang mudah terekstraksi dalampelarut organik adalah
molekul-molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang
bersifat nonpolar atau agak polar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar dan juga
senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air
(Moldoveanu dan David, 2002).
F. Spektrofotometri UV
Spektrofotometri UV adalah teknik analisis spektroskopik yang
menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet (λ < 400 nm) dengan
memakai instrumen spektrfotometer (Mulja dan Suharman, 1995).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Jika suatu molekul dikenakan radiasi elektromagnetik (REM) maka
molekul akan menyerap REM yang energinya sesuai. Interaksi antara molekul
dengan REM akan meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan
tereksitasi. Transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat energi dalam suatu
molekul yaitu transisi σ σ*, n π* dan π π*
Gambar 2. Diagram tingkat energi elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007).
1.Transisi σ σ*
Energi yang diperlukan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan energy
sinar yang frekuensinya terletak diantara UV vakum (>180 nm) sehingga kurang
begitu bermanfaat untuk analisis dengan cara spektrofotometri UV-Vis
2. Transisi n σ*
Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung
atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang
diperlukan untuk transisi n menuju σ* lebih kecil dibanding transisi σ σ*
sehingga sinar yang diabsorpsi memiliki panjang gelombang lebih panjang (150-
250 nm) (Sastrohamidjojo, 2001).
3.Transisi n π* dan π π*
Jenis transisi ini molekul organik harus mempunyai gugus fungsional
yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan
orbital phi yang diperlukan (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Pelarut dapat mempengaruhi transisi n π* dan π π*, hal ini berkaitan
dengan adanya perbedaan kemapuan pelarut untuk mensolvasi antara keadaan
dasar dengan keadaan tereksitasi (Sastrohamidjojo, 2001).
Gambar 3. Pengaruh pelarut polar pada transisi π π* (Gandjar dan Rohman, 2007).
Molekul yang menunjukan transisi n π*, keadaan dasar lebih polar dibandingkan
keadaan tereksitasi. Pelarut akan berikatan hidrogen dengan pasangan elektron
yang tidak berpasangan pada molekul dalam keadaaan dasar dibandingkan pada
molekul dalam keadaan tereksitasi (Sastrohamidjojo, 2001).
Gambar 4.Pengaruh pelarut polar pada transisi n π*(Gandjar dan Rohman, 2007).
Terjadinya eksitasi elektronik pada panjang gelombang yang memberikan
absorbansi maksimum disebut panjang gelombang maksimum.Penentuan panjang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
gelombang maksimum yang tetap dapat digunakan untuk identifikasi molekul
yang bersifat karakterisitik sebagai data, sehingga spectrum UV-Vis dapat untuk
tujuan anlisis kualtitaif dan kuantitatif (Mulja dan Suharman, 1995).
G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
1. Definisi dan Instrumentasi
Kromatografi cair kinerja tinggi ( KCKT) atau biasa disebut juga dengan
HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis sampel obat, baik dalam bulk
atau sediaaan farmasetik, serta dalam cairan biologis (Gandjar dan Rohman,
2007).
Gambar 5. Instrumentasi KCKT (Kazekevich and Lobrutto, 2007).
a.Wadah fase gerak dan fase gerak, alat KCKT yang baru dilengkapi
dengn satu atau lebih wadah gelas, yang mengandung 500 mL atau lebih fase
gerak. Sonikasi (penghilangan gas) biasanya dilakukan terlebih dahulu pada fase
gerak untuk menghilangkan gas yang mungkin terdapat didalamnya.Adanya gas
dapat menyebabkan flow rate yang tidak reprodusibel serta dapat mengganggu
detektor (Skoog dkk, 1994).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur dimana secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Fase gerak yang sering digunakan adalah campuran metanol dan
asetonitril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk analit yang bersifat asam
atau basa lemah, peranan pH sangat penting karena jika pH fase gerak tidak diatur
maka analit akan mengalami ionisasi sehingga ikatan dengan fase diam akan
menjadi lemah jika dibandingkan dengan bentuk tidak terionisasi, spesies yang
terionisasi akan terelusi lebih cepat (Rohman dan Gandjar, 2007).
Pelarut yang digunakan dalam analisis menggunakan KCKT detektor UV
hendaknya memiliki UVcut-off yang jauh dari panjang gelombang serapan analit.
Hal ini karena pada panjang gelombang tersebut kepekaan detector UV sangat
lemah (Mulja dan Suharman, 1995).Karakteristik beberapa pelarut yang sering
digunakan pada analisis menggunakan KCKT disajikan pada tabel 1.
Tabel 1.Karakteristik bebrapa pelarut yang digunakan dalam KCKT (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
b.Pompa, dalam alat KCKT syarat pompa yang baik bagi pelarut fase
gerak, yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 350 sampai 500 bar dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir yang biasa digunakan yaitu 0.1-10
mL/min (Meyer, 2004 ).
c.Tempat penyuntikan sampel, sampel berupa cairan atau larutan
disuntikkan secara lansung ke tempat penyuntikan maka sampel akan dibawa fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom (Gandjar dan Rohman,
2007).
d.Kolom, kolom merupakan bagian KCKT yang terdapat fase diam di
dalamnya. Oktadesilsilan (C18) dan oktil silika (C8) merupakan fase diam yang
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih
pendek lagi lebih sesuai untuk pelarut yang bersifat polar (Meyer, 2004).
e.Detektor, persyaratan detektor KCKT adalah sensitivitas yang tinggi,
rentang senstivitas (108 – 1015 analit/detik), kestabilan dan reprodusibilitas yang
baik memberikan respon yang linier terhadap konsentrasi analit, dapat bekerja
dari temperatur kamar sampai 400oC, tidak dipengaruhi oleh perubahan
temperatur dan kecepatan dari fase gerak, mudah didapat dan mudah
dioperasikan, selektif terhadap berbagai macam analit di dalam fase gerak, tidak
merusak sampel, dapat menghilangkan zone broadening dengan adanya pengaruh
kecilnya volume injeksi (Mulja dan Suharman, 1995).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
2. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
a. analisis kualitatif, merupakan identifikasi terhadap analit yang terdapat
dalam ekstrak sampel. Analisis kualitatif KCKT umumnya menggunakan
komponen yaitu: waktu retensi.Waktu retensi analit diukur ketika kondisi dari
KCKT konstan, selanjutnya dibandingkan dengan waktu retensi baku, analit harus
memiliki variasi dengan waktu retensi baku yaitu (± 0,02-0,05 menit) (Snyder,
2010).
b. analisis kuantitatif, merupakan identifikasi terhadap jumlah kadar
analit dalam sampel atau ekstrak. Untuk KCKT kuantifikasi dapat dilakukan
dengan mengukur tinggi puncak atau dengan luas puncak.Tinggi puncak diukur
sebagai jarak dari garis dasar ke puncak maksimum.Sedangkan luas puncak
diukur sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2)
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Kalibrasi menggunakan standar internal, senyawa baku dengan variasi
konsentrasi ditambahakan dengan jumlah baku standar internal yang konstan,
hasil ratio luas area peak kromatogram antara senyawa baku dan standar internal
digunakan sebagai kurva baku untuk pengukuran terhadap jumlah kadar analit
(Snyder, 2010).
H. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan suatu proses untuk menilai suatu
metode dan membuktikan bahwa metode tersebut sudah cocok untuk tujuannya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Penilaian tersebut dapat dilihat dengan menggunakan parameter-parameter
tertentu yang berdasarkan percobaan di laboratorium (Harmita, 2004).
Validasi metode dilakukan berdasarkan tipe prosedur yang dianalisis.
Tipe prosedur yang umum dianalisis ada tiga macam, yaitu :
a) Kategori I : metode analitik untuk penentuan bahan baku obat atau bahan
aktif pada hasil akhir farmasetika.
b) Kategori II : metode analitik untuk penentuan campuran dalam bahan baku
atau komponen sisa pada produk akhir farmasetika.
c) Kategori III : metode analitik untuk penentuan performa karakteristik obat
(disolusi, pelepasan obat) (Harmita, 2004).
1. Akurasi
Akurasi merupakan suatu prosedur analisis untuk melihat ketelitian
metode analisis atau kesesuaian antara nilai yang diperoleh dari hasil analisis dan
nilai sebenarnya (Ermer dan Miller, 2005).
Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali. Akurasi dapat
ditentukan dengan dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) dan
metode penambahan baku (standard addition method). Metode penambahan baku
dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah baku standar ke dalam sampel.
Sebelumnya sampel telah dianalisis terlebih dahulu. Selisih kedua hasil yang
didapat dibandingkan dengan kadar sebenarnya baku standar yang ditambahkan
(Harmita, 2004).
Tabel tentang acuan nilai recovery untuk penetapan akurasi dapat dilihat
pada tabel di bawah ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Tabel II. Nilai recovery yang diperbolehkan untuk setiap kadar analit (Gonzalez dan Herrador, 2007).
2. Presisi
Presisi merupakan prosedur analisis untuk melihat derajad kesesuaian
hasil uji individual beberapa penginjeksian suatu seri standard. Presisi diukur
sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif. Presisi dapat dilakukan pada
tiga tingkatan yang berbeda, yaitu keterulangan (repeatability), presisi antara
(intermediate precision), dan ketertiruan (reproducibility) (Gandjar dan Rohman,
2010).
Presisi terdiri dari dua komponen, yaitu keterulangan dan presisi antara
(intermediate precision).Keterulangan merupakan variasi yang dilakukan oleh
satu analis pada satu instrument. Keterulangan tidak dilakukan pada variasi
instrument atau sistem. Keterulangan dilakukan dengan cara menganalisis
beberapa replikasi sampel dengan menggunakan metode analisis. Kemudian
dihitung simpangan baku relatifnya (koefisien variasi) (Snyder, dkk., 2010).
Intermediate precision merupakan variasi yang terjadi pada saat di
laboratorium, seperti hari berbeda, instrument berbeda, dan analis yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
berbeda.Sebelumnya hal ini dikenal dengan ketangguhan (ruggednes) (Bliesner,
2006).
Kriteria penerimaan diberikan jika metode analisis memberikan
simpangan baku relatif atau koefisien variasi sebesar 2% atau kurang. Akan tetapi
kriteria ini dapat berubah sesuai dengan konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah
sampel, dan kondisi laboratorium (Harmita, 2004). Kiteria penerimaan presisi
dapat dilihat pada tabel dibawah ini.
Tabel III. Kriteria penerimaan presisi untuk setiap kadar analit (Gonzalez dan Herrador, 2007).
