PERBAIKAN TANAMAN MELALUI KULTUR IN VITRO

Oleh

ENDANG GATI LESTARI, MSi

BALITBIOGEN

BOGOR

Bioteknologi merupakan sarana untuk mendukung program perbaikan genetic

tanaman terutama dalam pemecahan masalah yang tidak bisa atau sulit dilakukan secara

konvensional. Untuk mendukung keberhasilan pertanian saat ini penggunaan varietas

unggul merupakan kebutuhan utama, Mengingat saat ini lahan potensial sangat terbatas

sehingga ekstensifikasi diarahkan untuk lahan-lahan marginal contohnya: lahan masam,

lahan dengan kadar Al dan Mn tinggi, tanah dengan kadar garam tinggi, lahan kering

dan lahan dengan naungan

Keterbatasan varietas unggul yang mempunyai sifat seperti produksi tinggi, serta

tahan terhadap lingkungan abiotik (lahan masam, lahan kering) dan cekaman abiotic

( penyakit tertentu) merupakan masalah utama saat ini yang harus diperhatikan.

Pemuliaan tanaman secara konvensional pada tanaman buah atau tanaman

perkebunan berkayu pada umumnya mengalami kendala, terutama untuk meningkatkan

keragaman genetic karena system reproduksinya (apomiksis, partenokarpie,

polyembrioni) dan ketiadaan sifat yang diinginkan, disamping itu adanya kesulitan

dalam seleksi karena panjangnya masa juvenil tanaman (Witjaksono, 2003).

Perbaikan tanaman melalui kultur in vitro telah dilakukan sejak lama dan telah

menghasilakan varietas baru dengan sifat uggul seperti warna, aroma dan bentuk yang

lebih baik atau sifat ketahanannya terhadap penyakit atau terhadap cekaman abiotik

lebih maningkat.

Keuntungan perbaikan tanaman melalui kultur in vitro antara lain:

1. Kemungkinan melakukan seleksi pada tingkat sel (kultur sel, kultur protoplasma)

2. Mempercepat didapatnya tanaman homosigot (kultur anter)

1

3. Kemungkinan melakukan hibridissi jarak jauh dan tanaman yang secara seksual

inkompatibel (fusi protoplasma)

4. Kemungkinan menambahkan atau memodifikasikan gen khusus ( transforasi

gen)

5. Kemungkinan memperbaiki sifat dari tanaman yang steril atau sukar

menghasilkan bunga (kultur sel, kultur protoplasma) (Wattimena, l992)

Kendala dalam pelaksanaannya antara lain memerlukan ketelitian serta memerlukan

seleksi/uji coba berulang.

Beberapa metoda yang dapat digunakan adalah: Embrio rescue, kultur anter, fusi

protoplas, keragaman somaklonal, seleksi in vitro dan transformasi gen.

PENYELAMATAN EMBRIO (EMBRIO RESCUE)

Persilangan F1 yang gugur embrionya dan tidak terbentuk biji yang disebabkan

oleh sifat inkompatibilitas seksual yang terjadi pada silangan yang berkerabat jauh

contohnya persilangan antara

Vanilla planifolia x Vanilla alba ( sp budidaya & dan liar)

Oryza sativa x kerabat liar

Arachys hipogea x A. glabrata

Embrio dapat diselamatkan dengan mengkulturkan embrio tersebut pada media aseptic,

media ini yang menggantikan fungsi endosperm, yang perlu diperhatikan untuk

keberhasilan embrio rescue adalah: mendapatkan embrio yang utuh dan komposisi

media yang tepat.

Tujuan dari persilangan jarak jauh adalah untuk:

Mendapatkan tanaman yang resisten terhadap penyakti, hama dan kekeringan,

suhu tinggi, suhu rendah, toleransi terhadap garam atau Al tinggi dan tertua donor yang

berasal dari tetua liar.

2

KULTUR ANTER

Tujuan kultur anter adalah untuk mendapatkan tanaman haploid (tanaman yang

mempunyai jumlah kromosom yang sama (N), yang unggul yang dapat dipergunakan

untuk menghasilkan kultivar baru atau hibrida F1.

