Pembuatan Peta Restriksi DNA Plasmid I. Tujuan PraktikumMahasiswa dapat menentukan peta restriksi DNA plasmid.II. 4.I3.I2.I1.I2.II1.II4.II3.IIMHasil

8.II8.I7.II6.II6.I5.I5.II7.IM

Gambar 1. (a) Hasil visualisasi fragmen DNA plasmid oleh enzim retsriksi pada gel agarosa 0,8%, volume 10 l per well. 1.I=EcoRI; 1.II=EcoRI+SacI; 2.I=BamHI; 2.II=BamHI+EcoRI; 3.I=SacI; 3.II=SacI+BamHI; 4.I=ddH2O; 4.II= EcoRI+SacI; 5.I= EcoRI; 5.II= EcoRI+BamHI; 6.I= BamHI; 6.II=BamHI+SacI; 7.I=SacI; 7.II=SacI+EcoRI; 8.I=ddH2O; 8.II=EcoRI+BamHI. (b) Marker DNA yang digunakan HL 1 kb plus.(a) (b)

Tabel 1. Jarak migrasi marker (cm) dengan log ukuran DNA (bp).Marker (cm)Marker (bp)Log Marker (bp)

1,54120074.07943451

1,72100004

1,9080003.90308999

2,1060003.77815125

2,2550003.69897

2,4540003.60205999

2,7030003.47712125

2,8425003.39794001

3,0420003.30103

3,2815003.17609126

3,631000Gambar 2. Kurva regresi ukuran DNA terhadap jarak migrasi dengan y= 0,539x+4,927 dan R2 = 0,995.3

3,967002.84509804

4,175002.69897

4,502502.39794001

Tabel 2. Perlakuan plasmid, jarak migrasi pita dan ukuran pita kelompok tiga (3).

pEGAD 12594bpPerlakuanJarak migrasi (cm)Ukuran fragmen (bp)

SacI (3I)1,42

1.60

SacI+BamHI(3II)1,54

1,68

III. PembahasanPada percobaan kali ini bertujuan agar praktikan dapat menentukan peta retriksi dari DNA plasmid. Peta restriksi adalah gambaran struktural informasi DNA yang diperoleh melalui proses pemotongan DNA tersebut dengan menggunakan enzim restriksi. Pembuatan peta restriksi didasarkan pada besarnya potongan yang terbentuk yang diidentifikasi dari hasil elektroforesis. Peta Restriksi yang dilakukan pada percobaan menggunakan plasmid EGAD berukuran 12594bp yang dipotong dengan enzim restriksi EcoRI, SacI, BamHI dan gabungan antara dua enzim restriksi tersebut. Jarak pergerakan fragmen DNA berbanding terbalik dengan logaritma besarnya fragmen tersebut. Hasil regresi dari data jarak migrasi fragmen DNA pada marker DNA molecular Weight Markers HL 1 kb plus dan logaritma besarnya fragmen DNA menghasilkan persamaan y= 0,539x+4,927 dengan nilai R2 sebesar 0,995.Saat dilakukan pemotongan dengan enzim SacI, diperoleh dua band (....dan.... bp) yang mengindikasikan plasmid ini memiliki dua situs restriksi SacI. Ketika dilakukan double digestion, antara SacI dan BamHI diperoleh dua band (.... dan... bp).Jika dilihat dari total ukuran DNA plasmid, setiap well memiliki total ukuran yang berbeda. Hal ini disebabkan pergerakan DNA pada saat elektroforesis dipengaruhi oleh banyak hal, bukan hanya ukuran fragmen DNA itu saja.Oleh karena itu umumnya molecular weight marker digunakan hanya untuk memperkirakan besar fragmen saja, bukan untuk menghitung ukuran secara presisi seperti yang praktikan lakukan di atas.

IV. Kesimpulan Untuk pembuatan peta restriksi dapat digunakan suatu metode di mana pemotongan dilakukan dengan enzim secara individu dan secara campuran. Dengan demikian kita akan mendapatkan band-band hasil pemotongan enzim secara individu dan data pemotongan dari campuran enzim. Potongan-potongan band tersebut yang nantinya akan disusun menjadi peta restriksi.

V. Daftar PustakaKarp, Gerald. (2010). Cell And Molecular Biology: Concepts and Experiments sixth edition. RR Donnelley.Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold spring Harbor Laboratory Press. USA.Teare JM et al. 1997. Measurement of nucleic acid concentrations using the DNA quant and the genequant. Bio Techniques 22:1170-1174.