3. Selektifitas atau Spesifisitas
Selektivitas atau spesifisitas menggambarkan kemampuan suatu metode
analisis untuk mengukur analit yang diinginkan secara tepat dan spesifik pada
matriks sampel. Pada matriks sampel ada kemungkinan terdapat komponen-
komponen lainnya. Komponen-komponen lain yang mungkin terdapat di dalam
matriks sampel, yaitu pengotor, degradants, dan lain lain (Ermer dan Miller,
2005).
Spesifisitas suatu metode analisis dapat diketahui dengan cara melihat
resolusi dari peak yang dihasilkan pada suatu kromatogram. Ini merupakan salah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
satu cara untuk mengetahui spesifisitas metode analisis. Nilai resolusi yang
dianjurkan harus mendekati atau lebih dari 1,5 (Snyder, dkk., 2010).
4. Liniearitas
Linearitas menggambarkan kemampuan suatu metode analisis untuk
mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional konsentrasi kurva baku
dengan analit di dalam sampel. Pengukuran linearitas dapat dilakukan langsung
pada analit atau dapat dilakukan pada sampel yang telah ditambah baku standar.
Linearitas dapat dilihat dengan dua cara, yaitu secara evaluasi lansung pada garis
persamaaan kurva baku dan secara statistika menggunakan regresi linear (Ermer
dan Miller, 2005).
Pengukuran linearitas dilakukan dengan cara membuat seri baku standar
terlebih dahulu. Seri baku yang dibuat biasanya memiliki rentang antara 50-150%
dari kadar analit di dalam sampel. Suatu metode analisis dikatakan linear apabila
memenuhi persyaratan nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,999. Pembuatan kurva baku
yang akan digunakan untuk perhitungan kadar zat sampel dapat dilakukan dengan
tiga macam teknik standar. Teknik standar tersebut, yaitu standar eksternal,
standar internal, dan standar adisi (Snyder, dkk., 2010).
5. Rentang
Rentang merupakan interval antara batas terendah dan tertinggi analit yang
telah memenuhi persyaratan keakuratan, keseksamaan, dan lineritas (Harmita,
2004). Rentang kerja dari suatu metode analisis didapatkan dari hasil karakteristik
validasi yang didapatkan pada bagian akurasi, presisi, dan lineritas (Ermer dan
Miller, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
I. Landasan Teori
Rokok merupakan produk yang terbuat dari bahan baku daun tembakau,
dalam tembakau tersebut banyak mengandung berbagai senyawa alkaloid salah
satunya adalah senyawa nikotin. Nikotin merupakan senyawa alkaloid yang
terdapat pada famili Solanaceae, dengan sifat senyawa basa yang terdapat pada
molekul nikotin yaitu pada cincin pirolidin dengan pKa 7,84 dan cincin piridin
dengan pKa 3,04. Kandungan nikotin dalam rokok perlu diteliti untuk penjaminan
mutu kandungan nikotin dan juga memenuhi hak konsumen untuk mendapat
informasi terkait kadar nikotin dalam rokok sesuai dengan peraturan pemerintah
nomor 109 tahun 2012 Pasal 10 Ayat 1.
Metode KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) fase terbalik yang
telah dioptimasi dapat memisahkan beberapa campuran senyawa pada ekstrak
tembakau, karena adanya perbedaan interaksi antara senyawa-senyawa tersebut
dengan fase diam oktil silica (C8) dan fase gerak metanol : ammonium asetat
10mM +TEA 0,1% (70 : 30). Metode ini harus divalidasi terlebih dahulu sebelum
dilakukan penetapan kadar agar hasil analisis yang didapatkan nantinya dapat
dipertanggungjawabkan, dapat dipercaya, dan dapat diterima berdasarkan
parameter-parameter validasi yang digunakan. Parameter-paramater yang
divalidasi yaitu Parameter-paramater validasi yang digunakan, meliputi
selektivitas yang ditentukan dengan resolusi, linearitas yang ditentukan dengan
koefisien korelasi (r), akurasi yang ditentukan dengan persen perolehan kembali
(recovery), presisi yang ditentukan dengan koefisien variasi, dan rentang yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
ditentukan dari kadar terendah sampai tertinggi sampel yang memenuhi parameter
linearitas, akurasi, dan presisi.
Penetapan kadar nikotin dalam sampel rokok “MEREK X” dilakukan
dengan membandingkan nilai AUC (Area Under Curve) antara sampel ekstrak
tembakau yang telah ditambahkan dengan standar internal asetanilida dengan
AUC standar baku nikotin yang juga telah ditambahkan dengan standar internal
asetanilida. Dengan menggunakan persamaan kurva baku nikotin dan asetanilida,
y = bx + a, dimana y adalah AUC dan x adalah kadar nikotin., maka AUC sampel
dimasukkan dalam persamaan, kemudian kadar dari sampel nikotin dalam ekstrak
tembakau rokok “MEREK X” dapat diketahui.
J. Hipotesis
a. Metode KCKT fase terbalik yang menggunakan fase diam oktil silika
(C8) dan fase gerak metanol:ammonium asetat 10 mM + TEA 0,1% (70:30)
dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit pada penetapan kadar nikotin dalam ekstrak
tembakau rokok “MEREK X” memenuhi parameter-parameter validasi, meliputi
selektivitas yang ditentukan dengan resolusi, linearitas yang ditentukan dengan
koefisien korelasi (r), akurasi yang ditentukan dengan persen perolehan kembali
(recovery), presisi yang ditentukan dengan koefisien variasi, dan rentang yang
ditentukan dari kadar terendah sampai tertinggi sampel yang memenuhi parameter
linearitas, akurasi, dan presisi.
b. Ekstrak tembakau rokok “MEREK X” mengandung senyawa analit
nikotin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental, karena tidak
dilakukan perlakuan atau manipulasi pada subjek uji yang digunakan dan
merupakan rancangan deskriptif karena hanya menggambarkan data yang
diperoleh.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah sistem kromatografi cair kinerja
tinggi dengan fase diam oktil silika (C8) dan fase gerak methanol:ammonium
asetat 10 mM + TEA 0,1% (70:30) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit dan
ekstrak tembakau rokok “Merek X”.
2. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter validasi yaitu
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang serta kadar nikotin yang
terdapat pada ekstrak tembakau rokok “Merek X”.
3. Variabel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah
a. Kemurnian pelarut, sehingga digunakan pelarut pro analysis, yang
memiliki kemurnian tinggi.
b. Larutan baku nikotin yang bersifat mudah teroksidasi oleh udara dan
cahaya, diatasi dengan menggunakan aluminium foil untuk menutupi alat-
alat gelas.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
C. Definisi Operasional
1. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang digunakan dalam
penelitian ini menggunakan kolom fase diam oktilsilika (C8) dan komposisi
fase gerak metanol : ammonium asetat 10mM + TEA 0,1% (70 : 30).
2. Ekstrak tembakau rokok “Merek X”.
3. Validasi metode yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pengukuran
terhadap parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi,
presisi, dan rentang.
4. Kadar nikotin dalam 1 gram ekstrak dinyatakan dalam satuan %b/b ± SD.
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan memiliki kualitas pro analysis kecuali
dinyatakan lain yaitu baku nikotin (E. Merck), asetanilida (E. Merck), ammonium
asetat (E. Merck), Metanol (E.Merck), kalium hidroksida (E. Merck) memiliki
kualitas teknis, kloroform (E.Merck) memiliki kualitas teknis, Etanol (E. Merck)
memiliki kualitas teknis, aquadest dan aquabidest. Sampel yang digunakan dalam
penelitian ini adalah ekstrak tembakau rokok “Merek X”
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis (merek optima SP-
300 Plus), seperangkat alat KCKT fase terbalik terdiri: pompa (merek Shimadzu
LC-10 AD No. C20293309457 J2) dengan sistem elusi gradien dan isokratik,
detektor UV-Vis (merek Shimadzu SPD 10 AV No. C20343502697 KG), kolom
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
C8merek Shimadzu (spesifikasi ukuran diameter internal 4,6mm x 25 cm, ukuran
diameter partikel 5µm fully encapped residual silanol), seperangkat alat computer
(merek Dell Vostro 220), printer (merek HP D2566), alat ultrasonikator (Retsch
tipe T640 no 935922013), organic and anorganic solvent membrane filter
(Whatman) ukuran pori 0,45 m dengan diameter 47mm, alat sentrifugasi, alat
vortex, neraca analitik merek Ohaus, milipore, mikropipet, indicator PH, pompa
vakum dan seperangkat alat gelas.
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan Campuran Fase Gerak
a. Pembuatan Ammonium Asetat 10 mM dan TEA 0,1%
1. Pembuatan larutan ammonium asetat 10 mM. Menimbang seksama
kurang lebih 0,7708 g ammonium asetat (BM = 77,08), dilarutkan dengan
aquabidest pada labu takar 1000 mL hingga batas tanda. Didapatkan larutan
ammonium asetat 10 mM.
2. Pembuatan TEA 0,1% v/v.Mengambil sebanyak 1 mL trietilamin,
ditambahkan ke dalam larutan ammonium asetat, dilarutkan dengan aquabidest
pada labu takar 1000 mL hingga batas tanda. Didapatkan larutan ammonium
asetat 10 mM + TEA 0,1%.
b. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan yaitu campuran metanol : ammonium asetat
10mM + TEA 0,1% (70 : 30). Masing-masing larutan disaring menggunakan
kertas saring whatman organik untuk larutan metanol sedangkan anorganik untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
larutan tea dan ammonium asetat, dibantu dengan pompa vakum dan
diawaudarakan selama 15 menit.Pencampuran fase gerak dilakukan secara manual
didalam wadah fase gerak.
2. Pembuatan Larutan Baku Standar Internal Asetanilida
a. Pembuatan larutan stok asetanilida. Menimbang seksama kurang
lebih 0,5 gram asetanilida, laruttkan dengan metanol dalam labu takar 10,0 mL
hingga tanda. Didapatkan larutan stok asetanilida 0,05 g/mL (50 mg/mL).
b. Pembuatan larutan intermediet asetanilida. Larutan asetanilida 2,5
mg/mL dibuat dengan cara mengambil 0,5 mL larutan stok asetanilida 50 mg/mL
ke dalam labu takar 10,0 mL, encerkan hingga tanda dengan metanol.
c. Pembuatan larutan intermediet kerja asetanilida. Larutan intermediet
kerja asetanilida 0,1 mg/mL dibuat dengan cara mengambil 0,2 mL larutan
intermediet asetanilida 2,5 mg/mL ke dalam labu takar 5,0 mL, encerkan hingga
tanda dengan methanol.