Keuntungan dan kegunaan dari tanaman haploid adalah sebagai berikut;

1. Semua sifat dapat ditampilkan pada keadaan monohaploid baik sifat dominan

maupun resesif.

2. Seleksi pada tingkat haploid (mono dan dihaploid) jauh lebih mudah

dibandingkan pada tingkat ploidi yang lebih tinggi

3. Penggandaan dari tanaman monohaploid akan menghasilkan tanaman dihaploid

yang homozygot. Penggandaan berikutnya akan menghasilkan tanaman

tetraploid yang homozygot.

4. Hibridisasi seksual antara tetraploid dan diploid akan menghasilkan tanaman

triploid, demikian pula dengan hibridisasi somatic antara monohapolid dan

diploid.

FUSI PROTOPLAST

Fusi protoplasma merupakan suatu proses alamiah yang terdapat dari mulai

tanaman tingkat rendah sampai pada tanaman tingkat tinggi. Hibridisasi somatik melalui

fusi protoplas digunakan untuk menggabungkan sifat lain dua spesies atau genus yang

tidak dapat digabungkan secara seksual ataupun aseksual. Pada tanaman jeruk, potensi

hibridisasi ini dapat dikembangkan karena sistem regenerasinya telah mantap (Groser

dan Gmitter, l990).

Pada tanaman jeruk, hibridisasi somatic telah dilakukan secara rutin untuk

menggabungkan varietas, spesies dan genus jeruk dengan tujuan untuk pemuliaan batang

bawah, batang atas maupun perakitan varietas tanpa biji (triploid) (Groser dan Gmitter,

l990).

Pada tanaman terong hibridisasi somatic telah berhasil didapatkan tanaman yang

resisten terhadap penyakit layu bakteri , pada penelitian tersebut berhasil difusikan S

melongena dengan S aethiopicum (tanaman budidaya dan liar) dan didapatkan tanaman

hybrid yang membawa sifat ketahanan dari S aethiopicum (Mariska et al, 2001).

3

Tujuan fusi protoplas adalah untuk mendapatkan suatu hibrida somatic atau

sibrida atau mengatasi kelemahan dari hibrida seksual. Terdapat dua kelemahan dari

hibrida seksual yaitu;

1. Sukar untuk mendapatkan suatu hibrida antar spesies dan antar genera.

Hibridisasi somatic dapat mengatasi hal tersebut.

2. Sitoplasma pada perkawinan seksual hanya berasal dari tetua betina saja.

Dalam proses pembuahan, gamet jantan hanya membawa inti saja dengan sedikit

sitoplasma sebaliknya pada tetua betina selain inti juga sitoplasma. Untuk mendapat

sitoplasma dari kedua tetua diadakan fusi antara sitoplasma dengan protoplasma.

KERAGAMAN SOMAKLONAL

Perbaikan tanaman melalui keragaman somaklonal terdiri dari kultur protoplas,

kultur sel, kultur kalus dan regenerasi langsung. Salah satu factor yang penting untuk

mencapai keberhasilan dalam pemuliaan tanaman secara bioteknologi adalah

dikuasainya system regenerasi.

Peningkatan keragaman somaklonal diperlukan untuk mendapatkan varietas

unggul pada tanaman yang tidak mempunyai cukup banyak gen untuk sifat-sifat

penting seperti ketahanan terhadap hama dan penyakit, toleransi kekeringan dan salinitas

(Brar, l991). Keragaman genetik yang tinggi merupakan salah satu faktor yang

menentukan dalam keberhasilan pada program pemuliaan.

Pemuliaan tanaman dengan induksi mutasi yang bertujuan untuk perbaikan

tanaman telah lama dilakukan dan banyak digunakan untuk menciptakan varietas

unggul dengan penampakan yang baru baik bentuk atau warna yang lebih menarik.

Keragaman somaklonal adalah keragaman genetik dari tanaman yang dihasilkan

melalui kultur jaringan atau sel (Ahlowalia, l986). Keragaman somaklonal disebabkan

oleh beberapa hal antara lain: (1) penggandaan jumlah kromosom, (2) perubahan

struktur kromosom, (3) pindah silang somatik atau perubahan sister kromatid, (4)

amplifikasi dan delesi gen, (5) partikel loncat, dan (6) perubahan kariotip

4

Mutasi atau perubahan karakter yang diwariskan dapat terbentuk pada fase sel

maupun kalus pada tahap kultur in vitro atau pada eksplan karena adanya sel-sel

bermutan pada jaringan tertentu.