3. Pembuatan Larutan Baku Nikotin
a. Pembuatan larutan stok baku nikotin. Larutan stok dibuat dengan
cara mengambil 497 µL baku nikotin dan dimasukkan ke dalam labu takar 5,0
mL. Larutan diencerkan dengan metanol hingga tanda. Didapatkan larutan stok
nikotin 0,1 g/mL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
b. Pembuatan larutan intermediet baku nikotin. Larutan intermediet
nikotin 10 mg/mL dibuat dengan cara mengambil 0,5 mL larutan stok nikotin 100
mg/mL ke dalam labu takar 5,0 mL, encerkan hingga tanda dengan metanol.
c. Pembuatan larutan intermediet kerja baku nikotin. Larutan
intermediet kerja nikotin 0,2 mg/mL dibuat dengan cara mengambil 0,2 mL
larutan intermediet asetanilida 10 mg/mL ke dala labu takar 10,0 mL, encerkan
hingga tanda dengan metanol.
d. Pembuatan seri larutan baku nikotin. Dibuat seri larutan baku dengan
konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 µg/mL dengan cara mengambil sebanyak 500,
600, 700, 800 dan 900 µL dari larutan intermediet kerja nikotin, dimasukkan ke
dalam labu takar 5,0 mL.
e. Pembuatan seri larutan baku nikotin dengan penambahan standar
internal asetanilida. Standar internal asetanilida 20 µg/mL dibuat dengan cara
mengambil sebanyak 500 µL dari larutan intermediet kerja asetanilida,
dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL yang sebelumnya telah diisi dengan seri
larutan baku nikotin, encerkan hingga tanda dengan metanol.
4. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan
a. Penentuan panjang gelombang maksimum pengamatan nikotin.
Dilakukan screening larutan baku nikotin 20 µg/mL, 30 µg/mL, dan 40 µg/mL
pada daerah panjang gelombang 225-300 nm, menggunakan spektrofotometer
UV-Vis. Panjang gelombang maksimum pengamatan ditentukan berdasarkan
spektra dengan serapan yang maksimal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
b. Penentuan panjang gelombang maksimum pengamatan asetanilida.
Dilakukan screening larutan baku asetanilida 1 µg/mL, 5 µg/mL, dan 10 µg/mL
pada panjang gelombang 225-300 nm, menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
Panjang gelombang maksimum pengamatan ditentukan berdasarkan spektra
dengan serapan yang maksimal.
5. Pembuatan Kurva Baku Nikotin dengan Standar Internal Asetanilida
Pembuatan seri larutan baku nikotin dengan konsentrasi 20, 40, 60, 80,
dan 100 µg/mL, masing-masing larutan ditambahkan standar internal asetanilida
20 µg/mL, kemudian disaring dengan menggunakan milipore, lalu diawaudarakan
selama 15 menit. Selanjutnya masing-masing campuran larutan baku diinjeksikan
pada system kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dengan fase
diam oktil silica (C8) dan fase gerak metanol : ammonium asetat 10mM + TEA
0,1% (70:30), dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Dari hasil luas area masing
baku campuran baku, selnajutnya dibandingkan kemudian diplotkan terhadap
konsentrasi nikotin untuk memperoleh regresi linier dengan persamaan y = bx + a
6. Penyiapan Sampel
a. Pembuatan larutan KOH 10 M. Menimbang seksama lebih kurang
56,11 g (BM = 56,11), masukkan ke dalam labu takar 100,0 mL, kemudian
larutkan dengan aquades hingga tanda.
b. Pembuatan larutan KOH 0,1 M. Mengambil 2,0 mL KOH 10 M,
masukkan ke dalam labu takar 200,0 mL, kemudian encerkan dengan aquades
hingga tanda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
c. Pemilihan dan Pengambilan Sampel. Sampel yang dipilih adalah
rokok dengan “Merek X” yang diambil dari toko penjualan rokok “MEREK X”
Kabupaten Sleman, Yogyakarta dengan nomor batch sama. Selanjutnya dari 90
bungkus rokok diambil masing-masing 1 batang rokok lalu dipreparasi.
d. Preparasi sampel rokok. Diambil 90 batang rokok “MEREK X”
yang telah dibeli, dipotong tegak lurus bagian batang rokok. Bagian batang rokok
yang mengandung serbuk tembakau dan cengkeh dikeluarkan. Serbuk diaduk
kemudian diblender. Campuran serbuk hasil blender yang dihasilkan kemudian
diayak dengan ayakan nomor mesh 16, didapatkan campuran serbuk halus
tembakau yang lolos dari ayakan. Campuran serbuk halus tembakau ini siap untuk
diekstraksi lebih lanjut.
7. Pembuatan Ekstrak Tembakau Rokok “MEREK X”
a. Optimasi lama waktu ekstraksi. Serbuk rokok “MEREK X” yang
telah diayak ditimbang sebanyak 200 mg. Selanjutnya dimasukan ke dalam beker
gelas, ditambahkan etanol teknis sebanyak 20 mL, dan asetanilida 10mg/mL
sebanyak 20 µL. Selanjutnya beker gelas dipanaskan di atas waterbath selama
waktu optimasi yaitu : 10 menit, 20 menit, 30 menit, dan 40 menit dengan suhu ±
70oC. Setelah proses pemanasan, diambil sebanyak 5 mL ekstrak tembakau rokok
“MEREK X” untuk diuapkan. Lalu setelah proses penguapan selesai,
ditambahkan sejumlah 1 mL aquades, 3 mL kloroform dan 1 mL larutan KOH 0,1
M dalam ekstrak kental tembakau rokok “MEREK X”. Selanjutnya dimasukkan
ke dalam tabung sentrifugasi, lalu divortex selama 30 detik dan disentrifugasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
selama 24 menit. Tahap selanjutnya diambil bagian fase kloroform, dan dilakukan
pengulangan dengan penambahan 3 mL kloroform lagi ke dalam ekstrak rokok
“MEREK X” yang telah diambil fase kloroformnya, dan di vortex selama 30 detik
dan disentrifugasi selama 24 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Selanjutnya
diambil bagian kloroformnya. Bagian kloroform yang telah terkumpul dalam vial,
selanjutnya diuapkan hingga kering, sampai didapatkan ekstrak kental rokok.
ditambahkan 5,0 mL fase gerak, diawaudarakan selama lebih kurang 5 menit.
Diambil 1,0 mL larutan yang telah diawaudarakan, disaring dengan milipore dan
dimasukkan ke dalam vial KCKT, vial KCKT diawaudarakan selama lebih kurang
2 menit. Larutan siap diinjeksikan. Masing-masing waktu optimasi dilakukan 3
kali replikasi.
b. Ekstraksi Rokok “MEREK X” hasil optimasi. Dilakukan prosedur
yang sama dengan ekstraksi rokok “MEREK X” dengan menggunakan waktu
yang optimal yaitu selama 30 menit. Ekstraksi hasil optimasi dilakukan 5 kali
replikasi.
8. Validasi Metode
a. Penentuan resolusi sampel. Sebanyak 20 µL hasil ekstraksi sampel
yang telah disaring dengan milipore dan diawaudarakan selama 15 menit
diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam oktil silika (C8)
dan fase gerak metanol:ammonium asetat 10 mM + TEA 0,1% (70:30) dengan
kecepatan alir 1,0 mL/menit. Dilakukan repetisi tiga kali. Resolusi dihitung
dengan memasukkan selisih waktu retensi dan lebar setengah tinggi peak nikotin
ke dalam rumus perhitungan resolusi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
b. Pembuatan kurva baku dan penentuan linearitas. Dibuat seri larutan
baku nikotin dengan konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 µg/mL sebanyak 1 mL,
masing-masing larutan ditambahkan standar internal asetanilida 20 µg/mL
sebanyak 100 µL, kemudian disaring dengan menggunakan milipore kemudian
diawaudarakan selama 15 menit. Sebanyak 20 µL dari masing-masing larutan
diinjeksikan pada sistem kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan fase
diam oktil silika (C8) dan fase gerak metanol:ammonium asetat 10 mM + TEA
0,1% (70:30) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Dari kromatogram akan
diperoleh luas area nikotin dan luas area asetanilida untuk masing-masing
konsentrasi. Luas area ini kemudian dibandingkan sehingga didapatkan
perbandingan luas area nikotin terhadap asetanilida. Perbandingan kedua luas area
ini kemudian diplotkan terhadap konsentrasi nikotin untuk memperoleh regresi
linear dengan persamaan y = bx + a dan nilai koefisien korelasi (r) yang akan
digunakan untuk menentukan parameter validasi linearitas
c. Penentuan persen kembali (recovery) dan penentuan koefisen variasi
adisi baku nikotin dalam sampel (presisi). Dibuat dua macam larutan yaitu larutan
sampel dan larutan sampel yang ditambahkan baku nikotin (adisi). Larutan sampel
dibuat dengan tiga tingkatan berdasarkan penimbangan sampel rokok. Larutan
sampel pertama untuk level rendah dibuat dengan cara menimbang sampel
sebanyak 125 mg, kemudian dilakukan ekstraksi sampel. Larutan sampel kedua
untuk level sedang dibuat dengan cara menimbang sampel sebanyak 150 mg,
kemudian dilakukan ekstraksi sampel.Larutan sampel ketiga untuk level tinggi
dibuat dengan cara menimbang sampel sebanyak 175 mg. Ekstrak sampel siap
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
untuk diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan cara mengambil 1,0 mL
ekstrak sampel, disaring dengan milipore dan dimasukkan ke dalam vial KCKT,
vial KCKT diawaudarakan selama lebih kurang 2 menit.Sampel siap
diinjeksikan.Dilakukan replikasi sebanyak tiga kali untuk tiap level. Larutan
sampel yang ditambahkan baku nikotin (adisi) dibuat dengan cara menambahkan
baku nikotin pada vial KCKT untuk setiap level, untuk level rendah ditambahkan
2,5 µg/mL, untuk level sedang ditambahkan 5 µg/mL, dan untuk level tinggi
ditambahkan 10 µg/mL, 20 µg/mL, dan 50µg/mL. Setiap level perlakuan
dilakukan replikasi tiga kali. Kadar baku nikotin yang ditambahkan dalam sampel
merupakan selisih nilai kadar sampel adisi dan kadar sampel. Kemudian dihitung
persen perolehan kembali (recovery), Standard Deviation (SD), dan koefisien
variasi (KV).
9. Penetapan Kadar Nikotin Dalam Sampel Rokok “MEREK X”
Sampel yang telah dipreparasi, diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam
system KCKT yang telah dioptimasi sehingga didaptkan kromatogram sampel dan
dibaca AUC dari masing-masing replikasi. Masukkan hasil AUC ke persamaan
regresi linier baku nikotin dengan standar internal asetanilida dari hasil validasi
sehingga diperoleh kadar sampel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
G. Analisis Hasil
1. Selektivitas
Selektivitas ditentukan dengan menghitung resolusi dari kromatogram
yang dihasilkan oleh ekstraksi sampel rokok. Menurut Synder dkk. (2010), syarat
resolusi yang baik yaitu dimana senyawa analit terpisah dari senyawa-senyawa
yang lain adalah ≥ 1,5.
Resolusi dihitung dengan rumus :
(1)
Dimana : Rs = resolusi t2 = waktu retensi puncak kedua t1 = waktu retensi puncak pertama 0,5W(1) = lebar setengah tinggi puncak pertama 0,5W(2) = lebar setengah tinggi puncak kedua
2. Linearitas dan Rentang
Linearitas ditentukan dengan nilai koefisien korelasi (r), yang diperoleh
dari AUC baku nikotin yang diplotkan terhadap konsentrasi baku. Nilai r yang
dipersyaratkan adalah ≥ 0,999 (Snyder, dkk, 1997). Sedangkan rentang diperoleh
dari kadar terendah hingga tertinggi sampel yang memberikan akurasi, presisi, dan
linearitas yang baik.
3. Akurasi
Menurut Harmita (2004), akurasi ditentukan dengan persen perolehan
kembali (recovery), yang dapat dihitung dengan rumus :
x 100%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
(2)
4. Presisi
Presisi dinyatakan dengan koefisien variasi (KV), yang dapat dihitung
dengan rumus :
(3)
5. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif nikotin
Hasil data dari optimasi ektraksi dilakukan analisis statistik untuk
melihat apakah hasil kadar nikotin yang diperoleh pada tiap-tiap waktu optimasi
berbeda bermakna atau tidak.
Analisis kualitatif dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan
baku nikotin. Analisi kuantitatif dapat dihitung dengan memasukkan AUC sampel
yang dibandingkan dengan AUC standar internal asetanilida ke dalam persamaan
regresi linier yang diperoleh dari kurva baku nikotin yang telah dibandingkan
dengan standar baku internal asetanilida hasil validasi y = bx + a. Sehingga
didapatkan kadarnya. Satuan kadar nikotin adalah %b/b±SD.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
BAB IV
PEMBAHASAN
Penetapan kadar nikotin pada sampel rokok “MEREK X” dianalisis
menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik,
metode yang digunakan telah dioptimasi.
A. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian diperoleh dari hasil optimasi
yaitu Metanol : Ammonium asetat + TEA 0,1% ( 70 : 30 ). Pemilihan komponen
dari fase gerak ini dilakukan pada tahap optimasi fase gerak dan dilakukan
optimasi pada masing-masing komposisi perbandingan untuk mendapatkan
perbandingan fase gerak yang optimal dalam memisahkan senyawa analit nikotin
dengan standar internal asetanilida.
Penggunaan metanol sebagai salah satu komponen campuran fase gerak
karena metanol dapat melarutkan senyawa analit nikotin dan standar internal
asetanilida. Pemilihan metanol sebagai fase gerak lebih cocok digunakan pada
sistem KCKT fase terbalik, karena metanol sebagai pelarut organik pada sistem
kromatografi fase terbalik bersifat larut air, relatif encer sehingga dapat
menurunkan tekanan pada kolom, stabil pada penggunaan sebagai fase gerak, dan
juga dapat digunakan sebagai pelarut yang jernih pada deteksi dengan panjang
gelombang UV (Snyder, 2010).
Penggunaan ammonium asetat sebagai salah satu kompenen campuran fase gerak
yang mampu untuk menambah ionic strength dari senyawa analit, sehingga dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
mengurangi peak tailing. Umumnya ammonium asetat digunakan sebagai
komponen fase gerak dimana fase gerak yang dibuat dengan pH < 8,0.
Konsentrasi dari ammonium asetat yang umum digunakan sebagai fase gerak
sistem KCKT fase terbalik adalah rentang dari 2 sampai 20 mM, sehingga dipilih
konsentrasi 10mM yang masih masuk range konsentrasi umum digunakan
(Synder, 2010).
Penggunaan TEA dalam campuran fase gerak sebanyak 0,1 % didasarkan
pada penelitian Bao, He, Ding, Prabhu, dan Hong (2005) tentang analisis nikotin.
TEA pada komposisi fase gerak berfungsi untuk menutupi bagian gugus silanol
pada fase diam sehingga mengurangi interaksi silanol dengan analit, maka
diharapkan menghasilkan bentuk peak yang baik (Snyder, 2010).
HN
H3C
CH3
H3C
Si
O
TEA (Triethylamine)
Gugus silanol
Gambar 6. interaksi TEA dengan gugus silanol pada fase diam (C8)
Pada pembuatan fase gerak untuk sistem KCKT fase terbalik harus
dilakukan proses degassing/awaudara dan filtrasi fase gerak, karena ketika udara
terjebak dengan larutan fase gerak dan masuk ke dalam kolom serta detektor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
KCKT akan mempengaruhi hasil kromatogram menjadi tidak valid. Maka setiap
fase gerak dan larutan yang akan masuk ke dalam kolom KCKT harus dilakukan
awaudara terlebih dahulu. Pada proses filtrasi fase gerak merupakan suatu standar
operasional KCKT yang harus dilakukan untuk memisahkan partikel-partikel
pengotor yang mungkin terbawa selama proses penyiapan fase gerak, alat yang
umum digunakan untuk proses filtrasi adalah alat vakum dan kertas milipore
untuk menyaring larutan contohnya kertas whatman. Pada larutan yang bersifat
anorganik digunakan kertas whatman jenis organik dan sebaliknya untuk larutan
jenis organik. Pada fase gerak terdapat 2 macam larutan yaitu bagian organik pada
larutan metanol dan bagian anorganik pada larutan ammonium asetat dan TEA,
maka pembuatannya dilakukan dengan terlebih dahulu menyaring masing-masing
komposisi fase gerak, baru selanjutnya dicampurkan dengan menggunakan gelas
ukur sebagai penakar untuk masing-masing komposisinya dan dimasukkan dalam
botol fase gerak.
B. Standar Internal Asetanilida
Standar internal disini berperan sebagai pengoreksi terhadap metode
ekstraksi yang dilakukan agar mencegah kesalahan dalam pengukuran karena
proses metode yang cukup panjang yaitu proses ekstraksi nikotin pada sampel
rokok “MEREK X” dilakukan dalam 2 tahap yaitu proses ekstraksi padat – cair
dan ekstraksi cair – cair.
Pemilihan asetanilida sebagai standar internal untuk senyawa analit nikotin
didasari dari beberapa kriteria yaitu :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
1. Senyawa standar internal yang digunakan dapat terpisah baik dari komponen
lain yang terdapat pada ekstrak campuran sampel (Boyd, 2008).
Asetanilida yang digunakan sebagai standar internal ditambahkan dalam
matriks sampel, selanjutnya diekstraksi, dan hasil ekstrak tembakau sampel rokok
“MEREK X” dengan standar asetanilida diukur dengan metode KCKT.
Kromatogram dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
Gambar 7. Kromatogram ekstrak tembakau rokok “MEREK X” dengan standar internal
asetanilida.
Hasil kromatogram pada tR (time retention) pada 3,645 min menunjukan senyawa
asetanilida dan pada 4,616 min menunjukan senyawa nikotin. Dari hasil
kromatogram inin dapat disimpulkan bahwa senyawa asetanilida yang digunakan
sebagai standar internal dapat terpisah baik terhadap senyawa nikotin dan
senyawa lain pada sampel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
2. Tidak terdapat kandungan senyawa standar internal dalam sampel (Boyd,
2008).
Penelitian terhadap ada atau tidaknya kandungan asetanilida dalam
sampel rokok dilakukan dengan membandingkan kromatogram baku asetanilida
dengan ekstrak etanolik fraksi kloroform sampel. Pada gambar 8 menunjukan data
kromatogram bahwa pada sampel rokok “MEREK X” yang telah diekstraksi tidak
terdapat kandungan senyawa asetanilida, dimana ditunjukan bahwa senyawa
asetanilida muncul pada tR 3,915 sedangkan pada kromatogram sampel rokok
tidak ada peak asetanilida pada tR tersebut.
A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
B
Gambar 8. A: kromatogram sampel rokok; B: kromatogram asetanilida
3. Hasil peak kromatogram standar internal harus mendekati senyawa yang
dianalisis (Boyd, 2008).
Pada gambar X menunjukan bahwa tR antara senyawa asetanilida pada
3,645 min dan nikotin pada 4,616 min, perbedaan tR antara senyawa asetnilida dan
nikotin adalah 0,971 min. Perbedaan tR dari kedua senyawa tersebut tidak terlalu
jauh, sehingga dapat disimpulkan bahwa peak kromatogram standar internal
asetanilida mendekati senyawa nikotin.
4. Senyawa harus stabil secara kimia dan fisika terhadap metode yang digunakan
(Boyd, 2008).
Asetanilida dalam proses ekstrasi mengalami beberapa proses yaitu
pemanasan, sentrifugasi, dan pencampuran dengan beberapa senyawa kimia
(metanol, KOH, dan kloroform). Melihat kestabilan asetanilida selama proses
ektraksi, dilakukan pembandingan terhadap kromatogram asetanilida yang melalui
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
proses ekstraksi dengan asetanilida tanpa melalui ekstraksi menggunakan metode
KCKT. Hasil pada gambar 9 dan tabel IV menunjukan bahwa asetanilida dengan
kadar yang sama ketika dilakukan ekstraksi masih menunjukan nilai AUC yang
hamir mirip dengan baku asetanilida yang tanpa dilakukan metode ekstraksi.
Maka dapat disimpulkan bahwa senyawa asetanilida stabil secara kimia dan fisika
terhadap metode ekstraksi yang dilakukan.
A
B
Gambar 9. A: kromatogram asetanilida hasil ekstraksi; B: kromatogram asetanilida baku tanpa ekstraksi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Tabel IV. Hasil pengukuran AUC asetanilida dengan ekstraksi dan tanpa ekstraksi
Keterangan AUC
Asetanilida hasil ekstraksi 584211
Asetanilida tanpa ekstraksi 595610
5. Memiliki kemiripan sifat kimia dan fisika dengan analit
Senyawa standar internal asetanilida memiliki beberapa sifat fisika dan
kimia yang mirip dengan nikotin, antara lain
a. Kelarutan
Kelarutan dapat dilihat dari nilai log p masing-masing senyawa, pada
senyawa asetanilida memiliki nilai log p sebesar 1,21 dan nikotin sebesar 1,16.