Kultur in vitro merupakan salah satu teknik yang dapat dilakukan untuk

meningkatkan keragaman gentik tanaman, antara lain dengan keragaman somaklonal

(Pedrieri, 2001). Menurut Ahlowalia (1986), perubahan genetik dapat terjadi selama

periode kultur in vitro atau karena adanya sel-sel yang mengalami mutasi.

Pada tanaman nilam, dengan radiasi kalus dapat meningkatkan variabilitas

genetik karakter morfologi dan kandungan minyak Mariska et al., (1997). Di China

dan Korea kombinasi kultur in vitro dengan mutagen fisik merupakan salah satu

program yang diprioritaskan untuk dikembangkan (Yunchang and Liang, l997 dan Yi

and Li, l997), perlakuan kombinasi antara kultur in vitro dan mutagen fisik lebih efektif

dan lebih efisien dibandingkan perlakuan tunggal.

Demikian pula pada panili, radiasi kecambah struktur globular dan torpil serta

dapat menghasilkan somaklon dan beberapa nomor menunjukkan lebih tahan terhadap

penyakit (Mariska dan Hobir, l998), somaklon hasil radiasi menampakkan keragaman

yang tinggi (Mariska et al, l998). Pada kedelai varietas Wilis, radiasi 400 rad dapat

meningkatkan jumlah benih somatik pada setiap tingkat konsentrasi Al. disamping itu

kapasitas regenerasinya lebih tinggi dibandingkan Sindoro dan Slamet (Mariska et al,

2000). Nagatomi (l996) mendapatkan tanaman yang tahan terhadap penyakit Puccinia

melano pada tanaman tebu dari hasil mutasi dengan kultur in vitro kombinasi dengan

radiasi.

Seleksi in vitro

Mutasi secara alami terjadinya sangat lambat, mutasi spontan pada sel somatik

hanya berkisar 0,2 - 3%, sehingga induksi mutasi buatan merupakan cara yang cepat

untuk meningkatkan variabilitas pada spesies (Malusynski et al, l995). Keragaman

tersebut dapat ditingkatkan dengan pemberian mutagen baik fisik maupun kimiawi.

Induksi mutasi di dalam kultur in vitro merupakan metode yang paling efektif terutama

pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif, untuk tujuan perbaikan tanaman

(Novak, l991 dalam Malusynski et al, l995).

5

Seleksi in vitro merupakan salah satu metoda dari variasi somaklonal, cara

tersebut lebih efektif dan efisien karena perubahan lebih terarah kepada penyaringan

sifat yang diinginkan. Pada berbagai tanaman, seleksi in vitro telah terbukti dapat

menghasilkan varietas baru yang tahan penyakit dan sifat tersebut diwariskan pada

keturunannya (Van den Bulk, l991).

Seleksi in vitro terhadap sel-sel yang memperlihatkan toleransi yang meningkat

terhadap cekaman air telah dilaporkan pada tanaman Vigna radiata L. Capsicum annum

dan Brassica juncea. Seleksi in vitro untuk ketahanan kekeringan telah dilakukan pada

tembakau (Nicotiana tabacum), tomat (Lycopersicon esculentum. Mull), Citrus spp dan

Chery (Tschaplinski et al, l995).

Manfaat menggunakan kultur in vitro antara lain: (1) dapat diperoleh populasi

yang seragam, (2) pengaruh lingkungan dapat dibatasi, begitu pula musim. (3)

memungkinkan adanya respon dari sel yang terpisah dari tanaman utuh. Sedangkan

kekurangannya antara lain: (1) respon tertentu hanya akan didapatkan pada kalus yang

dapat diregenerasikan (2) respon ketahanan dapat diperoleh apabila laju

diferensiasinya tinggi.