Nilai dari log p antara asetanilida dan nikotin tidak berbeda jauh, maka dapat
disimpulkan bahwa dari sifat fisika dari senyawa analit nikotin dan standar
asetanilida memiliki kemiripan yang dekat terkait kelarutan.
b. Nilai tR
Nilai tR pada sistem KCKT dapat menjadi salah satu indikator untuk
melihat besarnya kepolaran masing-masing senyawa. Hasil kromatogram pada
gambar X menunjukan hasil bahwa senyawa asetanilida memiliki tR 3,645 min
dan senyawa nikotin tR nya 4,616 min. Perbedaan yang dekat dari nilai tR
menunjukan bahwa senyawa nikotin dan asetanilida memiliki sifat kepolaran yang
mirip.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Indikator sifat kelarutan dan kepolaran yang mirip dari standar internal
dengan nikotin nantinya diharapkan asetanilida dapat memimik senyawa analit
nikotin selama proses ekstraksi sampel.
C. Pemilihan dan Pembuatan Sampel
Tujuan penelitian ini adalah mengetahui kadar nikotin dalam ekstrak
tembakau rokok “Merek X”. Teknik pemilihan sampel rokok “Merek X” yaitu
berdasarkan pada kadar nikotin yang tinggi dibanding rokok sejenis dapat dilihat
pada tabel V dan juga jumlah konsumen yang banyak yaitu dimana sampel rokok
yang dipilih memegang pangsa pasar rokok indonesia mencapai 20,1% menurut
data Nielsen Retail Audit tahun 2012. Pemilihan sampel rokok “Merek X”
selanjutnya diambil secara acak berdasarkan nomor batch yang sama di satu
tempat penjualan rokok daerah Kabupaten Sleman, Yogyakarta. Sampling dengan
no batch atau no produksi yang sama ini diharapkan agar proses pembuatan dan
jenis tembakau yang digunakan adalah sama karena proses produksi yang
dilakukan dalam hari dan alat yang sama, sehingga mengurangi bias dalam
penentuan kadar nikotin dalam sampel rokok. Jumlah nikotin pada kemasan rokok
dapat dilihat pada tabel dibawah ini
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Tabel V. Jumlah nikotin pada kemasan rokok
Sampling rokok dilakukan dengan mengambil sebanyak tiap 1 batang
rokok dari 90 bungkus rokok “Merek X” dari satu tempat penjualan rokok.
Setelah sampel rokok telah dipilih selanjutnya, dilakukan proses pembuatan
sampel bertujuan untuk mempersiapkan sampel ketahap ekstraksi, selain itu juga
untuk menjamin keseragaman senyawa analit. Tahap yang dilakukan yaitu proses
penyerbukan.
Proses penyerbukan sampel tembakau rokok untuk memperkecil ukuran
partikel. Sampel tembakau rokok yang telah dipisahkan dari kertas rokok dan
filternya, ditimbang terlebih dahulu isi tembakau kering tiap batang rokok, untuk
mengetahui jumlah daun tembakau kering yang terdapat tiap batang rokok dan
menjadi patokan jumlah penimbangan sampel selanjutnya dalam proses
penimbangan untuk esktraksi dan penetapan kadar. Sampel tembakau rokok yang
telah ditimbang lalu dihaluskan menggunkan blender , ini dilakukan untuk
memperkecil ukuran partikel yang nantinya akan memperluas kontak sampel
dengan pelarut pada proses ekstraksi. Tahap terakhir yaitu pengayakan, dengan
No Jenis Rokok Jumlah nikotin pada kemasan
1 Merek X 1,8 mg
2 Merek Y 1 mg
3 Merek Z 1,8 mg
4 Merek V 1 mg
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
menggunakan pengayak dengan no mesh 16 untuk mendapatkan sampel tembakau
yang seragam ukurannya.Derajat halus serbuk dalam Farmakope Indonesia Edisi
III dinyatakan dengan nomor pengayak, jika derajat halus dinyatakan dengan satu
nomor dimaksudkan bahwa semua serbuk dapat melalui pengayak dengan nomor
tersebut.
D. Pembuatan Larutan Baku
Larutan baku nikotin dan asetanilida dibuat dengan melarutkan sejumlah
tertentu baku nikotin dan asetanilida E.merck dalam pelarut yang cocok. Pelarut
yang digunakan adalah metanol 30%. Pemilihan pelarut metanol dengan
konsentrasi 30% yaitu untuk mencegah perbedaan dari solvent strength antara fase
gerak dan pelarut yang digunakan pada baku. Pada fase gerak konsentrasi metanol
adalah 70%, maka digunakan konsentrasi pelarut pada baku sebesar 30% dibawah
dari fase gerak agar tidak mempengaruhi konsentrasi metanol pada fase gerak.
Solvent strength yang berubah dapat menyebabkan perubahan pada waktu retensi,
tailing faktor dan parameter lain pada kromatogram KCKT.
Pembuatan larutan stok baku nikotin dengan konsentrasi 0,2 mg/mL,
kemudian dibuat 5 seri konsentrasi larutan baku nikotin yaitu 20, 40, 60, 80, dan
100 µg/mL. Selanjutnya ditambahkan masing-masing konsentrasi dengan standar
internal asetanilida, konsentrasi akhir asetanilida 20 µg/mL dengan campuran tiap
seri baku nikotin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
E. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan
Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk memperoleh
panjang gelombang analisis yang dapat memberikan serapan maksimum dari
nikotin dan asetanilida. Penentuan panjang gelombang nikotin dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometer UV pada rentang panjang gelombang 225 300 nm
karena menurut Clarke 2010 panjang gelombang nikotin pada 259 nm pada
pelarut asam dan 261 pada pelarut basa. Pengukuran panjang gelombang
maksimum dilakukan pada 3 seri konsentrasi yaitu rendah (20 µg/mL), sedang (30
µg/mL), dan tinggi (40 µg/mL). Dapat dilihat hasil spektra panjang gelombang
nikotin dari 3 seri konsentrasi pada gambar 10.
Gambar 10. Spektra panjang gelombang maksimum nikotin pada tiga tingkat konsentrasi,
20, 30, dan 40 µg/mL. Keterangan : A = konsentrasi 20 µg/mL, absorbansi 0,291, λ maksimum 260,5; B = konsentrasi 30 µg/mL, absorbansi 0,53791, λmaksimum 260,5; C =
konsentrasi 40 µg/mL, absorbansi 0,655, λmaksimum 260
Dari ketiga gambar 11 spektra nikotin yang diperoleh terlihat bahwa
panjang gelombang spektra yang dihasilkan pada tiga level konsentrasi masing-
A
B
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
masing yaitu 260,5; 260,5; dan 260 nm maka diambil rata-rata untuk
mendapatkan panjang gelombang maksimum yaitu 260 nm. Beda panjang
gelombang antar seri konsentrasi tidak jauh, maka digunakan panjang gelombang
260 nm yang paling dekat dengan rata-rata dari hasil kromatogram.
Selanjutnya penetapan panjang gelombang maksimum asetanilida
menggunakan spektrofotometer UV.Asetanilida memiliki kromofor pada cincin
benzennya sehingga dapat memberikan serapan pada daerah sinar ultraviolet.Pada
penentuan panjang gelombang pengamatan asetanilida digunakan tiga seri
konsentrasi asetanilida yaitu 1, 5, dan 10 µg/mL dengan scanning panjang
gelombang dari 200-300 nm.
Gambar 11. Spektra panjang gelombang maksimum asetanilida pada tiga tingkat konsentrasi, 1, 5, dan 10 µg/mL. Keterangan : A = konsentrasi 1 µg/mL, absorbansi 0,239,
λmaksimum 240; B = konsentrasi 5 µg/mL, absorbansi 0,361, λmaksimum 240,5; C = konsentrasi 10 µg/mL, absorbansi 0,776, λmaksimum 240,5
Pada gambar 11 menunjukan bentuk spektra asetanilida. Hasil scanning
panjang gelombang asetanilida menunjukan bahwa asetanilida memiliki panjang
A
B
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
gelombang maksimum pada 240 nm, hasil ini didapatkan dari rata-rata panjang
gelombang pengukuran 3 seri konsentrasi asetanilida.
Penentuan panjang gelombang pengamatan berdasarkan hasil
pengukuran panjang gelombang maksimum nikotin dan asetanilida, panjang
gelombang pengamatan yang digunakan adalah 260 nm.Pemilihan ini berdasarkan
panjang gelombang maksimum dari nikotin karena konsentrasi nikotin lebih
bervariasi dibandingkan konsentrasi asetanilida sehingga diperlukan sensitivitas
yang lebih tinggi pada pengukurna nikotin.Asetanilida pada penelitian ini
digunakan sebagai standar internal sehingga konsentrasi yang digunakan pada
pengukurannya tetap dan tidak memerlukan sensitivitas yang tinggi seperti
nikotin.
Syarat senyawa dapat dianalisis dengan spektrofotometer UV adalah
memiliki kromofor.Nikotin memiliki kromofor pada cincin piridin dan senyawa
asetanilida memiliki ikatan kromofor pada cincin benzennya.Dapat dilihat pada
gambar 12 dibawah ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Gambar 12. Kromofor pada nikotin dan asetanilida
F. Pembuatan Kurva Baku Nikotin
Pembuatan kurva baku telah dilakukan pada tahap validasi. Kurva baku
menunjukan hubungan antara AUC dengan konsentrasi nikotin pada beberapa seri
baku. Dalam penelitian ini dibuat kurva baku yang dipilih persamaan regresi linier
memberikan nilai koefisien korelasi (r) dengan kriteria r ≥0,999 (Snyder, 2010).
Diperoleh persamaan regresi linier y = 0,05147x - 0,219 dengan nilai koefisien
korelasi yaitu 0,999 sesuai dengan kriteria penerimaan. Persamaan regresi linier
ini digunakan untuk menghitung kadar ekstrak tembakau dalam rokok “MEREK
X”.
Berdasarkan grafik hubungan pada gambar 13 antara konsentrasi analit
(baku nikotin) dengan standar internal asetanilida dan AUC baku terlihat bahwa
semakin meningkatnya konsentrasi baku nikotin, semakin meningkat AUC baku.
Kromofor Kromofor
Nikotin Asetanilida
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
Gambar 13. Grafik hubungan antara konsentrasi nikotin dan asetanilida dengan AUC
G. Ekstraksi Nikotin pada Sampel Rokok “Merek X
Serbuk daun tembakau dalam rokok diekstraksi dengan metode ekstraksi
padat-cair dan cair-cair. Metode ekstraksi pada cair dilakukan pada tahap pertama
yaitu dilakukan dengan mengekstrak serbuk padat daun tembakau sampel rokok
“MEREK X” dengan larutan etanol teknis, metode ini mengacu dari jurnal
Determination of Nicotine From Tobacco by LC-MS-MS ( Vlase, Filip, Mindrutau
dan Leucuta, 2005). Tujuan pencampuran ini untuk mengesktrak nikotin dan
senyawa lain yang larut etanol pada sampel. Pada tahap awal ditambahkan
asetanilida pada campuran sampel dan larutan etanol teknis sebagai faktor
koreksi terhadap hilangnya analit selama proses ekstraksi. Campuran tersebut
selanjutnya dilakukan pemanasan dengan suhu 70-80oC agar proses ekstraksi
nikotin optimal, suhu yang digunakan dibawah suhu penguapan dari nikotin
(2470C) dan asetanilida (3040C) agar analit yang dianalisis tidak rusak dan
berkurang kadarnya selama proses ekstraksi. Lamanya pemanasan pada saat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
ekstraksi padat cair selanjutnya dilakukan optimasi untuk mencari lama waktu
yang paling optimal untuk proses ekstraksi.
Setelah proses ekstraksi padat cair, dilanjutkan proses ekstraksi cair-cair
dimana cairan ekstrak etanol yang telah diuapkan ditambahkan dengan air, larutan
KOH 0,1%, dan klorofrom, metode ini mengacu dari penelitian “Penetapan Kadar
Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan
dan NA OOGST Secara KCKT Fase Terbalik” (Dewi, 2012). Ekstraksi cair-cair
digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel atau clean-up sampel untuk
memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin
mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit (Gandjar dan Rohman,
2010). Komponen cairan dari ekstraksi ini adalah air dan kloroform, dimana
nantinya diambil bagian kloroform karena nikotin larut pada senyawa non polar.
Fungsi dari larutan KOH 0,1 % ini adalah untuk menciptakan suasana basa pada
fase non polar kloroform. Setelah dicampurkan larutan KOH 0.1% didapatkan pH
larutan sebesar 8. Pada pH ini senyawa nikotin akan diposisikan dalam bentuk
unprotonated lebih banyak jumlahnya dibanding bentuk terprotonasi, terlihat pada
gambar 14 ketika pada pH 8 bentuk dari nikotin yang terprotonasi lebih sedikit
jumlahnya dibanding yang unprotonated. Bentuk unprotonated ini berfungsi agar
sifat nikotin lebih non polar sehingga dapat terdistribusi ke dalam pelarut non
polar yaitu kloroform.
Senyawa pengotor yang bersifat polar selanjutnya akan terdistribusi ke
dalam fase polar yaitu air sehingga analit akan terpisahkan dari senyawa pengotor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
bersifat polar yang terekstraksi pada tahap awal. Gambar 14 dibawah ini
menunjukan bentuk-bentuk nikotin karena pengaruhnya dari pH.
Gambar 14. Tingkat Protonasi Nikotin berdasarkan Hubungan dengan pH
Ekstraksi cair-cair dibantu menggunakan metode sentrifugasi dimana
prinsip pemisahannya berdasarkan dari bobot molekul senyawa dengan bantuan
gravitasi dan kecepatan putaran untuk memisahakan senyawa-senyawa yang
kompleks (Moldeveanu dan David, 2002). Campuran ekstrak yang telah dicampur
dalam tabung sentrifugasi divortex terlebih dahulu selama 30 detik, ini berfungsi
agar nikotin yang terdapat pada bagian air dan kloroform dapat bercampur pada
satu fase yang dinginkan. Selanjutnya dimasukkan dalam tabung sentrifugasi dan
disentrifugasi selama 24 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Selanjutnya
persen
pH
Diprotonated Monoprotonated Unprotonated
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
dilakukan pengambilan fase kloroform untuk mendapatkan senyawa analit,
dilakukan 2 kali proses ekstraksi cair-cair ini berdasarkan hasil optimasi ekstraksi
menggunakan baku nikotin yang telah diketahui kadarnya ditambahakan dalam
proses ekstraksi tanpa matriks sampel dibandingkan dengan kadar baku nikotin
yang sama tanpa melalui proses ekstraksi, pada kromatogram gambar 15 dan
penjelasan terkait nilai AUC tabel VI menunjukan AUC dari masing-masing
nikotin dengan ekstraksi dan tanpa ekstraksi dengan kadar awal yang sama,
dengan menghitung nilai recovery dari nikotin baku yang diekstraksi
dibandingkan dengan tanpa ekstraksi didapatkan sebesar 94,74 %. Nilai ini
menunjukan bahwa ekstraksi cair-cair yang dilakukan 2 kali memiliki nilai
recovery yang baik dalam mengekstraksi nikotin dari fase polar yaitu air. Setelah
didapatkan ekstrak etanol fraksi kloroform, maka pelarut kloroform diuapkan
dengan menggunakan suhu diatas titik didih kloroform yaitu 800C karena pelarut
kloroform tidak boleh ada dalam larutan ekstrak yang akan diinjeksikan dalam
kolom KCKT. Kromatogram baku nikotin dengan ektraksi dan tanpa ektraksi
dapat dilihat pada gambar dan tabel dibawah ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
A
B
Gambar 15 = A: baku nikotin tanpa ekstraksi; B: baku nikotin 2 kali ekstraksi
Tabel VI. Hasil pengukuran AUC nikotin dengan 2 kali ekstraksi dan tanpa ekstraksi
No Keterangan AUC
1 Ekstraksi 1336182
2 Tanpa Ekstraksi 1410239
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
H. Optimasi Ekstraksi Nikotin pada Tembakau Sampel Rokok
Tujuan dari optimasi waktu ekstraksi nikotin dari serbuk daun tembakau
sampel rokok untuk mendapatkan waktu ekstraksi yang paling optimum sehingga
nikotin terekstraksi seluruhnya. Metode yang digunakan untuk penelitian ini
adalah ekstraksi padat-cair dan cair-cair karena pada ekstraksi padat-cair senyawa
nikotin akan diesktraksi dari sampel menggunakan pelarut yang sesuai dan
selanjutnya digunakan ekstraksi cair-cair untuk proses clean up senyawa-senyawa
yang bercampur dengan senyawa analit (Gandjar dan Rohman, 2010).
Variasi optimasi waktu ekstraksi pada penelitian ini adalah 10; 20; 30;
dan 40 menit dan masing-masing waktu optimasi dilakukan 3 replikasi. Optimasi
waktu 10 menit digunakan sebagai waktu optimasi terendah karena dilakukan
orientasi ekstraksi terlebih dahulu selama 5 menit diperoleh hasil yaitu cairan
etanol yang digunakan sudah berwarna coklat tua (pekat). Ekstrak kental dari
masing-masing waktu ekstraksi dikumpulkan, dilanjutkan penyiapan sampel dan
diinjeksikan ke instrument KCKT. Data hasil optimasi dapat dilihat pada
lampiran.
Berdasarkan hasil optimasi ekstraksi menunjukan peningkatan respon
AUC pada 10 menit ekstraksi ke 30 menit ekstraksi, dan terjadi penurunan respon
AUC pada 30 menit ekstraksi ke 40 menit ekstraksi, maka waktu optimum
ekstraksi dengan metode ekstraksi padat-cair dan cair-cair antara waktu 20 menit
dan 30 menit karena dilihat dari nilai AUC yang hampir sama, perlu dilakukan uji
statistik terhadap optimasi ekstraksi pada menit ke 20 dan 30. Pada waktu 10
menit ekstraksi menunjukan kadar yang masih rendah ini dikarenakan lamanya
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
pemanasan masih kurang sehingga sedikit jumlah nikotin yang terekstraksi,
sedangkan pada waktu 40 menit ekstraksi menunjukan AUC nikotin yang
menurun yang disebabkan terlalu lamanya pemanasan sehingga merusak struktur
senyawa analit nikotin yang dimana akan menurunkan jumlah nikotin pada
ekstrak yang didapat.
Uji statistik bertujuan untuk mengetahui data yang diperoleh berbeda
bermakna atau tidak. Syarat dilakukan uji t tidak berpasangan adalah data yang
didapatkan merupakan data yang terdistribusi normal, oleh karena itu dilakukan
uji normalitas terlebih dahulu. Uji normalitas data yang digunakan adalah
Shapiro-Wilk dengan nilai kemaknaan (p) > 0,05. Shapiro-Wilk digunakan karena
jumlah sampel pada penelitian ini ≤ 50 (Dahlan, 2009).
Pada tabel VII dapat disimpulkan data AUC nikotin sampel pada menit
ke 20 dan 30 terdistribusi normal karena pada tabel menunjukan nilai p value >
0,05, pada menit ke 20 p value sebesar 0,2552 dan menit ke 30 p value sebesar
0,07828.
Tabel VII. Uji Normalitas
Keterangan Shapiro-Wilk normality test
W p-value
20 min 0,8555 0,2552
30 min 0,7846 0,07828
Tahap selanjutnya untuk mengetahui nilai rata-rata AUC nikotin sampel
pada menit ke 20 dan 30 berbeda bermakna atau tidak, maka dilakukan uji t tidak
berpasangan dengan taraf kepercayaan 95%.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
Dari tabel VIII dibawah ini diperoleh hasil bahwa varians data kedua
waktu berbeda karena memilki nilai p < 0,05. Tabel menunjukan bahwa nilai dari
uji t kedua waktu tersebut p value adalah 1.908e-08 dimana nilainya lebih kecil
dari p value 0,05 maka dinyatakan berbeda bermakna.
Tabel VIII. Uji T tidak berpasangan
Selanjutnya menentukan waktu optimal dengan melihat rata-rata nilai
AUC yang paling besar dari 20 menit dan 30 menit waktu ekstraksi, pada waktu
ekstraksi 20 menit hasil rata-rata AUC adalah 1919672,33 dan pada ekstraksi 30
menit hasil rata-rata AUC adalah 1996415,67, maka dari hasil rata-rata AUC
dipilih waktu ekstraksi 30 menit sebagai waktu ekstraksi nikotin pada sampel
rokok “Merek X” yang paling optimal.
I. Ekstraksi dengan Waktu Optimum 30 menit
Berdasarkan data yang diperoleh dari optimasi waktu ekstraksi,
dilanjutkan dengan ekstraksi nikotin pada sampel rokok “Merek X” dengan waktu
optimum ekstraksi selama 30 menit untuk digunakan dalam penetapan kadar
dengan masing-masing 5 replikasi. Hasil kromatogram dan respon AUC nikotin
dan standar asetanilida dari sampel dapat dilihat kromatogram pada lampiran dan
penjelasan terkait nilau AUC nya tabel IX dibawah ini.