Selain berperan dalam meningkatkan ketahanan terhadap faktor abiotik, seleksi

in vitro juga dapat dilakukan untuk meningkatkan ketahanan terhadap faktor biotik,

antara lain pada tanaman padi untuk ketahanan terhadap Xanthomonas oryzae dan

Helminthosporium oryzae serta pada tanaman terong untuk ketahanan terhadap

Verticillium dahliae

Beberapa variasi sifat yang dihasilkan antara lain: tanaman memendek, masak

lebih awal, tahan terhadap penyakit. Beberapa varietas baru hasil mutasi antara lain pada

pisang (Mak et al, l996) apokat (Berg and Lahav, l996).

Untuk mendapatkan sifat ketahanan terhadap penyakti layu Fusarium umumnya

seleksi dilakukan terhadap massa sel, jaringan atau tunas yang telah diberi perlakuan

keragaman somaklonal dan dikulturkan pada media yang mengandung komponen

seleksi seperti toksin murni asam fusarat atau filtrat dari Fusarium. Melalui metode

tersebut telah dihasilkan tanaman yang tahan terhadap penyakit layu Fusarium antara

lain pada Carnation (Arai dan Takeuchi, l993), gandum (Fadel dan Wenzel, l993,

6

Ahmed et al, l996), pisang (Morpurgo et al, l994 dan Matsumoto et al, l995), panili

(Mariska et al, 2000) dan Abaka (Damayanti, 2002), Disamping itu dari beberapa hasil

penelitian tersebut diatas menunjukkan bahwa sifat ketahanan dapat diwariskan pada

turunannya

Sebagai komponen seleksi untuk cekaman terhadap kekerigan dapat digunanakan

Polyethilene Glycol atau manitol. Dan untuk cekaman terhadap kemasaman dapat

digunakan Al dan pH rendah. Seleksi tanaman terhadap kekeringan telah dilakukan

pada tanaman tembakau, tomat dan Chery (Tchaplinski et al, l995) serta pada kedelai

(Widoretno, 2002).

TRANSFORMASI GENETIK

Transformasi genetik dilakukan untuk mengintegrasikan gene dalam bentuk

molekul DNA ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan tanaman baru yang mampu

mengekspresikan gen tersebut.

Transformasi dilakukan apabila gen yang diperlukan tidak terdapat pada suatu

spesies tanaman tertentu dan memungkinkan untuk dapat diperoleh dari organisme lain

seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain dan dipindahkan ke tanaman. Contoh

gen yang dapat dimanfaatkan untuk perbaikan tanaman melalui rekayasa genetic adalah

gen ketahanan terhadap cekaman lingkungan biotic maupun abiotik dan gen untuk

memodifikasi kualitas dari suatu produk tanaman. Namun saat ini penelitian

transformasi adalah untuk memproduksi tanaman yang tahan terhadap serangga.

Keberhasilan transformasi genetik tergantung dari kemampuan meregenerasikan

tanaman, dan optimasi sistem transformasinya (melalui Agrobacterium tumofaciens

atau penembakan partikel) dan pengemasan sediaan gene.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, K.Z., A. Mesterhazy, A . Bartok and F. Sagi . l996. In vitro techniques for selecting wheat (Triticum aestivum L.) for Fusarium- resistance. II. Culture filtrat technique and inheritance of Fusarium- resistance in somaclones. Euphytica 91: 341-349.

7

Ahlowalia, B.S. 1986. Limitations to the use of Somaclonal Variation in Crop Improvement. P. 14-27. In. J. Serial (Ed.). Somaclonal variation and crop improvement. Martinus Nijhoff Publisher. USA.

Arai, M., M. Takeuchi. l993. Influence of Fusarium wilt toxin (s) on carnation cells. Plant Cell Tiss.and Org. Cult. 34: 287-293.

Brar, D. S. 1991. Wide Hybridization for Rice Improvement In IRRI. Male Hybridization: wide Hybridization and related Breeding. Second Rice Biotechnology Training Course 15 Oct- 27 Nov. Philippines.

Berg B.O and E. Lahav. Avocados. In: Janick J and MooreJ.N ( Eds.)Fruit breeding. Vol Tree and Tropical Fruits. John Wiley and Sons, Inc. New York. Pp. 113 –166.

Damayanti, F. 2002. Seleksi in vitro untuk ketahanan terhadap penyakit layu fusarium pada tanaman abaka (Musa textilis Nee.). Tesis Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. 47 hal.

Daud, M.E. 1986. Tissue culture and the selection of resistant to pathogens. Annual review of phytopathology. 24:159-186.

Fadel, F., G. Wenzel . l993. In vitro selection for tolerance to Fusarium in F1 microspore population of wheat. Plant Breeding 110: 89-95

Karp.A. 1995. Somaklonal variation as a tool for crop improvement. Eupytica 85: 295-302.

Mariska, I., M. Tombe dan D. Sukmadjaja. l998. Peningkatan keragaman genetic tanaman panili hubungannya dengan ketahanan penyakit busuk batang panili. Proc Seminar on Integrated Control on Main Disease of Industrial Crop. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat.

Mariska, I dan Hobir. l998. Peningkatan keragaman genetik tanaman melalui metode “in vitro”. Jurnal Penelitian dan Pengembangan Pertanian XVII(4) 115-121.

Mariska, I. M. Tombe, M. Kosmiatin, Hobir dan A.Husni. 2000. Seleksi silang Tunas Panili secara in vitro dan Pengujiannya terhadap F. oxysporum. Laporan Hasil Penelitian BALITBIO

Mariska, I. Hobir, K. Mulya, A. Husni, S. Rahayu. R. Purnamaningsih, M Kosmiatin dan D. Sihachakr. 2001. Improvement of bacterial wilt resistance of eggplant through protoplast fusion. Jurnal Litbang pertanian 20(1)

Maluszynski, M., B.S. Ahloowalia and B. Sigurbjornsson. 1995. Application of in vivo and in vitro mutation techniques for crop improvement. Euphytica 85: 303-315.

8

Mak, C., Hi, YW, Tan, Y. Py Risli, l996. Navaria: A new banana mutant induced by gamma irradiation. InfoMusa 5(1): 35-36.

Matsumoto K, M.L. Barbosa and L.A.C. Souza. l995. Race 1 fusarium wilt tolerance on banana plants selected by fusaric acid. Euphytica 84: 67-71

Morpurgo R, Lopato S.V., R. Afza, F.J. Novak. l994. Selection parameters for resistance to Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4 on diploid banana (Musa acuminata Colla). Euphytica 75:121-120.

Nagatomi.S. l996. A new approach of radiation breeding toward improvement of desease resistance in crops. Makalah utama dalam Seminar Pengendalian penyakit Utama Tanaman Industri Secara Terpadu. JICA-BALITRO. 13-14 Maret. Bogor.

Pedrieri. S. 2001. Mutation induction and tissue culture in improving fruits. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 64: 185-210.

Tschaplinski, T.J., G M, Gebre, J.E. Dahl, G. T. Roberts and G.A. Tuskan. 1995. Growth and Solute adjustment of calli of Poppulus clones cultures on nutrient medium containing polyethylene glycol. Can. J. Res. Environmental 25: 1425 –1433.

Van den Bulk, R.W. 1991. Application of cell and tissue culture and in vitro selection for disease resistance breeding-a review. Euphytica 56:269-285.

Wattimena. G.A. l992. Bioteknologi I Tanaman. PAU IPB. 309 hal.

Widoretno, W. 2002. Seleksi in vitro untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan pada kedelai (Glycine max (L) Merr) dan karakterisasi varian somaklonal yang toleran. Disertasi Program Pascasarjana. IPB. 118 hal.

Witjaksono, 2003. Peran bioteknologi dalam pemuliaan tanaman buah tropika. Makalah dalam Seminar Nasional Peran Bioteknologi dalam Pengembangan Buah Tropika. Kementerian Riset dan Teknologi RI dan Pusat kajian Buah buahan Tropika LP IPB. 9 Mei Bogor.

Yi and Le. 1997. Development of genetic resources by in vitro application of radiation. Proc. Seminar on Mutation Breeding in Oil and Industrial Crops for Regional Nuclear cooperation in Asia. RDA, STA, Most and JAIF. 12 – 18 Oct. Suwon, Korea.

9

Yunchang, Li and Q. Liang. 1997. A review and prospect on mutation breeding of oil crops in China. Proc. Seminar on Mutation Breeding in Oil and Industrial Crops for Regional Nuclear Cooperation in Asia. RDA, STA, Most and JAIF. 12 – 18 Oct. Suwon, Korea.

10