Keterangan Shapiro-Wilk t test
t p-value
20 min dan 30 min 62,9975 1.908e-08
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Tabel IX. Hasil pengukuran AUC nikotin dan standar asetanilida pada ekstrak tembakau rokok “MEREK X”
Keterangan AUC nikotin AUC asetanilida Perbandingan
AUC nikotin/AUC
asetanilida
Replikasi 1 1351637 578951 2,33463
Replikasi 2 1280663 546655 2,34273
Replikasi 3 1371993 584211 2,34845
Replikasi 4 1488337 617961 2,40846
Replikasi 5 1558371 651963 2,39028
J. Preparasi Ekstrak Kental Tembakau
Ekstrak kental tembakau rokok “MEREK X” yang telah diuapkan
selanjutnya dilarutkan pada metanol 30%, pemilihan metanol 30% ini untuk
mencegah perubahan solvent strength pada fase gerak. Selanjutnya larutan ekstrak
disaring menggunakan kertas whatman anorganik karena komposisi dari pelarut
yang lebih banyak adalah air. Lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator
untuk menghilangkan gelembung udara, adanya gelembung udara dapat
mengganggu proses pemisahan sampel.
K. Validasi Metode Analisis
Validasi metode merupakan suatu rangkaian proses evaluasi untuk
membuktikan bahwa metode analisis yang digunakan sudah sesuai untuk
tujuannya. Referensi yang digunakan pada penelitian ini ialah validasi metode
kategori I. Validasi metode kategori ini digunakan untuk kuantifikasi bahan aktif
yang ada pada sampel. Sampel yang digunakan merupakan rokok sehingga bahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
aktif yang ada di dalamnya ialah nikotin. Parameter-parameter validasi yang
diujikan, yaitu selektivitas, akurasi, presisi, linearitas, dan rentang.
1. Selektivitas
Selektivitas menggambarkan kemampuan suatu metode analisis untuk
dapat memisahkan senyawa analit secara tepat dan spesifik dari senyawa-senyawa
lainnya yang ada pada matriks sampel. Parameter yang digunakan untuk
selektivitas ialah nilai resolusi. Menurut Snyder, dkk (2010) suatu metode analisis
dikatakan selektif apabila memiliki resolusi ≥ 1,5. Nilai resolusi ini menunjukkan
pemisahan yang terjadi diantara puncak kromatogram. Pemisahan yang terjadi
baru dapat diterima apabila memenuhi syarat nilai resolusi yang baik.
Hasil yang diperoleh dari penentuan selektivitas adalah sebagai berikut:
Tabel X. Hasil perhitungan resolusi sampel (Demas, 2013)
Repetisi Resolusi Rata-rata resolusi
1 2,975
2,929 2 2,937
3 2,875
Tabel X di atas menunjukan bahwa rata-rata resolusi dari 3 kali repetisi ≥ 1,5
yaitu 2,929. Hal ini menunjukan bahwa metode analisis yang digunakan memiliki
selektivitas yang baik karena dapat terpisah baik dari senyawa-senyawa lain yang
ada pada matriks.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
2. Liniearitas
Linearitas menggambarkan kemampuan suatu metode analisis untuk
mendapatkan hasil maupun respon yang proposional terhadap kadar analit di
dalam sampel. Parameter yang digunakan dalam linearitas ialah koefisien korelasi
(r).
Gambar 16. Kurva baku hubungan antara konsentrasi baku nikotin dengan AUC (Demas, 2013).
Menurut Snyder, dkk (2010) suatu metode analisis dikatakan linear apabila
memenuhi persyaratan nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,999. Koefisien korelasi yang
diperoleh dari kurva baku yang dibuat ialah 0,999. Hal ini menunjukkan bahwa
metode analisis yang digunakan memiliki linearitas yang baik sehingga hasil yang
didapatkan proporsional terhadap kadar analit di dalam sampel.
3. Akurasi
Akurasi menggambarkan ketepatan suatu metode analisis, dimana hasil
yang pengukuran yang didapatkan mendekati hasil sebenarnya.Parameter yang
digunakan dalam akurasi ialah persen perolehan kembali (% recovery).Menurut
Harmita (2004) akurasi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan metode
y = 0,05147x-0,219r = 0,999
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60 80 100
AU
C n
iko
tin
/AU
C a
seta
nili
da
Konsentrasi µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
simulasi dan metode penambahan baku (standard addition method). Pada
penelitian ini, persen perolehan kembali dilakukan dengan cara metode
penambahan baku karena tidak dapat dibuat blanko sampel (sampel rokok tanpa
nikotin) yang diperlukan untuk metode simulasi. Metode penambahan baku
dilakukan dengan cara menganalisis sampel terlebih dahulu, kemudian
menambahkan sejumlah tertentu analit ke dalam sampel, dicampur, dan dianalisis
kembali (Harmita, 2004).
Pada penelitian ini, penentuan persen perolehan kembali dilakukan pada
lima tingkat penambahan adisi, yaitu penambahan baku nikotin 2,5 µg/mL,
penambahan baku nikotin 5 µg/mL, dan penambahan baku nikotin 10 µg/mL,
penambahan baku nikotin 20 µg/mL, penambahan baku nikotin 50 µg/mL. Hasil
yang didapatkan sebagai berikut :
Tabel XI. Hasil persen perolehan kembali (%recovery) baku nikotin
Konsentrasi nikotin baku yang ditambahkan (µg/mL)
Recovery (%)
n = 3 Simpangan baku
5 98,93 0,2310
10 99,51 0,8312
20 100,8 1,360
Hasil dari penelitian validasi metode akurasi didapatkan data pada
masing-masing konsentrasi nikotin yang ditambahkan yaitu 5 µg/mL, 10 µg/mL,
dan 20 µg/mL memenuhi syarat akurasi yang baik yaitu menurut Snyder, syarat
akurasi yang baik adalah memenuhi parameter recovery pada rentang 98-102%.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Pada data tabel XI dapat dilihat nilai recovery masing-masing konsentrasi
memenuhi syarat akurasi yang baik.
4. Presisi
Presisi menggambarkan keterulangan suatu metode analisis yang dilihat
dari kedekatan atau kemiripan hasil analisis apabila dilakukan secara berulang
kali.Presisi yang dilakukan pada penelitian ini adalah intraday dan interday
precision.Parameter yang digunakan dalam mengevaluasi presisi ialah koefisien
variasi (KV).Koefisien variasi merupakan hasil persentase dari standar deviasi
(SD) sehingga menunjukkan derajat variasi dari hasil pengukuran yang dilakukan.
Penentuan koefisien variasi pada penelitian ini dilakukan pada tiga tingkat kadar
sampel, yaitu 20 µg/mL, 40 µg/mL, dan 60 µg/mL. Hasil yang diperoleh sebagai
berikut pada tabel XI dan XII dibawah ini.
Tabel XII. Hasil intraday precision (Demas, 2013)
Konsentrasi sampel (µg/mL)
Konsentrasi rata-rata
n = 3
Simpangan baku Koefisien variasi
(%)
20,00 17,54 ±1,296 7,389
40,00 39,97 ±0,2987 0,7473
60,00 56,77 ±0,6740 1,187
Hasil data dari intraday precision ini menunjukan bagaimana keterulangan
metode ketika dilakukan masih menunjukan hasil yang baik dengan parameter
koefisien variasi yang memenuhi syarat dalam waktu 1 hari yang sama dan juga
subjek peneliti yang sama. Data ini merupakan hasil dari penelitian sebelumnya
oleh Ismanto dengan metode yang digunakan sama. Parameter presisi koefisien
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
variasi yang baik adalah (≤ 2%) (Snyder, 2010). Maka dilihat pada tabel XII hasil
intraday precision memenuhi syarat presisi yang baik.
Tabel XIII. Hasil interday precision
Konsentrasi sampel (µg/mL)
Konsentrasi rata-rata
n = 3
Simpangan baku Koefisien variasi
(%)
20,00 20,05 ±0,2010 0,1001
40,00 42,69 ±0,5484 1,2845
60,00 63,60 ±0,6170 0,9701
Hasil data dari interday precision ini menunjukan bagaimana
keterulangan suatu metode ketika dilakukan masih menunjukan hasil presisi yang
baik dalam waktu dan hari yang berbeda, namun laboratorium, instrument dan
subjek peneliti sama. Data pada penelitian ini dilakukan dengan hari yang berbeda
dibanding pada penelitian intraday precision, namun menggunakan metode dan
kondisi laboratorium yang sama. Pada hasil dari tabel XIII didapatkan hasil
konsentrasi rendah (20 µg/mL), tengah (40µg/mL) dan tinggi (60µg/mL) masing-
masing memiliki persen koefisien variasi yang memenuhi syarat yaitu (≤ 2%)
(Snyder, 2010).
5. Rentang
Rentang merupakan interval antara batas terendah dan tertinggi dari
konsentrasi baku yang telah memenuhi kriteria validasi metode (linearitas,
akurasi, dan presisi). Pada penelitian didapatkan rentang kadar sampel yang
memenuhi parameter linearitas, akurasi dan presisi yang baik yaitu pada 20
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
µg/mL sampai dengan 60 µg/mL Hasil rentang yang diperoleh memenuhi
parameter validasi dapat dilihat pada gambar dibawah ini:
Gambar 17. Kurva rentang konsentrasi nikotin yang memenuhi kriteria akurasi, presisi, dan liniearitas (Demas, 2013).
L. Analisis Kualititatif Nikotin
Waktu retensi atau waktu tambat yang dinyatakan dalam satuan waktu
(menit) merupakan parameter analisis kulatitatif dalam KCKT. Waktu retensi
adalah waktu yang dibutuhkan analit saat diinjek sampai keluar dari kolom dan
terdeteksi oleh detektor (Mulja dan Suharman, 1995).
y = 0,05417x-0,219r = 0,999
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60 80 100 120
AU
C N
iko
tin
/AU
C A
seta
nili
da
Konsentrasi Nikotin (µg/mL)
= rentang (20-60 µg/mL)
keterangan :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Waktu retensi (tR) suatu analit sangat dipengaruhi oleh interaksi analit
dengan fase diam dan fase gerak, jika waktu retensi analit semakin singkat maka
interaksi analit lebih besar dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam
pada KCKT fase terbalik. Dalam penelitian ini fase diam yang digunakan adalah
oktil silika (C8) yang bersifat non polar dan fase gerak yang digunakan metanol :
ammonium asetat + TEA 0,1% (70 : 30 ) bersifat lebih polar dibandingkan fase
diam. Dari sistem KCKT fase terbalik, senyawa polar akan terelusi terlebih
dahulu daripada senyawa non polar sehingga waktu retensinya lebih singkat.
Dilihat dari strukturnya senyawa nikotin pada gambar 18 yang ditunjukan
dibawah ini, nikotin memiliki bagian polar dan non polar.
Gambar 18. Struktur nikotin dengan bagian polar dan non polar
Nikotin memiliki kepolaran pada bagian atom N yang terdapat pada
cincin piridin dan pirolidin, dimana dapat membentuk interaksi hidrogen dan
ionik dengan fase gerak. Interaksi hidrogen terjadi pada atom nitrogen cincin
piridin, sedangkan interaksi ionik terjadi pada atom nitrogen cincin pirolidin yang
terprotonasi karena suasana asam dari fase gerak.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
Hasil analisis kualitatif pada gambar 18 diperoleh kromatogram baku
nikotin dengan tR yaitu 4,599 dan hasil penetapan kadar diperoleh kromatogram
sampel dengan tR nikotin yaitu 4,616, maka dapat dipastikan adanya nikotin
dalam sampel serbuk daun tembakau rokok “Merek X”. Menurut Snyder, kondisi
kromatografi seperti keceptan alir, temperature, komposisi fase gerak dan tekanan
yang stabil menghasilkan tR yang stabil pula. Variasi waktu retensi yang
diperbolehkan <0,02-0,05 menit, pada hasil tR nikotin variasi waktu retensi adalah
0,017 menit.
A
B
Gambar 19. A: Kromatogram sampel rokok “Merek X”; B: Kromatogram baku nikotin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
M. Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Tembakau Rokok “MEREK X”
Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau pada rokok “MEREK
X”, dihitung berdasarkan persamaan kurva baku yang diperoleh dari validasi.
Presisi yang dinyatakan dengan nilai koefisien variasi (CV) merupakan parameter
dalam mengukur suatu metode untuk mendapatkan hasil yang reprodusibel.
Perhitungan kadar nikotin dari sampel pada tabel di bawah berikut:
Tabel XIV. Hasil Perhitungan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau rokok “MEREK X”
Jenis esktrak Replikasi Kadar %b/b Keterangan
Ekstrak tembakau
rokok “Merek X”
1 0.56712 Rata-rata= 0.57385
SD= ± 0.007224
CV= 1.2588 %
2 0.56891
3 0.57019
4 0.58354
5 0.57949
Data penetapan kadar diperoleh rata-rata kadar nikotin dalam ekstrak
tembakau rokok “MEREK X” adalah 0.57385 ± 0.007224 %b/b dengan nilai CV
= 1,2588%.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Penetapan kadar nikotin dalam ektrak tembakau rokok “MEREK X”
menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam oktil silika (C8)
dan fase gerak metanol:ammonium asetat 10 mM + TEA 0,1% (70:30) pada
kecepatan alir 1,0 mL/menit telah memenuhi parameter validasi yang meliputi
selektivitas (Rs = 2,929), linearitas (r = 0,9999), presisi interday dengan nilai
koefisien variasi sebesar 7,389%, 0,7473%, dan 1,187%, presisi intraday
dengan nilai koefisien variasi sebesar 0,1001%, 1,2845%, dan 0,9701%,
akurasi dengan % recovery sebesar 98,93%, 99,51, dan 100,8% untuk kadar
sampel 20, 40, dan 60 µg/mL, dan rentang yang diperoleh adalah 20-60
µg/mL.
2. Hasil penetapan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau rokok “MEREK X”
diperoleh kadar nikotin sebesar 0.57385 ± 0.007224 %b/b.
B. Saran
Masih perlu dilakukan penelitian penetapan kadar nikotin dalam ekstrak
tembakau rokok untuk pengembangan metode ekstraksi dan metode pengukuran
nikotin yang lebih baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
Daftar Pustaka
Alali, F., dan Massadeh, A., 2003, Determination od Nicotine and General
Toxicity of Jordan’s Market Cigarettes, Acta Chim Slov, 50, 251-258.
Antonius, E., 2013, Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Rokok “Merek X” Menggunakan Standar Internal Asetanilida, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Bao,Z., He,. X.Y., Ding., X., Prabhu, S., Hong, J.Y., 2005, Drug Metabolism and
Disposition, Metabolism of Nicotine and Cotinine By Human Cytochrome P450 2A13, Vol.33, No.2, The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, America, pp. 258-261.
Basset, J., 1994, Vogel’s Textbook of Quantititative Inorganic Elementary
Instrumental Analysis, Longman Group UK, London, p. 142. Bliesner, D.M., 2006, Validating Chromatographic Methods : A Practical Guide,
John Wiley & Sons. Inc, New York, p. 10. Boyd, R.K., 2008, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrophotometry,
British Library, London, pp. 436-438.
Cahyono, B., 1998, Tembakau Budi Daya dan Analisis Usaha Tani, Kanisius, Yogyakarta, pp.17,19.
Clarke, E.G.C., 1969, Isolation and Identification of Drugs, The Pharmaceutical
Press, London, pp.440-441.
Clarke, dkk., 2003, Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, The Pharmaceutical Press, London, pp. 103, 84.
Cordell, Geoffrey, A., 1981, Introduction to Alkaloids, John Willey & Sons., Inc., Canada, p. 85.
Dewi, D.C., 2012, Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau VORSTENLANDEN Bawah Naungan dan NA OOGST Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogjakarta.
Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26.
Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia Jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 7, 1134.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 2000, Parameter Stander Umum Ekstrak Tumbuhan Obat cetakan I, Departemen KesehatanRepublik Indonesia, Jakarta, pp. 1, 10-11.
Ermer, J., dan Miller, J. H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical
Analysis, John Wiley & Sons. Inc, New York, pp.21, 52, 63, 80. Fessenden dan Fessenden, 1986, Kimia Organik Jilid 1, Erlangga, Jakarta, pp. 54-
56. Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogjakarta, pp. 339, 344, 345, 346, dan 383.
Geiss, O., Kotzias, D., 2007, Tobacco, Cigarettes and Cigarette Smoke, Institute
for Health and Consumer Protection, Italy, pp. 54-60, 48-49. Gorrod,J., Jacob, P., 1999, AnalyticalDetermination of Nicotine and Related
Compounds and Their Metabolites, in Crooks, P.A., Chemical Properties of Nicotine and Other Tobacco Related Compounds, Elsevier, Italy, pp.81-85.
Gonzalez, A.G., dan Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to Analytical
Method Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends in Analytical Chemistry,Vol. 26, No.3, 232-234.
Hanum, C., 2008, Teknik Budidaya Tanaman jilid 3, Teknik Budidaya Tembakau
bab X, Direktorat Jenderal Manajemen Pendidikan Dasar dan MenegahDepartemen Pendidikan Nasional, Jakarta, pp.425, 431-435.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,
Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, 117-135. Ismanto, D., 2013, validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) fase
terbalik pada penetapan kadar nikotin dalam rokok “merek x”, skripsi, Sanata Dharma, Yogjakarta.
Kazakevich, Y., dan LoBrutto R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 15, 192.
Ma’arif, A.S., 2012, Bahaya Rokok Terhadap Kesehatan, Rumah Sakit
ParuDr.H.A.Rotinsulu Bandung, http://www.rotinsuluhospital.org/, diakses tanggal 17 April 2012
Meyer, V., 2004, Practical High Performance Liquid Chromatography, John
Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 52,106.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
Moldeveanu, S.C. dan David, V., 2002, Sample preparation in chromatography, British Library, London, pp. 42, 52.
Mulja, H.M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University
Press, Surabaya, p. 102. Nakajima, M., Yamamoto, T., Kuroiwa, Y., and Yokoi, T., 2000, Improved
Highly Sensitive Methode for Determination of Nicotine and Cotinine in Huma Plasma by High Performance Liquid Chromatography, Journal of Chromatography B, 742 (2000), 211-215.
Peraturan Pemerintah Republik Indonesia, 2012, Pengamanan Bahan yang Mengandung Zat Adiktif Berupa Produk Tembakau Bagi Kesehatan No 109 Tahun 2012, DepKes RI, Jakarta, pp.11-16.
Sastrohamidjodjo, H., 2001, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta, pp. 20-26. Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry, Sixth edition,
Saunders College Publishing, USA, p. 386. Snyder, R.L., Kirkland, J.J., 2010, Introduction to Modern Liquid
Chromatography,John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 92, 254, 327, 361,399, 517.
Stratton, K., 2001, Clearing The Smoke : Assessing The Science Base ForTobacco
Harm Reduction, National Academy of Sciences, United States of America, p.27.
Syenina, A., 2011, Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Undang-undang Republik Indonesia, 1999, Perlindungan Konsumen No 8 Tahun
1999, DPR RI, Jakarta, pp. 4-5. Vlase, L., Filip, L., Mindrutau, I., Leucuta, S., 2005, Determination of Nicotine
from Tobacco by LC-MS-MS, Studia Universitatis Babes Bolyai Physica, 4b.
WHO (World Health Organisation), 2011.WHO Report on the Global Tobacco
Epidemic,2011,http://www.who.int/tobacco/global_report/2011/en/index.html, diakses 27 februari, 2012.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Lampiran
Lampiran 1: Sertifikat analisis asetanilida
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Lampiran 2: Sertifikat analisis nikotin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Lampiran 3: Kromatogram optimasi lama pemanasan 10 menit replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Lampiran 4: Kromatogram optimasi pemanasan 10 menit replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Lampiran 5: Kromatogram optimasi pemanasan 10 menit replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
Lampiran 6: Kromatogram optimasi lama pemanasan 20 menit replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
Lampiran 7: Kromatogram optimasi lama pemanasan 20 menit replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
Lampiran 8 : Kromatogram lama pemanasan 20 menit replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
Lampiran 9: Kromatogram optimasi lama pemanasan 30 menit replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
Lampiran 10: Kromatogram optimasi lama pemanasan 30 menit replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Lampiran 11: Kromatogram optimasi lama pemanasan 30 menit replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Lampiran 12: Kromatogram optimasi lama pemanasan 40 menit replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Lampiran 13: Kromatogram optimasi lama pemanasan 40 menit replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
Lampiran 14: Kromatogram optimasi lama pemanasan 40 menit replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Lampiran 15: Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Lampiran 16: Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
Lampiran 17: Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
Lampiran 18: Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Lampiran 19: Kromatogram penetapan kadar nikotin replikasi 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar Nikotin Dalam Rokok “MEREK X” Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik Menggunakan Standar Internal Asetanilida” memiliki nama lengkap Is Sumitro. Penulis lahir di Pontianak pada tanggal 3 Agustus 1991 sebagai putra tunggal dari pasangan Mintju dan Effendi. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Bunda Mulia (1996-1997), SD Yos Soedarso (1997-2003), SMP Negeri 1 Nanga Pinoh (2003-2006), SMA Santo Paulus Pontianak (2006-2009) dan pada tahun 2009 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama
kuliah penulis mengikuti kegiatan dan organisasi antara lain : panitia donor darah, insadha, PPnEC, olimpiade kimia tingkat PTS kopertis, dan asisten praktikum kimia dasar, kimia organik, spektroskopi, kimia analisis serta validasi metode.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI