KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM … · KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED...

KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM SEL LEYDIG TIKUS DAN PERANANNYA TERHADAP

DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL SUMSUM TULANG

EKAYANTI MULYAWATI KAIIN

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Kajian In Vitro

Kultur Sel dan Conditioned Medium Sel Leydig Tikus dan Peranannya Terhadap Diferensiasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Pebruari 2014

Ekayanti Mulyawati Kaiin B362080032

RINGKASAN

EKAYANTI MULYAWATI KAIIN. Kajian In Vitro Kultur Sel dan Conditioned Medium Sel Leydig Tikus dan Peranannya Terhadap Diferensiasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang. Dibimbing oleh MOHAMAD AGUS SETIADI, TUTY LASWARDI YUSUF dan ITA DJUWITA.

Penggunaan gradien Percoll untuk isolasi sel Leydig dilaporkan dapat menyebabkan toksisitas pada sel sehingga dapat mengurangi viabilitas dan perolehan jumlah sel hidup setelah dikultur. Untuk mengatasi permasalahan tersebut, telah dilakukan penelitian isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan menggunakan gradien non toksik Nycodenz. Penggunaan gradien Nycodenz untuk isolasi dan purifikasi sel Leydig belum pernah dilakukan oleh peneliti lain. Untuk memperoleh potensi sel Leydig yang optimum, diperlukan medium yang mengandung human Chorionic Gonadotrophin (hCG) sebagai induktor sekresi testosteron oleh sel Leydig. Di samping itu, untuk menghasilkan kondisi optimum sel Leydig secara in vitro, diperlukan faktor pertumbuhan yang akan mendukung perkembangannya. Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan penambahan hCG dan Insulin Transferrin Selenium (ITS). Conditioned medium (CM) kultur sel Leydig mengandung berbagai bahan bioaktif yang disekresikan oleh sel Leydig secara in vitro seperti testosteron dan faktor pertumbuhan. Untuk itu, penelitian penggunaan conditioned medium sel Leydig sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dilakukan untuk mengetahui pengaruhnya terhadap diferensiasi stem cell mesenkimal.

Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi : 1.Isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan dua perlakuan gradien Nycodenz yaitu:

(I) gradien terdiri dari 3 kolom (5%,10% ,15%) dan (II) gradien terdiri dari 5 kolom (4%, 8%, 10%, 12% ,15%) serta gradien Percoll (21%, 26%, 34% , 40%, 60%) sebagai kontrol.

2. Kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan hasil yang terbaik dari penelitian tahap 1 (gradien Nycodenz II) dengan penambahan hormon dan faktor pertumbuhan sebagai berikut: (1) DMEM+NBCS 10% sebagai kontrol, (2) DMEM+NBCS+hCG 2,5 IU/ml, (3) DMEM+NBCS+ insulin 5 μg/ml, transferrin, 10 μg/ml, selenium 5 μg/ml (ITS) dan (4) DMEM+NBCS+hCG+ ITS.

3.Penggunaan CM sel Leydig yang telah dianalisis kandungan testosteron dan proteinnya sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus untuk mengetahui kemampuan CM tersebut dalam mengarahkan diferensiasi.

Hasil penelitian pertama menunjukkan bahwa gradien Nycodenz menghasilkan tingkat kemurnian dan viabilitas sel yang setara dengan penggunaan gradien Percoll. Namun demikian, setelah dikultur selama 3 hari, tampak konsentrasi dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz lebih tinggi dibandingkan dengan gradien Percoll.

Penambahan kombinasi hCG dan ITS dalam medium DMEM menghasilkan tingkat proliferasi sel Leydig yang tertinggi (90,64%) dibandingkan dengan hanya penambahan hCG (86,99%) atau ITS (88,35%), serta kontrol (86,82%). Kecepatan proliferasi (Population Doubling Time, PDT) sel Leydig kultur primer pada perlakuan kombinasi hCG dan ITS menunjukkan kecepatan proliferasi yang paling cepat (0,88 hari) dibandingkan dengan perlakuan lainnya (ITS 0,97 hari; hCG 1,02 hari; kontrol 1,03 hari). Hasil serupa juga tampak pada kultur sel Leydig pada galur sel pertama dan kedua.

Hasil analisis testosteron pada medium kultur menunjukkan bahwa perlakuan kombinasi hCG dan ITS menghasilkan testosteron paling tinggi (5,25 ng/ml) dibandingkan dengan perlakuan lain (hCG 5,06 ng/ml; ITS 3,19 ng/ml; kontrol 2,46 ng/ml). Dari kedua hasil tersebut mengindikasikan bahwa kombinasi medium kultur dengan penambahan hCG dan ITS mendukung pertumbuhan dan produksi testosteron oleh sel Leydig secara in vitro yang lebih baik dibandingkan dengan kombinasi medium lainnya.

Stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM sel Leydig mampu mengarahkan 53,2% sel berdiferensiasi menjadi sel Leydig yang ditunjukkan dengan reaksi positif terhadap pewarnaan 3β-HSD. Penambahan hCG ke dalam medium kultur stem cell mesenkimal mengandung CM sel Leydig mampu meningkatkan jumlah sel Leydig menjadi 71,9%. Hal tersebut didukung pula dengan adanya kandungan testosteron di dalam medium kultur (0,93 ng/ml dan 10,22 ng/ml).

Hasil pengujian lebih lanjut terhadap CM kultur sel Leydig dengan perlakuan kombinasi hCG dan ITS memiliki kandungan testosteron (0,71 ng/ml) dan protein (985,29 µg/ml) yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Di samping itu, conditioned medium kultur sel Leydig pada penelitian ini menghasilkan pita protein antara berat molekul (BM) mendekati 29 kDa, 62–70 kDa dan 95-130 kDa.

Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa penggunaan gradien Nycodenz II efektif untuk melakukan purifikasi sel Leydig. Kombinasi penambahan ITS dan hCG menghasilkan tingkat proliferasi sel yang lebih baik dengan PDT yang lebih pendek. Selain itu, diperoleh kandungan testosteron yang lebih banyak di dalam medium kultur sel Leydig. Penggunaan CM Leydig mampu mendiferensiasikan stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig (transdiferensiasi).

Kata kunci: sel Leydig, tikus, Nycodenz, testosteron, stem cell mesenkimal,

sumsum tulang, conditioned medium, transdiferensiasi.

SUMMARY EKAYANTI MULYAWATI KAIIN. Study of In Vitro Cell Culture and The Role of Rat Leydig Cells Conditioned Medium on Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Differentiation. Supervised by MOHAMAD AGUS SETIADI, TUTY LASWARDI YUSUF and ITA DJUWITA.

The use of Percoll gradients for Leydig cells isolation has been reported to

influence cell toxicity and reduce the viability and the amount of living cells after culture. To dissolve this problem, study has been carried out used non toxic Nycodenz gradient to isolated and purified the Leydig cells. The use of Nycodenz gradient for the isolation and purification of Leydig cells has not been done by other researchers. To obtain the optimum condition of Leydig cells production, growth factor is required as supporting factors for development of growing cells. Therefore, hCG and ITS has been used in this study. Leydig cells conditioned medium (LCM) contained bioactive materials such as testosterone and growth factors. The Leydig cells conditioned medium as culture medium for bone marrow mesenchymal stem cells will be used to determine its influence to differentiation of cells.

The phase of this study included: 1. Isolation and purification of Leydig cells using Nycodenz gradient : (I) with 3

column ( 5 % , 10 % , 15 % ) and ( II ) with 5 columns ( 4 % , 8 % , 10 % , 12 % , 15 % ) and Percoll gradient ( 21 % , 26 % , 34 % , 40 % , 60 % ) as a control .

2. In vitro culture of the best result from cell purification was cultured with the addition of hormones and growth factors : (1) DMEM+NBCS 10% as control, (2) DMEM + NBCS + 2.5 IU/ml hCG , (3) DMEM + NBCS+ 5 ug / ml insulin, 10 ug/ml transferrin, selenium 5 ug/ml (ITS ) and (4) DMEM +NBCS + hCG+ITS .

3 . The concentration of testosteron and protein analyzed from Leydig cells conditioned medium has been used for culturing bone marrow mesenchymal stem cells.

The result of first phase study was Nycodenz gradient have the same purity and viability compared with Percoll gradient. After 3 days cultured, in Nycodenz gradient the concentration and viability of Leydig cells more higher than Percoll gradient. The combination of hCG and ITS in DMEM produced Leydig cell proliferation (90.64%) higher compared with hCG (86.99%), ITS (88.35%) and control (86.82%). Proliferation rate (population doubling time, PDT) from primary culture using combination of hCG and ITS showed the fastest (0.88 day) compared with ITS (0.97 day), hCG (1.02 day) and control (1.03 day). The same result of Leydig cells proliferation rate has also showed in first and second cell lines. Testosterone consentration analyzed was the highest (5.25 ng/ml) in DMEM combination with hCG and ITS compared with other treatments (hCG 5.06 ng/ml; ITS 3.19 ng/ml and control 2.46 ng/ml).

Differentiation to became Leydig cells from bone marrow mesenchymal stem cells has been known from positive reaction to 3β-HSD staining. Added of hCG to Leydig cells conditioned medium was able to increased the number of Leydig cells to 71.9%. It was also showed that concentration of testosterone has been increased (0.93 ng/ml and 10.22 ng/ml) in the culture medium.

The combination of hCG and ITS in DMEM had testosterone (0.71 ng/ml) and protein concentration (985.29 µg/ml) higher than the other treatments. The Leydig cell conditioned medium in this study had three protein bands with molecular weight (MW) approximately to 29 kDa, 62-70 kDa and 95-130 kDa.

Based on these results it could be concluded that the use of Nycodenz gradient II was effective to purified of Leydig cells. The combination of hCG and ITS was the best result to increase proliferation and testosterone. Leydig cells conditioned medium could also to differentiate mesenchymal stem cells into Leydig cells (transdiferentiation).

Keywords: Leydig cells, rat, Nycodenz, testosterone, mesenchymal stem cells, bone marrow, conditioned medium, transdiferentiation

Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM SEL LEYDIG TIKUS DAN PERANANNYA TERHADAP

DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL SUMSUM TULANG

EKAYANTI MULYAWATI KAIIN

Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktor Pada

Program Studi Biologi Reproduksi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

Penguji pada Ujian Tertutup: 1. Prof Dr drh Arief Boediono

2. drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD

Penguji pada Ujian Terbuka: 1. Dr Siti Nuramaliati Prijono

2. Dr drh Joko Pamungkas, MSc

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Allah Yang Maha Kasih atas segala karunia dan penyertaan-Nya sehingga penulis menyelesaikan penelitian dan penulisan disertasi dengan baik. Judul disertasi yang ditulis adalah Kajian In Vitro Kultur Sel dan Conditioned Medium Sel Leydig Tikus dan Peranannya Terhadap Diferensiasi Stem Cell Sumsum Tulang, diajukan sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan Program Doktor pada Program Studi Biologi Reproduksi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada Prof Dr drh Mohamad Agus Setiadi, selaku ketua komisi pembimbing, Prof Dr drh Tuty Laswardi Yusuf, MS dan Dr drh Ita Djuwita, M.Phil selaku anggota komisi pembimbing yang dengan penuh ketulusan memberi arahan dan masukan sejak penyusunan proposal, selama masa penelitian hingga penulisan disertasi. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Prof drh Arief Boediono, PhD dan drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD selaku penguji luar komisi pada Ujian Tertutup, kepada Dr Siti Nuramaliati Prijono dan Dr drh Joko Pamungkas, MSc selaku penguji luar komisi pada Ujian Terbuka atas masukan dan saran perbaikan yang memperkaya isi disertasi ini.

Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Kepala dan Staf Laboratorium Embriologi, Departemen AFF, Fakultas Kedokteran Hewan IPB : Prof drh Arief Boediono,PhD, drh Mokhamad Fachrudin, PhD, drh Wahono Esthi Prasetyaningtyas, M.Si, drh Kusdiantoro Mohamad, M.Si dan Wahyudin, A.Md yang telah mengijinkan dan mendukung kegiatan penelitian yang telah dilakukan. Terima kasih juga disampaikan kepada seluruh dosen dan pegawai di Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen KRP, Fakultas Kedokteran Hewan IPB, juga kepada Dekan dan seluruh staf Sekolah Pascasarjana IPB.

Pada kesempatan ini penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Prof Dr Baharuddin Tappa dan Prof Dr Bambang Prasetya atas ijin dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan studi. Terima kasih disampaikan juga kepada Kepala Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Dr Puspita Lisdiyanti atas segala dukungan dan bantuannya serta kepada Kepala Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Dr Witjaksono, MSc. atas ijin yang diberikan.

Kepada rekan-rekan saya, Dr drh Sri Wahyuni, MSi, Dr Tatan Kostaman, MP, Dr Harry Murti diucapkan terima kasih atas kebersamaan dan kekompakannya selama studi di IPB. Kepada seluruh rekan mahasiswa S2 dan S3 BRP, Dr Nurcholidah, bu Asri, pa Heri, bu Sri Gustina, pa Hasbi, pa Soni, mahasiswa S2 APH, mahasiswa S1 lab Embriologi, Devi Syafriani, MSi, Dr Katrin Roosita, Ria Ceriana, MSi atas hubungan baik dan kerjasamanya. Terima kasih juga disampaikan kepada rekan Gholib, M.Si, Muhammad Gunawan, M.Si, Nova Dila Yanthi, M.Si, Tulus Maulana, SPt dan Dr. Asrul M. Fuad beserta staf yang telah banyak membantu penulis dalam penelitian. Kepada rekan staf di Laboratorium Reproduksi dan Kultur Sel Hewan Puslit Bioteknologi LIPI, serta teman-teman lain yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan Pengurus KSAA-GKP Bogor atas pengertian dan dukungan doanya.

Akhirnya, karya ini dipersembahkan kepada suami dan anak-anak terkasih Ir. Harry Prabowo Nikodemus, Sarah Aryka dan Kezia Rachel, yang dengan penuh pengertian dan senantiasa mendukung penulis di dalam doa. Terima kasih dan penghargaan yang tak terhingga disampaikan kepada ayahanda Drs. Mulyana Kaiin, MM (almarhum) dan ibunda Suryati Elia yang telah membesarkan, mendidik dan senantiasa mendoakan dan mendukung penulis sampai saat ini. Kepada ibu mertua Etty Madjiah-Nikodemus, adikku Dwiyadi Mulyawan Kaiin, SE dan seluruh keluarga besar atas dukungan dan doa yang diberikan. Apa yang telah dicapai pada saat ini kiranya dapat menjadi penyemangat bagi anak-anakku dan keponakan-keponakanku untuk meraih cita-citanya.

Kiranya kasih Tuhan selalu menyertai kita sekalian. Semoga disertasi ini dapat memberikan manfaat yang sebesar-besarnya bagi perkembangan ilmu pengetahuan pada umumnya.

Bogor, Pebruari 2014 Ekayanti Mulyawati Kaiin

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

xvii xvii

DAFTAR GAMBAR xviii DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 2 Manfaat Penelitian 3 Kerangka Pemikiran 3

KONSENTRASI, KEMURNIAN DAN VIABILITAS SEL LEYDIG HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN NYCODENZ DAN KULTUR IN VITRO

6 Pendahuluan 7 Materi dan Metode 8 Hasil dan Pembahasan 11 Simpulan 16

OPTIMASI KULTUR IN VITRO DAN ANALISIS TESTOSTERON PADA MEDIUM KULTUR SEL LEYDIG TIKUS HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN NYCODENZ


UJI BIOLOGIS CONDITIONED MEDIUM SEL LEYDIG TERHADAP TRANSDIFERENSIASI STEM SEL MESENKIMAL SUMSUM TULANG TIKUS DEWASA


PEMBAHASAN UMUM 45 SIMPULAN DAN SARAN 46 DAFTAR PUSTAKA 48 LAMPIRAN 52

DAFTAR TABEL

1 Konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz dan Percoll

14

2 Konsentrasi dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dan dikultur in vitro selama 3 hari

15

3 Kemurnian, viabilitas dan konsentrasi sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz

23

4 Kultur primer sel Leydig hasil isolasi dan purifikasi dengan gradien Nycodenz

24

5 Jumlah dan PDT suspensi sel pada kultur in vitro 25 6 Kemurnian,viabilitas dan jumlah sel hidup galur sel Leydig 26 7 Hasil pengujian testosteron dalam medium kultur sel Leydig 27 8 Analisis konsentrasi testosteron dan protein dari conditioned

medium kultur sel Leydig

38 9 Kultur in vitro sel mesenkimal sumsum tulang dengan perlakuan

conditioned medium kultur sel Leydig serta analisis konsentrasi testosteron dan protein di dalam medium kultur

40

DAFTAR GAMBAR

1 Alur kegiatan penelitian 4 2 Populasi suspensi sel testiskuler hasil disosiasi jaringan testis tikus

dengan enzim collagenase dan trypsin inhibitor.

12 3 Sel Leydig setelah pewarnaan 3β-HSD dan Trypan Blue 13 4 Sel Leydig hasil purifikasi dengan beberapa gradien perlakuan

setelah dikultur selama 3 hari

16 5 Hasil analisis SDS PAGE terhadap conditioned medium kultur sel

Leydig

38 6 Kultur sel mesenkimal sumsum tulang tikus yang diwarnai dengan

pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD

40 7 Morfologi sel mesenkimal sumsum tulang yang dikultur secara in

vitro

41

DAFTAR LAMPIRAN

1 Pewarnaan histokimia 3β-HSD 52 2 Penghitungan Sel Menggunakan Haemositometer (kamar hitung)

Improved Neubaeur 53

3 Komposisi medium DPBS serum 54 4 Komposisi medium DMEM serum 54

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kehidupan modern dewasa ini menyebabkan tingkat stress yang tinggi, sehingga menjadi salah satu faktor pemicu berkembangnya berbagai macam penyakit yang memerlukan penanganan khusus. Berbagai penyakit tersebut dapat menyerang berbagai organ yang bersifat degeneratif, termasuk kelainan reproduksi. Salah satu penyakit kelainan reproduksi yang ditakuti oleh laki-laki adalah rendahnya produksi kadar testosteron, sehingga mengurangi kejantanan pria. Hal ini karena kekurangan hormon testosteron di dalam tubuh jantan dapat menghambat proses spermatogenesis (Hardy et al. 1991), sehingga menyebabkan infertilitas.

Kegagalan reproduksi pada jantan seperti defisiensi hormonal, saat ini umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis, tetapi terapi tersebut pada manusia dapat menyebabkan resiko jangka panjang seperti menyebabkan penyakit jantung koroner, retensi cairan, kanker prostat dan sebagainya (Gruennewald & Matsumoto 2003). Untuk itu, beberapa peneliti telah melakukan upaya terapi lainnya dengan menggunakan sel Leydig sebagai sumber sel penghasil hormon testosteron yang dapat ditransplantasikan ke dalam testis. Penggunaan sel Leydig sebagai terapi alternatif penghasil hormon testosteron membutuhkan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasikan dalam jumlah yang memadai. Produksi galur (cell line) sel Leydig secara in vitro diharapkan sebagai upaya tersedianya sumber sel Leydig untuk digunakan dalam mengembangkan terapi alternatif pada kegagalan reproduksi akibat defisiensi hormonal.

Isolasi sel Leydig pada umumnya dilakukan menggunakan gradien Percoll, tetapi diketahui bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga dapat menurunkan viabilitas sel Leydig ketika dikultur. Oleh karena itu diperlukan metoda isolasi dan purifikasi yang lebih baik. Nycodenz merupakan gradien pemisah yang bersifat non toksik dan tidak dapat diabsorpsi oleh beberapa jenis sel mammalia serta dapat dengan mudah dihilangkan dari sampel sel dibandingkan dengan gradien pemisahan lain (Miller 2006).

Diketahui fungsi utama sel Leydig pada testis dewasa adalah memproduksi testosteron yang diperlukan pada proses spermatogenesis. Pengaturan spermatogenesis tergantung dari sistem hormon yang kompleks yang secara langsung memerlukan testosteron. Sekresi testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon LH dari hipofisa dan merupakan bagian dari aksis hipotalamus-hipofisa-testis (Senger 2005, Yang et al. 2003). Sekresi testosteron tersebut tidak hanya berdasarkan aktivitas sel Leydig pada interstitial tetapi juga berdasarkan jumlah sel Leydig di dalam testis. Pada mamalia, fungsi sel Leydig melibatkan dua generasi sel yaitu pertama adalah populasi sel Leydig yang berkembang selama masa fetus. Sel Leydig pada tahap ini bertanggung jawab terhadap maskulinisasi sistem urogenital jantan (Habert et al. 2001).

2

Progenitor sel Leydig diduga merupakan stem cell mesenkimal karena mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal dari mesoderm embrio (Hardy et al 1991). Pada tikus, progenitor sel Leydig mempunyai kemampuan proliferasi tinggi dan menunjukkan marker fungsi diferensiasi (Ge et al. 2005). Disisi lain hormon LH atau hCG sangat diperlukan untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994) sehingga sel Leydig mampu memproduksi testosteron. Proliferasi sel Leydig di dalam kultur secara in vitro memerlukan bahan bioaktif tambahan dan yang umum digunakan adalah ITS (Insulin Transferrin Sodium Selenite) yang mengandung tiga faktor pertumbuhan. Selain itu juga berfungsi mengurangi penggunaan serum di dalam medium kultur.

Sel-sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti faktor pertumbuhan (growth factor) yang bermanfaat bagi pertumbuhan sel dalam kultur. Kultur sel Leydig diduga mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti peptida, faktor pertumbuhan, hormon testosteron ke dalam medium kultur (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997, Hu et al. 1998). Medium tersebut dapat digunakan untuk mengkultur kembali sel Leydig maupun sel yang lain dan dikenal sebagai conditioned medium. Penggunaan conditioned medium ditemukan dapat mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal menjadi sel tertentu (Djuwita et al. 2010), selain itu stem cell mesenkimal sumsum tulang belakang yang ditransplantasikan ke dalam testis menyebabkan sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel Leydig (Yazawa et al. 2006).

Berdasarkan beberapa hal yang telah diuraikan di atas, maka perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan teknik isolasi dan pemurnian sel Leydig yang mempunyai viabilitas sel setelah kultur yang tinggi sehingga diperoleh galur sel sebagai sumber sel Leydig, untuk mendapatkan sistem kultur sel Leydig yang optimum, serta untuk mendapatkan sel Leydig alternatif dari stem cell mesenkimal yang diferensiasinya diarahkan dengan menggunakan conditioned medium kultur sel Leydig (transdiferensiasi).

Tujuan Penelitian

1. Menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi, dipurifikasi dan kultur in vitro.

2. Menguji pengaruh penambahan hCG dan/atau ITS ke dalam medium DMEM terhadap proliferasi dan perkembangan sel untuk mendapatkan kondisi optimum kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz.

3. Mengidentifikasi sekresi testosteron dan protein yang terdapat dalam conditioned medium (CM) kultur sel Leydig.

4. Memperoleh sel Leydig dari hasil kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan CM kultur sel Leydig.

3

Manfaat Penelitian

Sel Leydig dan CM kultur sel Leydig dapat digunakan untuk aplikasi terapi reproduksi pada manusia dan hewan terutama hewan yang terancam punah.

Kerangka Pemikiran

Penggunaan gradien Percoll banyak digunakan untuk melakukan purifikasi sel Leydig berdasarkan densitas sel. Percoll terdiri dari silica koloid yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) dan merupakan medium yang mempunyai partikel dengan diameter 15-30 nm. Keuntungan penggunaan gradien Percoll adalah untuk memisahkan sel karena mempunyai viskositas, osmolaritas dan toksisitas yang rendah. Namun penggunaan Percoll untuk mempurifikasi sel Leydig ditemukan bersifat toksik terhadap sel karena adanya proses pinositosis sehingga partikel Percoll dapat masuk ke dalam sel Leydig.

Oleh karena itu, diperlukan gradien lainnya yang digunakan untuk mengatasi masalah toksisitas sel Leydig setelah purifikasi. Di samping itu, gradien alternatif yang digunakan untuk purifikasi sel Leydig juga harus menghasilkan kemurnian yang tinggi. Gradien non toksik Nycodenz yang merupakan gradien non partikel sudah sering digunakan untuk memperoleh berbagai jenis sel. Nycodenz atau iohexol bersifat non ionik dan non toksik serta tidak dimetabolisme oleh sel. Lebih lanjut diketahui juga bahwa Nycodenz merupakan larutan non partikel, sehingga mudah dihilangkan dari medium setelah digunakan untuk memisahkan sel. Purifikasi sel dengan gradien Nycodenz dilakukan dengan cara sentrifugasi sehingga sel dengan densitas tertentu akan berada pada konsentrasi gradien Nycodenz tertentu. Penggunaan gradien Nycodenz untuk mempurifikasi Leydig diharapkan dapat memperoleh tingkat kemurnian sel Leydig yang tinggi dan setara dengan penggunaan gradien Percoll.

Kultur sel Leydig yang optimal memerlukan berbagai bahan bioaktif yang mampu mendukung proliferasi dan perkembangan sel di dalam kultur. Produksi hormon testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon gonadotropin yaitu hormon LH yang diperlukan oleh sel Leydig sebagai induktor untuk memproduksi testosteron secara in vivo. Di dalam kultur in vitro, penambahan hormon hCG yang merupakan analog dari LH digunakan untuk menginduksi sel Leydig dalam memproduksi testosteron. Di samping hormon, diduga bahwa untuk proliferasi sel diperlukan penambahan faktor pertumbuhan yang dapat mendukung proliferasi sel dengan baik. Faktor pertumbuhan ITS merupakan faktor yang berperan dalam proliferasi sel. Untuk itu kajian penambahan hCG atau ITS ke dalam medium kultur sel Leydig secara in vitro dilakukan untuk dapat meningkatkan konsentrasi sel serta memperoleh testosteron dan bahan bioaktif lainnya .

Sel Leydig dewasa berasal dari progenitor sel Leydig yang merupakan stem cell mesenkimal yang terdapat di dalam testis. Untuk pembuktian lebih

4

lanjut tentang kemampuan sekreta bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel Leydig, maka dilakukan penelitian kemampuan conditioned medium sel Leydig untuk mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig. Untuk mencapai hasil di atas, maka dilakukan serangkai penelitian dalam tiga tahap, yaitu : (1) isolasi dan purifikasi sel Leydig menggunakan gradien Nycodenz, (2) optimasi medium kultur sel Leydig serta memperoleh conditioned medium serta galur sel Leydig dan (3) mengkultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan conditioned medium sel Leydig untuk memperoleh sel Leydig (Gambar 1). Sebagai data tambahan juga dilakukan analisis terhadap kandungan testosteron dan kandungan protein yang terdapat di dalam conditioned medium sel Leydig.

5

Testis tikus

Gambar 1. Alur kegiatan penelitian

Tahap ketiga

Tahap kedua

Tahap pertama

Sel Leydig

Pasase Medium Kultur

Optimum Koleksi conditioned

medium (CM)

Population Doubling Time (PDT) Kemurnian, konsentrasi dan viabilitas galur sel

ELISA, SDS PAGE, Spektrofotometer

Profil hormon testosteron dan protein CM

Koleksi stem cell mesenkimal sumsum

tulang

Isolasi tibia atau femur tikus dewasa

Kultur in vitro: 1.DMEM+NBCS10% 2.DMEM+testosteron 10 ng/ml 3.DMEM+CML 50% 4.DMEM+CML 50%+hCG 2,5 IU/ml

Kultur in vitro dengan perlakuan: 1. DMEM+ NBCS 10% 2. DMEM + NBCS 10%+hCG 2,5 IU/ml 3. DMEM + NBCS 10%+ITS 4. DMEM + NBCS 10%+hCG +ITS

CML1, CML2, CML3, CML4

Isolasi dan purifikasi: Nycodenz I, II dan Percoll

Kemurnian, konsentrasi dan

viabilitas sel Leydig

Viabilitas setelah kultur (3 hari)

CML 4 (hCG+ITS)

Deteksi Sel Leydig ?? Pewarnaan 3β-HSD Morfologi

Uji testosteron (ELISA) Uji protein (spektrofotometer)

6

KONSENTRASI, KEMURNIAN DAN VIABILITAS SEL LEYDIG HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN

NYCODENZ DAN KULTUR IN VITRO

ABSTRAK

Peran sel Leydig sebagai penghasil hormon testosteron di dalam tubuh jantan diketahui diperlukan untuk terjadinya proses spermatogenesis. Pada kasus hipogonadism, terapi transplantasi sel Leydig telah dilakukan. Dengan demikian penelitian kultur in vitro sel Leydig diperlukan untuk mendukung ketersediaan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasi.

Koleksi sel dari jaringan testis menghasilkan suspensi dengan jenis sel yang beragam. Untuk mendapatkan sel Leydig diperlukan proses purifikasi dan yang umum digunakan adalah gradien Percoll, namun dilaporkan bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga menyebabkan toksisitas rendah pada sel yang dapat mempengaruhi viabilitas dan perolehan jumlah sel hidup setelah dikultur. Untuk mengatasi permasalahan tersebut, telah dilakukan purifikasi dengan menggunakan gradien Nycodenz yang tidak toksik terhadap sel. Perlakuan dilakukan dengan gradien Nycodenz I, 3 kolom (5%, 10%, 15%) dan II, 5 kolom (4%,8%,10%,12%,15%) yang dibandingkan dengan gradien Percoll 5 kolom (21%, 26%, 34%, 40% dan 60%). Parameter yang diamati adalah konsentrasi, kemurnian, viabilitas serta jumlah sel Leydig hidup setelah purifikasi dan kultur in vitro. Hasil menunjukkan bahwa isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan gradien Nycodenz I (85,53%) dan II (91,40%) menghasilkan kemurnian yang tidak berbeda dibandingkan dengan gradien Percoll (92,22%). Viabilitas sel Leydig pada Nycodenz I (85,53%) dan Nycodenz II (91,40%) juga tidak berbeda dibandingkan dengan Percoll (92,22%). Konsentrasi sel yang diperoleh setelah dipurifikasi menggunakan gradien Nycodenz I (7,12x106sel/ml) dan gradien Nycodenz II (7,03 x 106sel/ml ) masih rendah (p<0,05) dibandingkan dengan Percoll (15,42x 106sel/ml). Peranan Nycodenz II (3,88x106 sel/ml) terhadap konsentrasi sel terlihat tinggi setelah 3 hari dikultur dibandingkan Nycodenz I (3,21 x 106sel/ml) dan Percoll (2,44 x106sel/ml) (p<0,05). Viabilitas sel setelah dikultur juga tampak lebih baik pada Nycodenz I (90%) dan Nycodenz II (91,16%) dibandingkan dengan Percoll (82,30%). Disimpulkan bahwa Nycodenz II lebih efektif mempurifikasi sel Leydig dan setelah dikultur, penggunaan gradien Nycodenz lebih baik terhadap konsentrasi dan viabilitas sel Leydig dibandingkan dengan Percoll.

Kata kunci : sel Leydig, gradien, Nycodenz, Percoll, kemurnian, viabilitas

7

ABSTRACT

The role of Leydig cells is to produce testosterone which is important for spermatogenesis process. The transplantation of Leydig cells has been success to increase testosterone concentration in hypogonadism. Research on in vitro culture of Leydig cell is required to support availability of Leydig cell for transplantation. The purification of Leydig cell from testicular tissue produce heterogenous of cells. It is therefore further method to purify of Leydig cells is required. Percoll gradient is one method to purify Leydig cells, but it is reported that it can cause toxicity to Leydig cells, so it can influence on cell viability and recovery rate. To overcome these problem, this research used non toxic Nycodenz gradient with different column namely (I) 3 columns (5%, 10%, 15%) and (II) 5 columns (4 % ,8 % ,10 % ,12 % ,15 % ) compared with 5 columns Percoll gradient (21 %, 26 %, 34 %, 40 % and 60 % ) as control. The percentage of cell viability, live cells and the cell concentration were measured after purification and culture. The result showed that the purity of Leydig cells after purification using Nycodenz I (85.53%), Nycodenz II (91.40%) were comparable with Percoll (92.22%). However, the cells concentration after purification with Nycodenz (I: 7.12 x 106 cells/ml; II : 7.03 x x 106 cells/ml) showed still lower than Percoll (15.42 x 106 cells/ml) (p<0.05). After 3 days culture, the cells concentration was higher in Nycodenz I (3.21 x 106cells/ml) , Nycodenz II (3.88 x 106cells/ml) than Percoll gradient (2.44 x 106cells/ml), with similar result on cell viability. It can be concluded that Nycodenz gradient II more effective to purify Leydig cells to obtain high concentration and viability of cells after culture.

Keywords : Leydig cells, gradient, Nycodenz, Percoll, purity, viability

PENDAHULUAN

Hormon testosteron dihasilkan oleh sel Leydig dan berperan penting dalam proses spermatogenesis yaitu perkembangan sel spermatogonia menjadi spermatozoa. Jika terjadi kekurangan hormon testosteron, dapat menghambat proses spermatogenesis dalam tubulus seminiferus. Pada saat ini, kondisi defisiensi testosteron umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis. Namun pada manusia terapi dengan cara ini dapat menyebabkan resiko jangka panjang. Oleh karena itu, beberapa peneliti telah melakukan upaya terapi alternatif dengan menggunakan transplantasi sel Leydig sebagai penghasil hormon testosteron. Penggunaan sel Leydig sebagai terapi

8

alternatif penghasil hormon testosteron membutuhkan sumber sel Leydig dalam konsentrasi dan viabilitas yang memadai. Untuk itu diperlukan penelitian menghasilkan sel Leydig dengan konsentrasi, kemurnian dan viabilitas tinggi, baik setelah purifikasi maupun setelah dikultur secara in vitro.

Isolasi dan purifikasi sel Leydig telah banyak dilakukan dengan beberapa metode, di antaranya gradien Percoll dengan konsentrasi yang bervariasi. Percoll adalah silika koloid yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) merupakan bahan yang dapat digunakan untuk memisahkan berbagai jenis sel. Hasil purifikasi Chemes et al. (1992) menggunakan gradien Percoll diskontinu pada gradien 34% dan 60% menghasilkan sel Leydig dengan kemurnian 90%, sedangkan Bilinska et al. (2009) menggunakan metoda yang sama memperoleh kemurnian sebesar 80-83% hasil peneguhan dengan pewarnaan 3β-hydroxysteroid dehidrogenase (3β-HSD).

Wakefield et al. (1982) melaporkan bahwa penggunaan gradien Percoll untuk mengisolasi sel Leydig tikus pada suhu 20 C- 37 C dapat menyebabkan partikel Percoll masuk ke dalam sel Leydig yang berakibat menurunnya viabilitas sel. Hal tersebut disebabkan gradien Percoll bersifat sitotoksik. Gradien pemisah sel lainnya adalah Nycodenz atau Iohexol, yang mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan dengan Percoll di antaranya mempunyai osmolalitas dan viskositas rendah tetapi mempunyai densitas yang tinggi, sehingga dapat secara efektif memisahkan makromolekul dan sel dengan rentang ukuran yang lebih luas untuk jenis sel yang lebih bervariasi. Nycodenz bersifat stabil, larut dalam air dan dapat disterilisasi dengan filter syringe sehingga mudah digunakan di laboratorium, bersifat non sitotoksik terhadap sel mammalia. Selain itu, Nycodenz dengan mudah dapat dihilangkan dari suspensi sel dengan cara sentrifugasi dibandingkan dengan gradien dari bahan lain karena residu gradien pemisah dapat menyebabkan kematian sel. Nycodenz dapat digunakan secara mudah dengan metode sederhana tanpa ada keterbatasan dalam suhu, pH dan stabilitas (Miller 2006). Gradien Nycodenz telah digunakan untuk memisahkan sel darah, sel hati, primordial germ cell (PGC), spermatogonia dan sel Sertoli (Evans & Flint 1985, Manayagi et al. 2003, Nakayama et al. 1999), namun penelitian menggunakan gradien Nycodenz untuk mengisolasi sel Leydig pada tikus belum dilaporkan. Untuk itu, penelitian ini dilakukan untuk menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi dan purifikasi serta kultur in vitro.

MATERI DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor mulai dari Desember 2011 sampai Mei 2012.

9

Materi Penelitian

Untuk mendapatkan suspensi testikular dilakukan isolasi dan koleksi dari testis yang dikoleksi dari tiga ekor tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu yang diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB. Perlakuan terhadap hewan percobaan pada penelitian ini telah dilakukan dengan mengikuti kaidah ilmiah terstandar dengan memperhatikan prinsip-prinsip kesejahteraan hewan.

Metode Penelitian

Kegiatan penelitian yang dilakukan terdiri dari :

1. Pembuatan Suspensi Sel Testikuler 2. Isolasi dan Purifikasi Sel Leydig 3. Kultur In Vitro Sel Leydig Hasil Purifikasi

Pembuatan Suspensi Sel Testikuler

Tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu diambil

testisnya setelah dibius dengan ether dan dikorbankan dengan cara cervical dislocation. Selaput tunika albuginea dan jaringan ikat lainnya dibuang, kemudian jaringan testis ditempatkan di dalam cawan petri berisi medium Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (DPBS tanpa Ca dan Mg, Gibco 21600-010, Invitrogen NY, USA). Jaringan tersebut kemudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan medium DPBS yang ditambah serum (Newborn Calf Serum, NBCS, Gibco, 16010-159, Invitrogen, New Zealand) 0,1% (mDPBS). Pengambilan jaringan testis dilakukan secara aseptis kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi satu ml collagenase type I (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 0,04% dan trypsin inhibitor (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 10 µg/ml dalam DPBS dan diinkubasi di dalam waterbath (Eyela SB-24) pada suhu 34 C selama 40 menit. Suspensi sel diencerkan sebanyak empat kali volume awal dengan mDPBS, kemudian didiamkan selama dua menit agar sel mengendap. Cairan supernatan dikoleksi dan disentrifugasi (Kokusan H-26F) dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel dicuci sebanyak dua kali menggunakan mDPBS dengan cara yang sama. Terakhir, pelet sel diencerkan dengan 500 µl mDPBS.

10

Isolasi dan Purifikasi Sel Leydig

Isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan metode gradien Nycodenz® (1002424, Axis-Shield PoC AS, Oslo Norway) yang dimodifikasi dari Nakayama et al. (1999). Suspensi sel kemudian dimasukkan ke dalam larutan Nycodenz dengan gradien 3 kolom 5%, 10% dan 15% (Nycodenz I) atau gradien 5 kolom 4%, 8%, 10%, 12%, 15% (Nycodenz II). Setelah itu, larutan gradien disentrifugasi menggunakan sentrifus swing rotor (Kokusan H-26F) dengan kecepatan 1.500 g selama 10 menit pada suhu ruang. Lapisan sel yang terbentuk kemudian dikoleksi dan dicuci berturut-turut dengan mDPBS sebanyak empat kali dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel diencerkan dengan 500 µl mDPBS.

Sebagai kontrol, isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan gradien Percoll (Sigma P-1644St Louis, MO, USA) dengan 5 kolom yaitu 21%, 26%, 34% , 40% dan 60% (modifikasi Chemes et al. 1992). Setelah itu suspensi sel disentrifugasi berturut-turut dengan kecepatan 400 g selama 15 menit dan 800 g selama 15 menit dengan menggunakan sentrifus swing rotor pada suhu ruang, kemudian dilakukan perlakuan seperti pada Nycodenz.

Kultur In Vitro Sel Leydig Hasil Purifikasi

Sebanyak 1 x 106 sel/ml suspensi sel Leydig dari masing-masing perlakuan dikoleksi dan dikultur dalam medium DMEM (Sigma, D5532, St. Louis, MO, USA) yang ditambah NBCS 10% (mDMEM) di dalam inkubator CO2 5% dengan suhu 37o C selama tiga hari. Evaluasi

Evaluasi dilakukan pada saat setelah purifikasi dan setelah dikultur. Parameter yang diamati adalah konsentrasi suspensi sel Leydig, kemurnian, viabilitas dan sel Leydig hidup. Penghitungan konsentrasi suspensi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan hemositometer (kamar hitung) Neubauer sedangkan penentuan kemurnian sel Leydig dilakukan dengan pewarnaan histokimia 3β-HSD (Lampiran 1). Pewarnaan ini merupakan pewarnaan spesifik terhadap sel Leydig. Proses pewarnaan dapat mendeteksi enzim 3β-HSD yang terdapat di dalam sel Leydig dan menyebabkan sel berwarna ungu. Pengujian viabilitas sel dilakukan dengan pewarnaan Trypan Blue (SIGMA T6146- St. Louis, MO, USA). Sel yang mati akan berwarna biru karena mengalami kerusakan membran sehingga zat pewarna dapat masuk ke dalam sel. Penghitungan persentase sel Leydig hidup dilakukan untuk mengetahui jumlah sel Leydig sebenarnya yang terdapat di dalam suspensi sel.

11

Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Purifikasi sel Leydig hasil isolasi dari tubulus seminiferus dilakukan dengan dua perlakuan yaitu gradien Nycodenz 3 kolom (5%, 10% dan 15% disebut Nycodenz I), gradien Nycodenz 5 kolom (4%,8%,10%,12%, dan 15% disebut Nycodenz II) dan gradien Percoll 5 kolom (21%, 26%, 34%, 40% dan 60%) sebagai kontrol. Parameter yang diamati adalah konsentrasi sel, kemurnian, viabilitas, dan sel Leydig hidup setelah purifikasi dan kultur in vitro. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh kemudian diuji secara statistik dengan uji ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Suspensi Testikuler Hasil Disosiasi

Sel Leydig merupakan sel yang berada di jaringan interstisial di antara tubuli seminiferi testis. Isolasi sel Leydig dilakukan dengan cara disosiasi jaringan testis menggunakan enzim collagenase dan trypsin inhibitor, sehingga diperoleh suspensi sel testikuler yang terdiri dari sel-sel gamet yakni spermatogonia (1), spermatosit, spermatid (2), dan spermatozoa (3), serta sel-sel somatis lainnya seperti sel Sertoli, sel darah (4) ,fibroblast (5) dan sel Leydig (6) (Gambar 1).

Hasil isolasi dari jaringan tubuli seminiferi tersebut belum dapat digunakan untuk mendapatkan sel Leydig secara homogen, karena proses isolasi tidak secara selektif memisahkan sel Leydig dari sel-sel testikuler lainnya. Sel-sel yang diisolasi dapat dibedakan berdasarkan morfologi dan ukuran sel. Spermatid berukuran 10 µm dan spermatozoa mempunyai panjang sekitar 60 µm. Sel Sertoli berbentuk ovoid, berukuran besar dan mempunyai inti yang besar (Anonimous 2012). Sel Leydig dewasa pada kondisi in vivo berbentuk poligonal. Sel Leydig manusia mempunyai ukuran sel 12,0-17,4 µm (Heller & Leach 1971) dan 15-20 µm pada kelinci (Anonimous 2012). Di dalam jaringan interstitial terdapat 2 populasi sel Leydig yaitu sel tunggal dan kelompok sel (cluster) (Salva et al. 2001). Untuk memperoleh sel Leydig yang homogen diperlukan proses purifikasi dan hasilnya kemudian diteguhkan dengan pewarnaan 3β-HSD. Pewarnaan tersebut digunakan untuk mendeteksi adanya enzim 3β-HSD yang diperlukan untuk mengubah androstenediol menjadi testosteron di dalam sel Leydig.

12

Gambar 2. Populasi suspensi sel testikuler hasil disosiasi jaringan testis tikus dengan enzim collagenase dan trypsin inhibitor.1. spermatogonia , 2. spermatid, 3. spermatozoa, 4. sel darah merah, 5. Fibroblas, 6 Sel Leydig. Skala = 10 µm

Konsentrasi, Kemurnian dan Viabilitas Sel Leydig Setelah Purifikasi

Lapisan sel Leydig yang dipurifikasi dengan gradien Nycodenz I (3 kolom) dan Nycodenz II (5 kolom) diperoleh masing-masing di antara gradien 5% dan 10% dan gradien 8% dan 10%, sedangkan dengan menggunakan gradien Percoll (5 kolom) diperoleh lapisan sel Leydig di antara gradien 34% dan 40%.

Gradien Nycodenz dan Percoll telah digunakan untuk memisahkan beberapa jenis sel dari suspensi sel hasil isolasi. Gradien untuk purifikasi sel memiliki beberapa syarat seperti: mempunyai gradien densitas yang sesuai dengan sel yang akan dipurifikasi, bersifat iso-osmostik, mempunyai viskositas rendah, tidak toksik dan tidak memasuki membran sel serta dapat dengan mudah dihilangkan dari medium. Setelah sentrifugasi akan terbentuk lapisan sel berwarna putih susu pada gradien. Jika densitas gradien setara dengan dengan densitas sel, maka akan diperoleh lapisan sel yang besar dan berada pada bagian tengah gradien, sedangkan jika densitas sel lebih tinggi atau lebih rendah daripada densitas gradien maka akan terbentuk lapisan tipis pada gradien yang berbeda.Lapisan sel akan terbentuk sesuai dengan densitas Nycodenz atau Percoll (Amersham Biosciences 2010; Sharpe 1988). Perbedaan densitas antara gradien Nycodenz dengan Percol adalah Nycodenz mempunyai densitas 1,426 g/ml (80 %v/w), sedangkan Percoll 1,130 g/ml (23% w/w) dalam bentuk larutan koloid. Hal lain yang dapat mempengaruhi posisi terbentuknya lapisan sel pada gradien adalah viskositas, osmolalitas dan konsentrasi gradien yang digunakan. Oleh karena itu,

13

pada penelitian ini terdapat perbedaan posisi pembentukan lapisan sel pada gradien Nycodenz dengan gradien Percoll.

Setelah dipurifikasi baik menggunakan gradien Nycodenz maupun Percoll, tampak populasi sel Leydig menjadi lebih homogen dibandingkan sebelumnya. Hal tersebut ditunjukkan oleh persentase kemurnian sel Leydig yang diperoleh yaitu di antara 85 sampai 92 % (Tabel 1) dan dibuktikan dengan pewarnaan 3β-HSD yang menghasilkan sel yang positif terhadap pewarnaan tersebut menandakan bahwa sel-sel tersebut adalah sel Leydig (Gambar 3a). Ukuran sel Leydig bervariasi berdasarkan penambahan lipid pada sitoplasma. Perubahan sel Leydig dewasa immature menjadi sel Leydig mature dikenali dengan adanya peningkatan ukuran sel dan menghilangnya droplet lipid pada sitoplasma (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001).

\

Gambar 3. Sel Leydig setelah pewarnaan 3β-HSD dan Trypan Blue a. Sel

Leydig adalah sel yang berwarna ungu , menunjukkan sel positif 3β-HSD (tanda panah); sel tidak terwarna (x) adalah sel non Leydig. b.Warna biru menunjukkan sel Leydig yang mati (kepala panah) dengan Pewarnaan Trypan Blue. Skala = 20 µm.

Pengujian viabilitas sel Leydig hasil purifikasi digunakan untuk mengetahui kualitas sel setelah dipurifikasi oleh gradien Nycodenz maupun Percoll. Pada Gambar 3b tampak viabilitas sel Leydig tinggi yang ditunjukkan dengan sedikitnya jumlah sel Leydig berwarna biru (sel mati). Viabilitas sel Leydig dari hasil koleksi dengan tiga metode tersebut menghasilkan viabilitas pada Nycodenz I (98,93%) dan Nycodenz II (98,17%) serta Percoll (98,00 %) (Tabel 1). Hasil isolasi dan purifikasi menggunakan gradien Nycodenz maupun gradien Percoll tidak mempengaruhi viabilitas sel Leydig.

Konsentrasi sel Leydig hasil isolasi dan purifikasi dengan gradien Nycodenz (7,03-7,12 x106 sel/ml) masih lebih rendah (p<0,01) dibandingkan dengan menggunakan gradien Percoll (15,42x106 sel/ml) (Tabel 1). Kecepatan dan waktu sentrifugasi serta konsentrasi gradien dapat mempengaruhi jumlah sel yang dipurifikasi (Thermo 2012). Sel Leydig yang diperoleh pada gradien Nycodenz lebih sedikit daripada gradien Percol, kemungkinan disebabkan

14

kecepatan, waktu dan konsentrasi yang digunakan untuk purifikasi belum optimal. Waktu dan kecepatan sentrifugasi yang tepat diperlukan supaya sel Leydig berada dalam gradien yang seharusnya karena jika terlalu lama dan/atau terlalu cepat maka semua sel akan mengendap di dasar tabung.

Tabel 1.Konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dengan

gradien Nycodenz dan Percoll Perlakuan pemurnian

Konsentrasi Sel Leydig suspensi (106 /ml)

Kemurnian (%)

Viabilitas (%)

Sel hidup (%)

Percoll

15,42a

92,22

98,00

90,40

Nycodenz I

7,12b

85,53

98,93

84,55

Nycodenz II

7,03b

91,40

98,17

89,62

Keterangan : huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (p<0,01) dengan uji lanjut Duncan

Purifikasi yang dilakukan menggunakan gradien Nycodenz 3 kolom diperoleh kemurnian sel Leydig yang relatif rendah yaitu 85,53%. Untuk meningkatkan kemurnian sel Leydig, dilakukan modifikasi penggunaan gradien Nycodenz menjadi 5 kolom sehingga diperoleh peningkatan kemurnian sel Leydig menjadi 91,40%. Kemurnian sel Leydig tersebut tidak berbeda dengan hasil purifikasi dengan gradien Percoll (92,22%). Perbedaan rentang kolom gradien dapat mempengaruhi proses pemisahan sel, semakin banyak jumlah kolom yang digunakan akan meningkatkan seleksi sel. Pada Nycodenz I yang terdiri dari 3 kolom, sel Leydig diperoleh berada di antara gradien 5% dan 10%, sedangkan pada Nycodenz II (5 kolom) sel Leydig diperoleh di antara 8% dan 10%. Hal ini menunjukkan bahwa pada gradien Nycodenz dengan rentang konsentrasi gradien yang lebih pendek dapat mempurifikasi sel Leydig dan menghasilkan kemurnian yang lebih tinggi.

Nycodenz merupakan bahan kimia tidak bermuatan listrik dengan mempunyai nama lain 5-(N-2.3-dihydroxypropylacetamido)-2.4.6-tri-iodo-N.N’-bis (2.3-dihydroxyproppyl) isophtalamide mempunyai berat molekul 821, mempunyai viskositas rendah, daya larut dalam air tinggi dan lebih stabil ketika dipanaskan. Hal tersebut memudahkan penggunaan Nycodenz di laboratorium karena pemisahan sel dapat dilakukan tanpa memerlukan peralatan khusus dan tanpa dibatasi oleh suhu dan pH.

Purifikasi sel Leydig menggunakan Nycodenz belum dilakukan oleh peneliti lain. Peningkatan persentase kemurnian sel Leydig pada gradien Nycodenz II belum diikuti oleh peningkatan konsentrasi sel Leydig dibandingkan dengan konsentrasi sel pada purifikasi dengan Percoll. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut pengembangan metode purifikasi sel Leydig dengan beberapa kombinasi konsentrasi gradien Nycodenz lain serta optimasi kecepatan

15

dan waktu sentrifugasi sehingga akan mempurifikasi sel Leydig dengan lebih baik. Konsentrasi dan Viabilitas Sel Leydig Setelah Purifikasi dan Kultur In Vitro

Kualitas sel Leydig setelah dikultur selama 3 hari ditampilkan pada Tabel 2.

Hasil menunjukkan bahwa setelah dikultur viabilitas sel Leydig menurun pada semua perlakuan dibandingkan setelah purifikasi. Setelah dikultur, viabilitas sel pada perlakuan dengan gradien Percoll menurun secara nyata (82,30%) (p<0,05) dibandingkan dengan penggunaan gradien Nycodenz I (90,00%) dan gradien Nycodenz II (91,16%). Hal ini membuktikan bahwa Nycodenz tidak bersifat sitotoksik terhadap sel Leydig, sehingga lebih banyak sel yang hidup setelah dikultur. Penggunaan Percoll untuk mempurifikasi sel Leydig menghasilkan jumlah dan kemurnian sel yang lebih tinggi, tetapi karena Percoll bersifat sedikit toksik dan dapat dimetabolisme oleh sel Leydig (Wakefield et al. 1982) diduga dapat menyebabkan penurunan viabilitas sel Leydig setelah dikultur. Tabel 2. Konsentrasi dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dan dikultur in vitro

selama 3 hari

Perlakuan pemurnian

Konsentrasi awal

Sel Leydig setelah kultur

(106 sel/ml) Konsentrasi (106 sel/ml)

Viabilitas (%) Sel hidup (%)

Percoll

1 2,44a 82,30a 81,97a

Nycodenz I

1 3,21b 90,00b 90,03b

Nycodenz II

1 3,88c 91,16 b 90,98b

Keterangan : huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji lanjut Duncan

Berdasarkan Gambar 4. dapat dilihat bahwa perbedaan gradien purifikasi mempengaruhi konsentrasi sel yang hidup setelah dikultur selama 3 hari. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi sel pada kultur sel Leydig yang berasal dari purifikasi Percoll (Gambar 4a) lebih sedikit jika dibandingkan dengan Nycodenz (Gambar 4b dan c). Hasil tersebut didukung oleh sel Leydig yang hidup setelah dikultur yang meningkat secara nyata (p<0,05) pada gradien Nycodenz (90,03%; 90,98%) dibandingkan dengan Percoll (81,97%). Penurunan konsentrasi sel dan jumlah sel hidup setelah dikultur pada sel Leydig hasil purifikasi pada gradien Percoll, disebabkan lebih banyak sel yang mati sebagai akibat sifat toksik dari Percoll. Oleh karena itu, penggunaan gradien Nycodenz yang bersifat non sitotoksik untuk isolasi dan purifikasi sel Leydig menjadi lebih baik, terutama terhadap sel Leydig yang dikultur secara in vitro.

16

Gambar 4. Sel Leydig hasil purifikasi dengan beberapa gradien perlakuan setelah

dikultur selama 3 hari (a= Percoll; b= Nycodenz I; c= Nycodenz II). Skala = 10µm.

SIMPULAN

1. Penggunaan gradien Nycodenz 5 kolom (4%,8%,10%, 12%,15%) efektif

untuk mempurifikasi sel Leydig dengan kemurnian yang sama dengan gradien Percoll, namun konsentrasi sel Leydig yang diperoleh setelah purifikasi masih rendah.

2. Gradien Nycodenz lebih efektif terjadi setelah kultur terhadap konsentrasi dan viabilitas sel Leydig dibandingkan dengan Percoll.

DAFTAR PUSTAKA

Anonimous 2012. Blue Histology: Male Reproductive System. http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/corepages/malerepro/malerepro.htm#Testes

Amersham Bioscience. 2010. Percoll : Methodology and Applications. Bilinska B, Kotula-Balak M,Sadowska, J. 2009. Morphology and function of

human Leydig cells in vitro. Immunocytochemical and radioimmunological. European J Histochem 53: 35-42.

http://www.lab.anhb/�

17

Chemes H, Cigorraga S, Bergada C, Schteingart H, Rey R, Pellizzari E. 1992. Isolation of human Leydig cell mesenchymal precursors from patients with the androgen sensitivity syndrome: Testosteron Production and response to human chorionic gonadotrophin stimulation in culture. Biol Reprod 46: 793-801.

Evans WH, Flint N. 1985. Subfraction of hepatic endosomes in Nycodenz gradients and by free electrophoresis. Biochem J 232 :25-32. Abstract.

Heller CG, Leach DR. 1971. Quantification of Leydig cells and measurement of Leydig-cell size following administration of human Chorionic Gonadotrophin to normal men. J Reprod Fert 25 : 185-192.

Manayagi T, Kurosawa R, Ohnuma K, Ueyama A, Ito K, Takahashi J. 2003. Purification of mouse primordial germ cells by Nycodenz. Reprod 125: 667-675.

Mendis-Handagama SMIC, Ariyaratne HBS. 2001. Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis. Biol Reprod 65 : 660-671.

Miller SR. 2006. Assessment of Nycodenz gradient on enrichment and culture of perinatal porcine spermatogonial stem cell. Thesis (pdf). The Graduate Faculty of North Carolina State University.

Nakayama Y, Yamamoto T, Abe S. 1999. IGF-I, IGF-II and insulin promote differentiation of spermatogonia to primary spermatocytes in organ culture of newt testes. Int J Dev Biol 43 : 343-347.

Salva A, Klinefelter GR, Hardy MP. 2001. Purification of rat Leydig cells: Increased yields after unit-gravity sedimentation of collagenase-dispersed interstitial cells. J Androl 22: 665-671

Sharpe PT. 1988. Methods of Cell Separation Vol. 18.http://books.google.co.id/ Thermo. 2012. Basic centrifugation.http://www.coleparmer.com/TechLibraryArticle Wakefield J St John, Gale JS, Berridge MV, Jordan TW ,Ford HC. 1982. Is

Percoll innocuous cells? Biochem J 202 : 795-797.

18

OPTIMASI KULTUR IN VITRO DAN ANALISIS TESTOSTERON MEDIUM KULTUR SEL LEYDIG TIKUS

HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN NYCODENZ

ABSTRAK

Penggunaan gradien Nycodenz yang bersifat non toksik untuk isolasi dan purifikasi sel Leydig belum dilakukan oleh peneliti lain. Pada penelitian ini dilakukan pengujian pengaruh penambahan hCG dan/atau ITS ke dalam medium kultur terhadap perkembangan dan proliferasi sel Leydig tikus dewasa hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz serta mendapatkan kondisi optimum kultur sel Leydig in vitro. Parameter yang diamati adalah konsentrasi, kemurnian serta viabilitas sel Leydig setelah purifikasi, proliferasi dan kemurnian sel Leydig setelah dikultur, serta nilai population doubling time (PDT) galur sel Leydig. Sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz masing-masing sebanyak 1x 106 sel/ml dikultur di dalam medium: 1) DMEM yang ditambahkan NBCS 10% (M) sebagai kontrol ; 2) M+hCG 2,5 IU/ml; 3) M+ITS (insulin 5 μg/ml, transferrin, 10 μg/ml, selenium 5 μg/ml); 4) M+hCG+ ITS. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan gradien Nycodenz menghasilkan kemurnian 91,40%, viabilitas 98,17% dengan konsentrasi 7,03 x106 sel/ml. Penambahan ITS dan kombinasi penambahan hCG dan ITS pada medium kultur menghasilkan proliferasi sel lebih tinggi yaitu 88,35% dan 90,64% dibandingkan dengan kontrol (86,82%) (p<0,05). Pemberian hCG saja tidak meningkatkan proliferasi sel (86,99%). Nilai PDT kultur primer pada medium dengan kombinasi penambahan hCG dan ITS (0,88 hari) dan penambahan ITS (0,97 hari) lebih rendah daripada medium kontrol (1,03 hari) dan medium dengan penambahan hCG saja (1,02 hari) (p<0,05). Hasil serupa juga tampak pada kultur sel Leydig galur pertama dan kedua. Semakin rendah nilai PDT menunjukkan kecepatan proliferasi yang meningkat. Pada penelitian ini, konsentrasi testosteron lebih tinggi pada penambahan hCG saja (5,06 ng/ml) ataupun kombinasi penambahan hCG dan ITS (5,25 ng/ml) dibandingkan tanpa hCG (2,46 ng/ml) dan penambahan ITS (3,19 ng/ml) (p<0,05). Dapat disimpulkan bahwa kombinasi penambahan hCG dan ITS ke dalam medium DMEM meningkatkan konsentrasi testosteron serta proliferasi sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz.

Kata kunci : Leydig,in vitro, tikus, Nycodenz, hCG, ITS, testosteron

19

ABSTRACT

The used of non toxic Nycodenz gradient to isolate and purify of Leydig cells has not been done yet by other researchers. This study was to evaluate the effect of hCG and/ ITS in DMEM medium to obtain optimum condition on Leydig cells development and proliferation after purified with Nycodenz gradient. The aim of this experiment was to obtain an optimum culture condition to produced cell line. Evaluation was done also on population doubling time (PDT). This experiment used 1 x 106 cells/ml were cultured in : 1) DMEM was supplemented with 10% NBCS (M) as a control ; 2) M supplemented with 2.5 IU/ml hCG; 3) M supplemented with ITS (5 mg/ml insulin, 10 μg/ml transferrin, 5 μg/ml selenium) ; 4) M supplemented with combination of hCG and ITS. The results showed that the higher cell proliferation was found in medium containing ITS (88.35%) and the combination with hCG (90.64%) than control (86.99%) (p<0.05). hCG supplementation did not increase the cell proliferation (86.99%). Furthermore, supplementation of the combination hCG and ITS (0.88 day) revealed faster cell growth than ITS (0.97 day), hCG (1.02 day) and control (1.03 day) (p<0.05). The cell viability and PDT on first and second cell lines have similarity with primary culture. Additional data showed that supplementation of the combination hCG and ITS produced higher testosterone concentration (5.25 ng/ml) compared with hCG (5.06 ng/ml), ITS (3.19 ng/ml) and control (2.46 ng/ml). It can be concluded that supplementation of the combination hCG and ITS are able to support higher cell proliferation and testosterone concentration. Keywords : Leydig, in vitro, rat, Nycodenz, hCG, ITS, testosterone

PENDAHULUAN

Terapi hormon androgen untuk mengobati penyakit hipogonadism yang terjadi pada pria dilakukan sebagai upaya menjaga kadar hormon testosteron normal secara fisiologis. Terapi hormon tersebut dapat meningkatkan kekuatan otot, memperbaiki osteoporosis, menstabilkan densitas tulang dan mengembalikan karakter seksual sekunder (Chen et al. 2007). Namun, pemberian hormon tersebut dalam jangka waktu yang lama dapat menyebabkan peningkatan kekentalan darah, kelainan pembentukan sel darah merah, hipertensi, stroke, perubahan densitas tulang dan perubahan emosi (Behre et al. 1997, Bhasin et al. 2003, Chen et al. 2007). Oleh karena itu perlu diupayakan terapi alternatif seperti transplantasi sel Leydig sebagai sel alami penghasil testosteron yang dapat digunakan untuk menggantikan penggunaan hormon testosteron sintetis (Chen et al. 2007). Terapi seluler ini mempunyai keterbatasan dalam hal ketersediaan

20

jaringan dan sel. Kultur sel dan produksi galur sel Leydig (cell line) diperlukan untuk mendapatkan sumber sel yang akan digunakan pada terapi seluler.

Jaringan testis terdiri dari sel somatik dan sel spermatogenik seperti sel Sertoli, sel Leydig, sel fibroblas, sel gamet jantan dalam berbagai tahapan perkembangan serta sel yang lainnya, sehingga diperlukan teknik isolasi dan purifikasi yang tepat untuk mendapatkan populasi sel Leydig yang murni. Isolasi dan purifikasi menggunakan gradien Nycodenz telah dilakukan untuk memperoleh sel Leydig (Kaiin et al. 2013). Kultur sel Leydig secara in vitro dapat menghasilkan galur dari kultur primer. Untuk memperoleh hasil kultur yang optimal perlu dilakukan penelitian untuk memperoleh kondisi optimum antara lain komposisi medium terbaik dalam mengkultur sel Leydig dengan penambahan human Chorionic Gonadotrophin (hCG) dan Insulin Transferrin Sodium Selenite (ITS) pada medium DMEM secara in vitro. Sel Leydig diduga mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti peptida, growth hormon, Interleukin-1 (IL-1) dan Interleukin- 6 (IL-6), hormon testosteron serta lainnya (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997, Hu et al. 1998) ke dalam medium kulturnya. Saez (1994) menyatakan bahwa hormon LH atau hCG sangat diperlukan untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig sehingga sel mampu memproduksi testosteron. Peningkatan konsentrasi testoteron dalam medium kultur sel Leydig manusia terjadi setelah dilakukan penambahan hCG 1 IU/ml (Chemes et al. 1992, Bilinska et al. 1997), sedangkan penambahan hCG 5 IU pada medium kultur sel Leydig kelinci muda menghasilkan kandungan testosteron dalam jumlah besar yaitu 150 ± 9 ng/ 106 sel Leydig (El-Sherbiny et al. 1994). Penambahan ITS diperlukan sebagai bahan bioaktif untuk proliferasi sel Leydig. Chemes et al.(1992) menambahkan transferrin10 µg/ml dan zat lainnya yaitu insulin dapat meningkatkan produksi testosteron oleh sel Leydig fetus mencit dalam medium kultur selama 24 dan 48 jam (Pointis et al. 1984). Bernier et al. (1983) menambahkan insulin dan transferrin masing-masing 5 µg/ml dan hCG 1 IU/ml ke dalam kultur sel Leydig anak babi menyebabkan peningkatan sintesis testosteron dibandingkan tanpa penambahan hCG. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh penambahan hCG dan/atau ITS ke dalam medium DMEM terhadap perkembangan dan proliferasi sel Leydig serta mendapatkan kondisi optimum kultur sel Leydig tikus dewasa in vitro setelah dipurifikasi dengan gradien Nycodenz .

MATERI DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi dan Laboratorium Hormon, Unit Rehabilitasi Reproduksi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor mulai dari Juni - Desember 2012.

21

Materi Penelitian

Testis diperoleh dari enam ekor tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu yang diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB. Tiga ekor untuk penelitian kultur sel, dan tiga ekor untuk penelitian produksi galur sel. Perlakuan terhadap hewan percobaan pada penelitian ini telah dilakukan dengan mengikuti kaidah ilmiah terstandar dengan memperhatikan prinsip-prinsip kesejahteraan hewan.

Metode Penelitian Penelitian dilakukan dalam tahapan :

1. Isolasi dan Purifikasi Sel Leydig 2. Kultur In Vitro dan Produksi Galur Sel 3. Uji Kandungan Testosteron dari Medium Kultur Sel Leydig.


Tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu diambil testisnya setelah dibius dengan ether dan dikorbankan dengan cara cervical dislocation. Selaput tunika albuginea dan jaringan ikat lainnya dibuang, kemudian jaringan testis ditempatkan di dalam cawan petri berisi medium Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (DPBS) tanpa Ca dan Mg (Gibco, 21600-010, Invitrogen, NY, USA). Jaringan tersebut kemudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan medium DPBS yang ditambah Newborn Calf Serum (NBCS, Gibco, 16010-159, Invitrogen, New Zealand) 0,1% (DBPS). Pengambilan jaringan testis dilakukan secara aseptis kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi satu ml collagenase type I (Sigma, C0130,St Louis, MO, USA)0,04% dan trypsin inhibitor (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 10 µg/ml dalam DPBS dan diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 34 o C selama 40 menit. Suspensi sel diencerkan sebanyak empat kali volume awal dengan medium DPBS, kemudian didiamkan selama dua menit agar sel mengendap. Cairan supernatan dikoleksi dan disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel dicuci sebanyak dua kali menggunakan medium DPBS dengan cara yang sama. Terakhir, pelet sel diencerkan dengan 500 µl medium DPBS.

Isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan gradien Nycodenz 5 kolom (4%, 8%, 10%, 12%, 15%.). Suspensi sel kemudian dimasukkan ke dalam gradient Nycodenz dan disentrifugasi menggunakan sentrifus swing rotor (Kokusan H-26F) dengan kecepatan 1500g selama 10 menit pada suhu ruang. Lapisan sel yang terbentuk kemudian dikoleksi dan dicuci berturut-turut dengan DPBS sebanyak empat kali dan medium DMEM (Sigma,

22

D5532, St Louis, MO, USA) yang ditambah serum NBCS 10% sebanyak satu kali. Pencucian dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel diencerkan dengan 500 µl medium DMEM, kemudian dilakukan penghitungan konsentrasi sel dengan menggunakan haemositometer (kamar hitung) Neubauer. Kultur In Vitro dan Produksi Galur Sel Leydig

Sel Leydig sebanyak 1 x 106 sel/ ml ditempatkan dalam cawan petri (Corning, 430165, NY USA) 35 x 10 mm dengan perlakuan medium DMEM yang ditambah dengan NBCS 10% sebagai kontrol (1); dengan hCG (Chorulon, Intervet, EU) 2,5 IU/ml (2); dengan insulin 5 μg/ml, transferrin, 10 μg/ml, Se 5 μg/ml (ITS, Sigma I3146, St Louis, MO,USA) (3) serta hCG dan ITS (4) kemudian dikultur dalam inkubator CO2 5% (Sanyo, MCO-95, Japan) dengan temperatur 37 C. Setelah dikultur selama tiga hari, dilakukan penghitungan konsentrasi dan proliferasi. Pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD dilakukan untuk menghitung kemurnian sel Leydig.

Kultur primer dari masing-masing perlakuan dipasase pada hari ke-3, setelah pencucian dengan medium DPBS lalu dihitung konsentrasinya dengan menggunakan haemositometer Neubauer. Sel kemudian dikultur kembali sampai mencapai tahap konfluen. Pasase dilakukan sebanyak dua kali dan dilakukan penghitungan Population Doubling Time (PDT) dengan rumus:

PDT (hari) =

Uji Kandungan Testosteron dari Medium Kultur Sel Leydig

Medium kultur sel Leydig dari masing-masing perlakuan dikoleksi pada hari ke-3. Sampel kemudian dibekukan pada temperatur -20oC sebelum dilakukan pengujian konsentrasi testosteron dengan menggunakan kit Testosteron ELISA (DRG Diagnostic EIA 1559). Pengujian dilaksanakan di Laboratorium Hormon, Unit Rehabilitasi Reproduksi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.


Kultur sel Leydig dilakukan sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Parameter yang diamati adalah tingkat proliferasi sel dan persentase sel Leydig pada setiap perlakuan medium kultur. Data yang diperoleh dianalisis

23

menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dan diuji secara statistik dengan ANOVA dan jika terdapat perbedaan di antara perlakuan dilanjutkan dengan uji Duncan. Produksi galur sel Leydig dilakukan sampai pasase ke-2 dengan masing-masing galur dilakukan tiga kali ulangan. Parameter yang diamati adalah data konsentrasi sel awal kultur serta konsentrasi sel akhir kultur selama tiga hari untuk menentukan PDT, serta kemurnian, viabilitas dan jumlah sel Leydig yang hidup. Pengujian kandungan testosteron di dalam medium kultur dilakukan sebanyak tiga kali ulangan pada masing-masing perlakuan.



Persentase kemurnian sel Leydig pada gradien Nycodenz diperoleh sebesar 91,40% dengan viabilitas 98,17% dan konsentrasi sel hasil purifikasi diperoleh sebesar 7,30 x 106 sel/ml (Tabel 3). Persentase kemurnian sel hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz pada penelitian ini lebih tinggi dibanding dengan hasil yang diperoleh Risbridger dan Hedger (1992) yaitu sebesar 87% dan hampir sama dengan yang diperoleh Yang et al. (2003) sebesar 95% dengan menggunakan gradien Percoll. Konsentrasi sel Leydig hasil purifikasi dengan Percoll (Kaiin et al. 2013) diperoleh hasil lebih tinggi yaitu sebesar 15,42 x 106

sel/ml. Tabel 3.Kemurnian, viabilitas dan konsentrasi sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz

Parameter

Sel Leydig

Kemurnian (%) Viabilitas (%) Konsentrasi (106 sel/ml) Jumlah hidup (106 sel/ml)

91,40 ± 5,02 98,17 ± 0,51 7,03 ± 1,04

6,30

24

Kultur In Vitro dan Produksi Galur Sel Leydig

Proliferasi sel Leydig yang dikultur dengan penambahan ITS dan kombinasi hCG dan ITS menghasilkan persentase proliferasi yang lebih tinggi yaitu sebesar 88,35% dan 90,64% (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol (86,82%) dan penambahan hCG (86,99%). (Tabel 4). Persentase sel Leydig pada akhir kultur cenderung menurun pada semua perlakuan. Insulin Transferrin Sodium Selenite (ITS) merupakan supplemen yang digunakan untuk meningkatkan proliferasi sel di dalam medium kultur. Insulin merupakan hormon polipeptida yang berfungsi membantu penyerapan glukosa dan asam amino, sedangkan transferrin merupakan protein pembawa zat besi bertujuan membantu penyerapan nutrisi sel. Selenium merupakan trace element essential yang terdapat di dalam serum.

Tabel 4. Kultur primer sel Leydig hasil isolasi dan purifikasi dengan gradient

Nycodenz Parameter Medium perlakuan M M +hCG M +ITS M+hCG+ITS Tingkatproliferasi (%) Sel Leydig (%): -Awal kultur -Akhir kultur

86,82 a 90.75 88,75

86,99a

90.75

88,25

88,35b

90.75 88.00

90,64c

90.75 88,50

Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan

perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji lanjut Duncan . M = medium mDMEM

Dari hasil pasase terlihat peningkatan jumlah sel pada akhir kultur baik pada kultur primer maupun pada galur sel pertama dan kedua (Tabel 5). Di antara perlakuan terlihat bahwa peranan hCG dan ITS meningkatkan jumlah sel Leydig dibanding dengan perlakuan lainnya.

Doubling time adalah periode waktu yang diperlukan oleh sel untuk menjadikan jumlah atau ukurannya dua kali dari jumlah atau ukuran semula (Mader 2000). Semakin cepat proses proliferasi (pembelahan) sel, maka nilai PDT yang dicapai pun akan semakin rendah. Nilai PDT kultur primer sel Leydig adalah sebesar 1,03 hari setara dengan perlakuan DMEM yang ditambah hCG (1,02 hari). Nilai PDT secara nyata (p<0,05) lebih rendah pada perlakuan DMEM yang ditambah ITS (0,97 hari) maupun kombinasi penambahan hCG dan ITS (0,88 hari). Hasil serupa terjadi pada galur sel pertama dan kedua. Hasil tersebut menunjukkan bahwa penambahan ITS, serta kombinasi penambahan hCG dan ITS menjadikan sel Leydig memerlukan waktu yang lebih singkat untuk mencapai jumlah sel menjadi dua kali. Hal tersebut mendukung fungsi ITS sebagai bahan

25

bioaktif yang dapat meningkatkan proliferasi sel. Butler (2004) menyatakan bahwa waktu yang diperlukan untuk proses pembelahan sel secara in vivo terjadi sekitar 18-24 jam. Setelah pasase, sel lebih homogen dan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan in vitro (Freshney 2005). Sel Leydig pada kultur primer memiliki persentase kemurnian yang cukup tinggi (>90%). Oleh karena itu, sel yang dikultur merupakan sel yang homogen sehingga dapat menghasilkan nilai PDT mendekati waktu proliferasi secara in vivo. Jumlah sel Leydig pada perlakuan dengan medium DMEM menurun pada galur 1 dan galur 2 (p<0,05), sehingga menghasilkan PDT lebih tinggi dari kultur primer. Hal serupa terjadi pada perlakuan lain kecuali pada galur sel 1 terjadi peningkatan jumlah sel pada perlakuan kombinasi penambahan hCG dan ITS. Penambahan ITS pada DMEM menyebabkan peningkatan jumlah sel Leydig galur kedua dibandingkan galur pertama. Pada umumnya terjadi penurunan kemampuan proliferasi sel Leydig setelah pasase sebanyak dua kali. Kombinasi penambahan hCG dan ITS meningkatkan jumlah sel pada akhir kultur pada semua galur sel, sehingga perlakuan tersebut menyebabkan kecepatan proliferasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Tabel 5. Jumlah dan PDT suspensi sel pada kultur in vitro

Galur dalam berbagai

medium

Jumlah sel awal (106)

Jumlah sel akhir (106)

PDT (hari)

Kultur primer DMEM DMEM+hCG DMEM+ ITS DMEM+hCG+ITS Galur 1 DMEM DMEM+hCG DMEM+ ITS DMEM+hCG+ITS

1 1 1 1 1 1 1 1

7,60 aA 7,69 a 8,63 b 10,69 c 6,71aAB 7,60a 8,30a 13,56b

1,03a 1,02a 0,97b 0,88c

1.09a 1,03a 0,99a 0,82b

Galur 2 DMEM DMEM+hCG DMEM + ITS DMEM +hCG+ITS

1 1 1 1

6,28aB 7,27ab 8,76b 9,17c

1,14a 1,05a 0,96b 0,94b

Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada galur sel yang sama

menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji lanjut Duncan. Huruf superskrip kapital yang berbeda pada perlakuan yang sama dengan galur sel yang berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji lanjut Duncan

26

Persentase kemurnian sel dan viabilitas tinggi ditemukan pada semua perlakuan (85-91%). Kemampuan sel Leydig berproliferasi dilihat dari jumlah sel Leydig hidup tertinggi pada kombinasi penambahan hCG dan ITS pada kultur primer, galur 1 dan galur 2 dibandingkan dengan perlakuan lainnya (Tabel 6).

Penambahan ITS, kombinasi hCG dan ITS pada medium meningkatkan jumlah sel Leydig hidup (p<0,05) pada kultur primer sebesar 6.68 x 106/ml dan 8,31 sel x 106/ml. Jumlah sel hidup galur 1 dan 2 pada semua perlakuan meningkat (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol. Perlakuan medium yang sama pada galur 1 dan 2 menurunkan jumlah sel hidup (p<0,05) dibandingkan dengan kultur primer kecuali perlakuan kombinasi penambahan hCG dan ITS pada galur 1, terjadi peningkatan jumlah sel Leydig hidup.

Tabel 6. Kemurnian,viabilitas dan jumlah sel hidup galur sel Leydig

Galur dalam berbagai medium

Konsentrasi suspensi

sel

Sel Leydig

(x106sel /ml)

Kemurnian (%)

Jumlah (x106sel/ml)

Viabilitas (%)

Sel hidup (x106sel/ml)

Kultur primer M M + hCG M + ITS M + hCG +ITS Galur Sel 1 M M + hCG M + ITS M + hCG +ITS Galur Sel 2 M M + hCG M + ITS M + hCG +ITS

7,60aA 7,69a 8,63b 10,69c 6,71aAB 7,60a 8,30a 13,56b

6,28aB 7,27ab 8,76b 9,17c

85.17

85.50A

86.67

87.00

85.67

85.33A

86.67

87.33

86.67

89.17B

90.67

91.17

6.47aA 6.58a 7.48b 9.30c

5.74aAB 6.49a 7.19a 11.84b

5.44aB 6.49ab 7.94b 8.36c

88.67A 89.00C 89.33E 89.33G 86.33A 84.00D 87.00E 88.33G 80.67B 81.67D

82.67F 83.33H

5.74aA 5.85aD 6.68bG 8.31cI 4.96aB 5.45bE 6.26cH 10.46dJ 4.39aC 5.30bF 6.57cH 6.97cK

Keterangan : Huruf superskrip kecil yang berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) pada galur sel yang sama dengan uji lanjut Duncan. Huruf superskrip kapital yang berbeda pada perlakuan yang sama dengan galur sel berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji lanjut Duncan. M = DMEM+ NBCS10%

27

Menurut Habert et al. (2001) stimulasi proliferasi prekursor sel Leydig tikus dipengaruhi oleh faktor pertumbuhan (growth factor) yaitu Transforming Growth Factor (TGF-α) dan Insulin-like Growth Factor (IGF-I). Selain itu, Platelet-derived Growth Factor (PDGF-A) yang disekresikan oleh sel Sertoli juga dibutuhkan untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig dewasa. Terjadinya penurunan jumlah sel Leydig hidup pada galur 1 dan 2 kemungkinan dipengaruhi oleh ketersediaan ketiga faktor tumbuh tersebut di dalam medium kultur.

Uji Kandungan Testosteron dari Medium Kultur Sel Leydig

Sel Leydig di dalam kultur mempunyai kemampuan mensekresikan testosteron sampai dengan 72 jam (Browning et al. 1983). Perlakuan hCG, kombinasi hCG dan ITS meningkatkan kandungan testosteron di dalam medium kultur (p<0,05) menjadi sebesar 5,06 ng/ml dan 5,25 ng/ml dibandingkan tanpa hCG (2,46 ng/ml) (Tabel 7). Hasil serupa terjadi pada kultur sel Leydig anak babi (Bernier et al. 1983). Sel Leydig yang dikultur dalam DMEM + ITS mempunyai kadar testosteron sebesar 3,19 ng/ml. Pointis et al. (1984) menyatakan bahwa penambahan insulin dalam medium kultur dapat meningkatkan akumulasi testosteron pada kultur sel Leydig fetus mencit. Luiteinizing Hormone (LH) yang disekresikan oleh hipofisa merupakan hormon yang menstimulasi steroidogenesis pada sel Leydig. Perubahan kadar LH secara in vivo dapat menggambarkan variasi kondisi fisiologis yang dapat menginduksi perubahan morfologi dan kemampuan sel Leydig mensintesis dan mensekresikan testosteron (Klinefelter et al. 1987). Hormon hCG merupakan analog dari LH sehingga dapat berikatan pada reseptor yang sama dengan reseptor LH pada sel Leydig (Renlund 2006) dan menyebabkan terjadinya sekresi testosteron. Penambahan hCG serta kombinasi penambahan hCG dan ITS ke dalam medium kultur sel Leydig menyebabkan peningkatan sekresi testosteron (5,06 ng/ml; 5,25 ng/ml) dibandingkan dengan kontrol (2,46 ng/ml) (p<0,05) (Tabel 7). Penambahan ITS tidak meningkatkan konsentrasi testosteron di dalam medium (3,19 ng/ml). Kandungan testosteron yang sedikit lebih tinggi dari kontrol tampaknya disebabkan oleh jumlah sel Leydig yang lebih banyak. Tabel 7. Hasil pengujian testosteron dalam medium kultur sel Leydig

Perlakuan Ulangan Testosteron (ng/ml) DMEM + NBCS 10% (M) 2 1,29a Sel Leydig + M 3 2,46ab Sel Leydig + M + hCG 3 5,06c Sel Leydig + M + ITS 3 3,19b Sel Leydig + M + hCG + ITS 3 5,25d Keterangan : Huruf superskrip berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan yang nyata

(p<0,05) . M= DMEM+NBCS 10%

28

Penambahan hormon NBCS 10% dalam medium DMEM menghasilkan kandungan testosteron sebesar 1,29 ng/ml (Tabel 7). Sedelaar dan Isaacs (2009) menyatakan serum sapi yang baru lahir sampai berumur satu tahun mengandung hormon testosteron dengan konsentrasi antara 1,2 sampai 7,5 ng/ml dan diuji menggunakan metoda RIA. Penambahan serum dilakukan karena mengandung beberapa komponen nutrisi seperti: asam lemak, kolesterol, T3, insulin, IGF, EGF dan androgen (Hedlund dan Miller 1994). Selain itu, penambahan serum dilakukan untuk menyediakan hormon-hormon yang menstimulasi pertumbuhan dan fungsi sel. Serum menyediakan biomatriks yang membantu proses penempelan dan penyebaran sel, serta protein transpor pembawa hormon, mineral dan lipid (Freshney 1987). Penambahan serum di dalam medium kultur dilakukan untuk menyediakan nutrisi dan faktor pertumbuhan sehingga sel yang dikultur mengalami perkembangan dan proliferasi sel.

SIMPULAN

1. Penambahan ITS terhadap medium DMEM meningkatkan proliferasi sel Leydig, sedangkan penambahan hCG meningkatkan konsentrasi hormon testosteron di dalam medium kultur sel Leydig.

2. Proliferasi sel Leydig dan konsentrasi hormon testosteron meningkat pada medium DMEM yang diberi kombinasi penambahan hCG dan ITS. Perlakuan yang sama mempercepat waktu proliferasi sel (PDT).

DAFTAR PUSTAKA

Behre HM, Kliesch S, Leifke E, Link TM, Nieschlag E. 1997. Long-term effect of

testosterone therapy on bone mineral density in hypogonadal men. J Clin Endocrin Metab 82 : 2386-2390.

Bernier M, Gibb W, Haour F, Collu R, Saez JM, Ducharme JR.1983. Studies with purified immature porcine Leydig cells in primary culture. Biol Reprod 29 : 1172 – 1178.

Bhasin S, Singh AB, Mac RP, Carter B, Lee MI, Cunningham GR. 2003. Managing the risk of prostate disease during testosterone replacement therapy in older men : recommendations for a standardized monitoring plan. J Androl 24(3): 299-311.

Bilinska B, Genissel C, Carreau S. 1997. Paracrine effect of seminiferous tubule factors on rat Leydig cell testosterone production: Role of cytoskeleton. Biol Cell 89:435-442.

Browning JY, Heindel JJ, Grotjan Jr HE. 1983. Method for primary culture of purified Leydig cells isolated from adult rat testes. J Tissue Culture Methods 7(2) : 55-58.

Butler M. 2004. Animal Cell Culture & Technology 2nd ed. London: Bios Scientific Publisher, Taylor & Francis Group.

Chen G-R, Ge R-S, Lin H, Dong L, Sottas CM, Hardy MP. 2007. Development of a cryopreservation protocol for Leydig cells. Hum Reprod 22(8) : 2160-2168.

29


Cudicini C, Lejeune H, Gomez E, Bosmans E, Ballet F, Saez J, Jegou B.1997. Human Leydigs cells and Sertoli cells are producers of Interleukin-1 and -6. J Clin Endocrin Metab 82 (5) : 1426-1433.

El-Sherbiny AM, Amin SO, Hernandez C, Carreau S. 1994. The immature rabbit testis : presence of two distinct populations of Leydig cells. World Rabbit Sci 2(4) : 141-146.

Freshney 1987. Animal Cell Culture : A practical approach. Washington: IRL Press.

Freshney RI. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Inc. Publication.

Habert R, Lejeune H, Saez JM. 2001. Origin, differentiation and regulation of fetal and adult Leydig cells. Mol Cell Endocrin 179 : 47 – 74.

Hendlund TE, Miller GJ. 1994. A serum-free defined medium capable of supporting growth of four established human prostatic carcinoma cell lines. Prostate 24(5) : 221-228.

Hu J, You S, Li W, Wang D, Nagpal ML, Mi Y, Liang P, Lin T. 1998. Expression and regulation of interferon-γ-inducible protein 10 genes in rat Leydig cells. Endocrin 139 : 3637-3645.

Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz dan kultur in vitro. J K H Unsyiah Vol.7(1) : 75-80.

Klinefelter GR, Hall PF, Ewing LL. 1987. Effect of luteinizing hormone deprivation in situ on steroidogenesis of rat Leydig cells purified by a multistep procedure. Biol Reprod 36 : 769-783.

Mader SS. 2000. Human Biology. Iowa: McGraw Hill. Pointis G, Rao B, Latreille MT, Cedard L. 1984. Hormonal regulation of

testosteron in short term primary culture of fetal mouse Leydig cells. J Steroid Biochem 20(1) : 525-528.

Renlund N. 2006. Hormonal and paracrine influences on Leydig cell steroidogenesis [dissertation]. Stockholm: Karolinska Institutet.

Risbridger GP, Hedger MP. 1992. Adult rat Leydig cell cultures: minimum requirement for maintenance of luteinizing hormone responsiveness and testosterone production. Mol Cell Endocrin 83: 125-132.

Saez JM. 1994. Leydig Cells : Endocrine, paracrine and autocrine regulation. Endocrin Rev 15(5) :574-626.

Seedelaar JPM dan Isaacs JT. 2009. Tissue culture Media Supplemented with 10% Fetal Calf Serum Contains a Castrate Level of Testosterone. Prostate 69 (16) : 1724-1729.

Yang J-M, Arnush M, Chen Q-Y, Wu X-D, Pang B, Jiang X-Z.2003. Cadmium-induced damaged to primary cultures of rat Leydig cells. Reprod Toxicol 17 : 553-560.

30

UJI BIOLOGIS CONDITIONED MEDIUM SEL LEYDIG TERHADAP DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL

SUMSUM TULANG TIKUS DEWASA

ABSTRAK

Terapi menggunakan stem cell mesenkimal sumsum tulang telah banyak dilakukan pada penyakit degeneratif. Conditioned medium (CM) dari beberapa jenis kultur sel diperkirakan mengandung berbagai bahan bioaktif yang disekresikan secara in vitro sudah diuji terhadap transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang. Penelitian ini dilakukan untuk menguji CM sel Leydig terhadap diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang. Conditioned medium dikoleksi dari kultur sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz masing-masing sebanyak 1x 106 sel/ml setelah dikultur di dalam medium: 1) DMEM + NBCS 10% (M) sebagai kontrol; 2) dengan hCG 2.5 IU/ml; 3) dengan insulin 5 μg/ml, transferrin 10 μg/ml, Selenium 5 μg/ml (ITS) serta 4) hCG dan ITS. Setelah dikultur selama tiga hari, medium dari masing-masing perlakuan diganti dengan medium DMEM tanpa serum dengan perlakuan yang sama. Conditioned medium dikoleksi pada tiga hari kemudian dan disimpan dalam temperatur -20o C. Setelah dianalisis, CM yang diperoleh dari perlakuan hCG+ITS ditetapkan untuk digunakan sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus. Masing-masing sebanyak 1x 106 sel/ml stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur di dalam medium: 1) DMEM+ NBCS 10% sebagai kontrol ; 2) dengan testosteron 10 ng/ml; 3) dengan CM sel Leydig 50% ; 4) dengan CM sel Leydig 50% dan hCG 2.5 IU/ml. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan hCG+ITS pada CM sel Leydig meningkatkan konsentrasi testosteron (0,71 ng/ml) dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Perlakuan yang sama juga meningkatkan konsentrasi protein (985,29µg/ml) yang terdapat di dalam CM dibandingkan dengan perlakuan lainnya (p<0,05). Pita protein yang dihasilkan mempunyai berat molekul (BM) mendekati 29 kDA, 62-70 kDa dan 95-130 kDa. Stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM sel Leydig bereaksi positif terhadap pewarnaan spesifik 3β-HSD menghasilkan sel Leydig (53,2%), testosteron (0,93 ng/ml) dan protein (1251,94 μg/ml). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig mampu meningkatkan konsentrasi testosteron (10,22 ng/ml) (p<0,05) dibandingkan dengan tanpa hCG. Dapat disimpulkan bahwa CM sel Leydig mampu mengarahkan stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig. Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig yang digunakan sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang meningkatkan perolehan sel Leydig dan testosteron yang disekresikan. Kata kunci : conditioned medium, sel Leydig, stem cell mesenkimal, sumsum

tulang, tikus, testosteron

31

ABSTRACT

Bone marrow mesenchymal stem cells theraphy have been carried out on degenerative diseases. Conditioned medium (CM) from several types of cultured cells contain of bioactive materials secreted in vitro. In this study were used Leydig cells conditioned medium to evaluate the ability differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Conditioned medium was collected from culture of 1x 106 cells/ml with 4 treatments, respectively: 1) DMEM supplemented with 10 % NBCS (M) as control ; 2) M supplemented with 2.5 IU/ml hCG ; 3) M supplemented with 5 µg/ml insulin, 10 µg/ml transferrin, 5 mg/ml Selenium (ITS) and 4) M supplemented with the combination of hCG and ITS. Each culture medium treatment was replaced after 3 days using DMEM without serum. Conditioned medium were collected 3 days later and analyzed for testosterone and protein concentration. The best result of treatment above was used for culture medium of bone marrow mesenchymal stem cells. The 1x 106 cells/ml bone marrow mesenchymal stem cells cultured in : 1) DMEM supplemented with 10% NBCS as control (M) , 2) M supplemented with 10 ng/ml testosterone; 3) M supplemented with 50% Leydig cells CM; 4) M supplemented with 50% Leydig cells CM and 2.5 IU/ml hCG respectively. The result showed that Leydig cells CM from combination of hCG and ITS had higher testosterone concentration (0.71 ng/ml) compared to ITS (0.69 ng/ml), hCG (0.68 ng/ml) and control (0.56 ng/ml). The similar result also showed on protein concentration. Leydig cells CM had three protein bands with molecular weight (29 kDa, 62-70 kDa and 95-130 kDa). Bone marrow mesenchymal stem cells cultured with Leydig cells CM has positive reaction to 3β-HSD specific stained for Leydig cells (53.2%) and produced testosterone (0.93 ng/ml). Supplementation of hCG to Leydig cell CM have an ability to increase testosterone production (10.22 ng/ml) and the positive number cells of Leydig cells (71.9% ) (p<0.05) compared without hCG. It can be concluded that Leydig cells conditioned medium can support differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells to Leydig cells.

Keywords : conditioned medium, Leydig cells , mesenchymal stem cells, bone marrow, rat, testosterone

PENDAHULUAN

Stem cell adalah sel yang terdapat dalam tubuh dan memiliki beberapa karakteristik yang cukup unik karena sel tersebut belum berdiferensiasi dan memiliki fungsi khusus, serta mampu memperbanyak diri sendiri menghasilkan sel yang sama dengan sel induknya (self renewal). Stem cell dapat berdiferensiasi

32

menjadi lebih dari satu jenis sel (multipoten atau pluripoten). Berdasarkan sumbernya, dapat digolongkan menjadi stem cell embrionik dan stem cell dewasa (Prentice 2003). Stem cell dewasa merupakan sel yang belum berdiferensiasi pada jaringan dan bersifat multipoten. Dapat ditemukan pada sumsum tulang, otak, pembuluh darah perifer, gastrointestinal, folikel rambut, hati, pankreas, jantung, kornea, retina, lemak dan otot skeletal. Sel tersebut berfungsi dalam memelihara dan memperbaiki kerusakan jaringan secara in vivo (Prentice 2003). Jika dibandingkan dengan stem cell embrionik, kemampuan berdiferensiasi stem cell dewasa lebih terbatas karena hanya mampu berdiferensiasi menjadi beberapa jenis sel saja serta hanya ditemukan dalam jumlah yang sedikit. Sejak dilaporkannya beberapa penelitian yang menyatakan bahwa stem cell dewasa mampu melakukan transdiferensiasi, maka harapan penggunaan stem cell dewasa khususnya stem cell mesenkimal dari sumsum tulang sebagai terapi alternatif penyakit degeneratif menjadi lebih besar. Penggunaan stem cell dewasa merupakan alternatif untuk mengatasi kendala etika penggunaan stem cell embrionik pada manusia.

Transdiferensiasi adalah perubahan sel yang irreversible dari suatu sel tertentu menjadi jenis sel lainnya (Eguizabal et al. 2013). Stem cell mesenkimal mampu berdiferensiasi menjadi sel saraf atau stem cell hematopoietik yang berdiferensiasi menjadi sel jantung merupakan contoh dari transdiferensiasi stem cell (Halim et al. 2010). Induksi transdiferensiasi stem cell mesenkimal secara langsung dari satu galur mesenkimal menjadi galur yang lain dapat dilakukan dengan mengubah faktor lingkungan mikro (Song & Tuan 2004). Stem cell mesenkimal juga mempunyai kemampuan berdiferensiasi menjadi sel yang spesifik jika dikombinasikan dengan bahan bioaktif dan stimulus diferensiasi tertentu (Caplan & Bruder 2001). Selain itu, transdiferensiasi secara in vivo juga dipengaruhi oleh lingkungan mikro dari jaringan (Phinney & Prockop 2007).

Sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan bioaktif yang bermanfaat bagi pertumbuhan sel dalam kultur. Bahan bioaktif yang dihasilkan di antaranya adalah faktor pertumbuhan (growth factor, GF) dan produk lain yang diperlukan dalam perkembangan sel di dalam kultur. Conditioned medium (CM) adalah medium yang telah digunakan untuk mengkultur sel dan diperkirakan mengandung bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel atau jaringan. Media tersebut dapat digunakan untuk menumbuhkan jenis sel yang sama ataupun yang berbeda. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui peranan faktor-faktor yang terdapat dalam CM dengan menggunakan stem cell mesenkimal sumsum tulang. Penggunaan CM kultur sel saraf untuk mengkultur stem cell mesenkimal sumsum tulang secara in vitro mampu mengarahkan sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel saraf (Djuwita et al. 2010). Diferensiasi sel saraf pada stem cell mesenkimal tikus dan manusia juga dapat diinduksi oleh DMSO, β-mercapto-ethanol atau butylated hydroxyanisole (Woodbury et al. 2000)

Sel Leydig pada tikus dewasa bukan berasal dari sel Leydig fetus tetapi berasal dari sel prekursor yang belum berdiferensiasi (Habert 2001). Progenitor sel Leydig diduga merupakan sel mesenkim karena mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal dari mesoderm embrio (Hardy et al. 1991 ) dan sel tersebut disebut sebagai stem cell mesenkimal (Ariyaratne et al. 2000). Sel Leydig terutama menghasilkan hormon testosteron, tetapi juga

33

mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti peptida, Interleukin-1 (IL-1) dan Interleukin- 6 (IL-6) (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997) ke dalam medium kulturnya. Sel Leydig diketahui juga mensekresikan beberapa faktor pertumbuhan seperti: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Epidermal Growth Factor (EGF), Fibroblast Growth Factor (FGF), Platelet-derived Growth Factor –A (PDGF-A) dan lainnya (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001, Saez 1994, Avallet et al. 1991). Yazawa et al. (2006) telah melaporkan bahwa stem cell mesenkimal sumsum tulang dapat berdiferensiasi secara in vivo menjadi sel Leydig ketika ditransplantasikan ke dalam testis. Hasil tersebut menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal rodentia mempunyai kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi sel steroidogenik yang serupa dengan sel Leydig.

Pengarahan stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig diharapkan dapat menjadi alternatif penyediaan sumber sel Leydig untuk transplantasi dan dapat menggantikan terapi testosteron sintetis yang umum dilakukan pada pria lanjut usia atau pada pasien penyakit hipogonadism. Terapi sel tersebut diharapkan dapat menghindari efek samping akibat pemberian testosteron sintetis dalam jangka waktu yang lama. Sun et al. (2009) menyimpulkan bahwa transplantasi sel Leydig dewasa pada tikus dengan penyakit hipogonadism dan dilakukan pada saat pra-pubertas mempunyai potensi terapeutik. Pengarahan sel dipengaruhi oleh kondisi lingkungan mikro stem cell mesenkimal tersebut, conditioned medium sel Leydig diduga menghasilkan bahan bioaktif yang dapat mendukung diferensiasi sel progenitor menjadi sel Leydig. Apabila pasien dalam kondisi hanya memiliki sel progenitor sel Leydig dalam jumlah yang sedikit di dalam testisnya maka kemungkinan penggunaan stem cell mesenkimal sebagai stem cell pengganti untuk menghasilkan sel Leydig perlu diketahui. Tujuan penelitian ini adalah menguji kemampuan sekreta yang dihasilkan CM sel Leydig untuk mengarahkan transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig.

MATERI DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi,

Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi; di Laboratorium Hormon, Unit Rehabilitasi Reproduksi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan di Laboratorium Reproduksi dan Kultur Sel Hewan, Puslit Bioteknologi LIPI mulai dari Desember 2012 sampai Agustus 2013.

34

Materi Penelitian

Suspensi stem cell mesenkimal sumsum tulang dikoleksi dari 3 ekor tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu yang diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB. Penyediaan conditioned medium sel Leydig dilakukan dengan mengkultur sel Leydig yang dipurifikasi dari testis yang diambil dari 3 ekor tikus jantan dewasa. Perlakuan terhadap hewan percobaan pada penelitian ini telah dilakukan dengan mengikuti kaidah ilmiah terstandar dengan memperhatikan prinsip-prinsip kesejahteraan hewan.

Metode Penelitian

Tahapan kegiatan dalam penelitian ini adalah : 1. Kultur Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan Gradien Nycodenz 2. Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari CM Sel Leydig 3. Isolasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang 4. Kultur In Vitro Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang dengan CM Sel

Leydig 5. Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari Medium Kultur Stem

Cell Mesenkimal Sumsum Tulang Setelah Dikultur dengan CM Sel Leydig

Kultur Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan GradienNycodenz

Tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu diambil testisnya setelah dibius dan dikorbankan dengan cara cervical dislocation. Selaput tunika albuginea dan jaringan ikat lainnya dibuang, kemudian jaringan testis ditempatkan di dalam cawan petri berisi medium Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (DPBS) tanpa Ca dan Mg (Gibco, 21600-010, Invitrogen, NY, USA). Jaringan tersebut kemudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan medium DPBS yang ditambah Newborn Calf Serum 0.1% (NBCS, Gibco, 16010-159, Invitrogen, New Zealand, DPBS). Pengambilan jaringan testis dilakukan secara aseptis kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi satu ml collagenase type I (Sigma, C0130,St Louis, MO, USA) 0.04% dan trypsin inhibitor (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 10 µg/ml dalam DPBS. Jaringan diinkubasi di dalam waterbath (Eyela SB-24) pada suhu 34 o C selama 40 menit. Suspensi sel diencerkan sebanyak empat kali volume awal dengan medium DPBS, kemudian didiamkan selama dua menit agar sel mengendap. Cairan

35

supernatan dikoleksi dan disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel dicuci sebanyak dua kali menggunakan medium DPBS dengan cara yang sama. Terakhir, pelet sel diencerkan dengan 500 µl medium DPBS.

Isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan metode gradien Nycodenz. Pelet sel yang telah diencerkan kemudian dimasukkan ke dalam larutan Nycodenz dengan gradien 4%, 8%, 10%, 12%, 15%. Setelah itu, larutan gradien disentrifugasi menggunakan sentrifus swing rotor (Kokusan H-26F) dengan kecepatan 1500 g selama 10 menit pada suhu ruang. Lapisan sel yang terbentuk kemudian dikoleksi dan dicuci berturut-turut dengan DPBS sebanyak empat kali dan medium DMEM (Sigma, D5532, St Louis, MO, USA) yang ditambah NBCS 10% sebanyak satu kali dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel diencerkan dengan 500 µl medium DMEM, kemudian dilakukan penghitungan konsentrasi sel dengan menggunakan hemositometer Neubauer.

Sel Leydig sebanyak 1 x 106 sel/ml ditempatkan dalam cawan petri (Corning, 430165, NY USA) berukuran 35 x 10 mm dengan perlakuan medium DMEM yang ditambah dengan 10% NBCS (M) sebagai kontrol (1); dengan 2.5 IU/ml hCG (Chorulon, Intervet, EU) (2); dengan 5 μg/ml insulin, 10 μg/ml transferrin, 5 μg/ml Se (ITS, Sigma I3146, St Louis, MO,USA) (3) serta hCG dan ITS (4) kemudian dikultur dalam inkubator 5% CO2 (Sanyo, MCO-95, Japan) dengan temperatur 37 C. Setelah dikultur selama tiga hari, medium diganti menggunakan medium DMEM tanpa penambahan serum. Pada hari ke-3, conditioned medium (CM) kemudian dikoleksi dan disterilkan dengan filter syringe (MS®CA)0,22 µm. Medium tersebut disimpan pada temperatur -200 C untuk pengujian ELISA, SDS PAGE dan spektrofotometer. Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari CM Sel Leydig

Konsentrasi testosteron dari CM sel Leydig kemudian diukur menggunakan kit Testosteron ELISA (DRG Diagnostic EIA 1559). Hasil dianalisis dengan menggunakan alat ELISA reader Biotek EL 808.

Analisis kandungan protein di dalam CM sel Leydig dilakukan dengan metode SDS PAGE menggunakan gel Poliakrilamid 12%, kemudian masing-masing sebanyak 10 µl sampel CM sel Leydig sesuai perlakuan dimasukkan ke dalam sumur gel setelah dicampurkan dengan loading buffer dengan perbandingan 1 : 2. Disamping itu, dimasukkan pula larutan ukuran baku protein sebagai marker (kontrol positif) Chromatein Prestained Protein Ladder (PR- 0602 Vivantis). Alat elektroforesis (SCIE-PLAS) dijalankan dengan kuat arus listrik 30mA, tegangan 140 V(Consort EU 261) selama 3 jam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses visualisasi protein dengan metode pewarnaan Coomassie Brilliant Blue (Phast GelTM Blue-R, Pharmacia 17-0518-01). Analisis hasil dilakukan secara deskriptif terhadap perbedaan berat molekul protein yang dihasilkan dari pita-pita pada masing-masing CM sel Leydig perlakuan dibandingkan dengan berat molekul protein standar (marker) yang digunakan.

36

Konsentrasi protein di dalam CM sel Leydig diukur dengan menggunakan alat UV spectrophotometer Shimadzu UV-1800 dengan menggunakan software UV Probe 2.42. Masing-masing sampel sebanyak 60 μl ditambahkan dengan 940 μl Protein Assay Dye Reagent (reagen Bradford, BioRad 500-0006), kemudian dimasukkan di dalam cuvet dan dilakukan pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 595 nm. Hasil pembacaan dikoreksi dengan menggunakan kurva standar linier BSA 0 μg/ml sampai 1500 μg/ml yang telah dibuat sebelumnya. Isolasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang

Sumsum tulang (bone marrow) diisolasi dari tulang femur tikus jantan dewasa Sprague Dawley berumur 8-10 minggu. Tulang tibia atau femur dibersihkan dari jaringan dan darah, kemudian pada kedua ujung pangkal dilakukan pemotongan tulang rawan. Bagian stroma tulang dibilas dengan tiga ml medium DPBS dengan menggunakan syringe satu ml dengan jarum 26G. Bilasan ditampung dalam cawan petri kaca yang steril kemudian dihomogenkan dengan mikropipet 1000 µl. Setelah homogen, suspensi dimasukkan ke dalam tabung 15 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama 10 menit. Setelah supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan tiga ml medium DPBS dan disentrifugasi ulang. Pencucian dilakukan masing-masing sebanyak dua kali menggunakan medium DPBS dan satu kali dengan medium kultur DMEM. Kemudian pelet sel diresuspensi dengan 1000 µl medium kultur DMEM. Kultur In Vitro Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang dengan CM Sel Leydig

Setelah dilakukan penghitungan konsentrasi sel, sebanyak 1 x 106 sel/ml stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur ke dalam cawan petri yang berisi medium kultur DMEM yang ditambah NBCS 10%. Pada cawan petri lainnya diberi gelas cover steril untuk pengamatan morfologi sel. Setelah 24 jam, stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur dengan perlakuan medium: 1) DMEM ditambahkan NBCS 10%; 2) dengan testosteron 10 ng/ml (Nacalay Tesque 32811-61 Kyoto, Japan); 3) dengan CM Leydig 50%; 4) dengan CM Leydig 50% dan hCG 2.5 IU/ml. Conditioned medium sel Leydig yang digunakan untuk mengkultur stem cell mesenkimal diperoleh dari perlakuan DMEM+hCG+ITS. Cawan petri dikultur di dalam inkubator CO2 5% pada temperatur 37oC. Penggantian media dilakukan setiap 48 jam dan kultur dilakukan sampai hari ke-10. Parameter yang diamati adalah morfologi sel yang tumbuh dalam kultur dan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD untuk mendeteksi sel Leydig. Analisis data dilakukan secara deskriptif terhadap perubahan morfologi sel yang terjadi. Medium kultur kemudian dikoleksi, disterilisasi dengan filter syringe serta disimpan pada temperatur -20o C untuk dilakukan pengujian ELISA dan spektrofotometer.

37

Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari Medium Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang Setelah Dikultur dengan CM Sel Leydig

Medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang perlakuan di atas kemudian dikoleksi dan digunakan untuk dilakukan pengukuran konsentrasi testosteron menggunakan kit Testosteron ELISA (DRG Diagnostic EIA 1559).

Pengukuran konsentrasi protein dengan menggunakan alat UV spectrophotometer Shimadzu UV-1800 dengan menggunakan software UV Probe 2.42.


Kultur sel Leydig dilakukan sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Conditioned medium dikoleksi dari masing-masing perlakuan untuk dilakukan analisis testosteron, protein dan SDS PAGE. Data yang diperoleh kemudian diuji secara statistik dengan uji ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan. Hasil SDS PAGE dianalisis secara deskriptif. Conditioned medium terpilih yaitu hasil perlakuan penambahan hCG dan ITS kemudian diperbanyak untuk digunakan pada penelitian selanjutnya.

Kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dilakukan sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Parameter yang diamati adalah morfologi sel dan reaksi terhadap pewarnaan histokimia 3β-HSD. Analisis kandungan testosteron dan protein dilakukan dari setiap perlakuan dengan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh kemudian diuji secara statistik dengan uji ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan.


Analisis CM Sel Leydig

Conditioned medium (CM) sel Leydig dari empat perlakuan menghasilkan konsentrasi testoteron sebesar 0,56 sampai 0,71 ng/ml. Penambahan hCG dan ITS menghasilkan testosteron yang lebih banyak dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Penambahan hCG (601,66µg/ml), ITS (572,08 µg/ml) maupun hCG+ITS (985,29 µg/ml) meningkatkan konsentrasi protein di dalam conditioned medium sel Leydig dibandingkan dengan kontrol (436,92 µg/ml) (p<0,05) Tabel 8.

38

Tabel 8. Analisis konsentrasi testosteron dan protein dari conditioned medium sel Leydig

Conditioned medium sel Leydig dari

perlakuan: Testoteron (ng/ml) Protein

(μg/ml) DMEM+ NBCS 10% 0,56 436,92 a DMEM+ hCG 2.5 IU/ml 0.68 601,66 b DMEM+ ITS (insulin 5 μg/ml, transferrin, 10 μg/ml,Se 5 μg/ml)

0.69 572,08 c

DMEM+hCG+ITS 0.71 985,29 d Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan

perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji statistik Duncan.

Hasil analisis protein dengan SDS PAGE terhadap CM sel Leydig ditampilkan pada Gambar 5. Conditioned medium sel Leydig pada penelitian ini menghasilkan pita protein antara berat molekul (BM) mendekati 29 kDa, 62–70 kDa dan 95-130 kDa.

Gambar 5. Hasil analisis SDS PAGE terhadap conditioned medium kultur sel

Leydig

Sel Leydig merupakan sel yang memproduksi hormon testosteron di dalam tubuh hewan jantan. Berdasarkan penelitian sebelumnya, perlakuan kultur sel Leydig dengan medium DMEM yang ditambahkan dengan serum, ITS dan hCG menghasilkan konsentrasi testosteron yang paling tinggi sebesar 5,25 ng/ml (Kaiin et al 2013). Pada penelitian ini, kandungan testosteron dari conditioned medium (CM) kultur sel Leydig yang diberi perlakuan hCG dan ITS juga menunjukkan konsentrasi testoteron yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Bilinska et al (2009) menyatakan bahwa sel Leydig manusia hasil pemurnian dengan Percol secara in vitro menghasilkan testosteron sebanyak 5,76 ng/106 sel dalam waktu 24 jam dan dengan penambahan hCG mampu meningkatkan produksi testosteron menjadi 9,83 ng/106 sel Pada penelitian lain, sel Leydig yang dikultur secara in vitro menghasilkan testosteron

39

sebesar 3,5 ng/106 sel, dan dengan penambahan hCG di dalam medium menghasilkan testosteron sebesar 4,5ng/106 sel ( Risbridger et al. 1981).

Protein dengan BM mendekati 29 kDa pada CM kultur sel Leydig diperkirakan adalah Interleukin 1 (IL-1). Menurut Saez (1994), IL-1 memiliki berat molekul yang bervariasi antara 10-30 kDa. Protein lainnya yang terdeteksi berdasarkan SDS PAGE memiliki BM yang cukup besar yaitu antara 62- 70 kDa dan 95-130 kDa. Lakshmanan et al. (1990) menemukan EGF yang dideteksi dari urin mencit dewasa mempunyai berat molekul 66 dan 56 kDa, sedangkan pro-EGF mempunyai berat molekul 165 kDa. TGF-β merupakan famili dari polipeptida berukuran 25 kDa yang terdistribusi dan disintesis oleh sel yang berbeda-beda (Lawrence 1995 dalam Kropf et al. 1997), pada penelitian ini tidak ditemukan protein dengan berat molekul tersebut. Di dalam testis, EGF berfungsi untuk menstimulasi sintesis androgen, demikian juga hal yang sama terjadi pada kondisi in vitro (Suarez-Quian & Niklinski 1990). PDGF-A merupakan faktor penting dalam proses diferensiasi sel Leydig, tetapi bagaimana mekanismenya belum banyak diketahui (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001). Selain faktor pertumbuhan tersebut masih banyak faktor lain yang disekresikan oleh sel Leydig seperti: Corticotropin-releasing factor (CRF), Arginin-vasopressin (AVP), oxytocin (OT), Angiotensin-II (A-II) dan peptida lainnya (Saez 1994). Diperlukan penelitian lanjutan untuk menentukan protein yang dihasilkan dalam gambaran hasil SDS PAGE pada penelitian ini.

Uji Biologis CM Sel Leydig Terhadap Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang

Transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang diuji dengan

menggunakan CM sel Leydig. Hasil menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal yang dikultur dengan CM sel Leydig bereaksi positif dengan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD untuk mendeteksi sel Leydig (Gambar 6c), menghasilkan sel Leydig sebesar 53,2 % dan hasil tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (4,5%) maupun DMEM yang ditambahkan testosteron (20,5%) (p<0,05). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig meningkatkan perolehan sel Leydig (71,9%) (p<0,05). Perlakuan CM Leydig menghasilkan testosteron dan protein di dalam medium kultur stem cell mesenkimal (Tabel 9). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig meningkatkan konsentrasi testosteron (10,22 ng/ml) (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol (2,01 ng/ml) dan CM Leydig saja (0,93 ng/ml). Penambahan testosteron ke dalam medium kultur juga menghasilkan sel yang positif terhadap pewarnaan 3β-HSD (Gambar 6b).

40

Tabel 9. Kultur in vitro stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan perlakuan conditioned medium kultur sel Leydig serta analisis konsentrasi testosteron dan protein di dalam medium kultur.

Perlakuan Pewarnaan

3 β-HSD Sel Leydig

(%) Testoteron

(ng/ml) Protein (μg/ml)

DMEM + NBCS 10% +/- 4,5a 2.01 a 1770,29 a

DMEM+testosteron10 ng/ml ++ 20,5b 4.85 a 1285,39 b

DMEM+ CML50% +++ 53,2c 0.93 a 1251,94 c

DMEM+CML50%+ hCG2.5 IU/ml

+++ 71,9d 10.22b 799,01d

Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji lanjut Duncan.

Gambar 6. Kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus yang diwarnai

dengan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD. Keterangan : a. DMEM+ NBCS 10%; b.DMEM+testosteron 10 ng/ml; c. DMEM+ CM Leydig 50%; d. DMEM+CM Leydig 50%+ hCG 2.5 IU/ml. Skala = 20 µm

Berdasarkan pengamatan morfologi sel, tampak ada perbedaan morfologi sel dari ketiga perlakuan (Gambar 7 b,c,d) dibandingkan dengan kontrol (Gambar 7a). Stem cell mesenkimal yang dikultur dengan CM kultur sel Leydig menghasilkan morfologi sel yang memiliki penjuluran yang lebih banyak dibandingkan dengan kultur stem cell mesenkimal tanpa perlakuan. Karakterisasi stem cell mesenkimal dapat dilakukan berdasarkan molekul protein permukaan (Cluster of Differentiation, CD) dan terdapat beberapa molekul protein permukaan pada stem cell mesenkimal di antaranya adalah CD73, CD90 dan CD105 (Halim et al. 2010). Transdiferensiasi stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig akan menyebabkan terjadinya perubahan pada molekul protein permukaan.

41

Gambar 7. Morfologi stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur secara

in vitro. Keterangan : a.DMEM+NBCS 10%; b. DMEM+ testosteron 10 ng/ml; c. DMEM+ CM Leydig 50%; d.DMEM+CM Leydig 50% +hCG 2.5 IU/ml hCG. Skala= 10 µm. Keterangan: menunjukkan penjuluran sel

Kemampuan stem cell mesenkimal sumsum tulang mengalami

transdiferensiasi menjadi sel Leydig pada penelitian ini dilakukan berdasarkan bahwa sel Leydig dewasa berasal dari stem cell mesenkimal yang merupakan galur sel Leydig di dalam testis karena sel tersebut dapat mengekspresikan beberapa marker spesifik seperti 3β-HSD, reseptor LH dan produksi androgen (Ariyaratne et al. 2000). Menurut Djuwita et al. (2010), stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur selama 24 jam morfologi selnya berbentuk poligonal dan berbentuk seperti fibroblas (fibroblast-like cell). Hal yang sama terjadi pada kelompok kontrol (Gambar 7 a). Pada penelitian ini, kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM kultur sel Leydig menunjukkan perbedaan morfologi sel yaitu lebih banyak juluran pada selnya (Gambar 7 c,d) dan setelah diidentifikasi dengan pewarnaan spesifik 3 β – HSD menghasilkan reaksi yang positif (Gambar 6 c,d). Mendis-Handagama & Ariyaratne (2001) menyatakan bahwa pewarna spesifik 3 β – HSD positif pada galur sel Leydig dimulai dari progenitor sel sampai sel Leydig dewasa. Pewarna tersebut akan negatif jika sel masih dalam tahap stem cell mesenkimal. Perubahan morfologi stem cell mesenkimal sumsum tulang tersebut kemungkinan merupakan proses transdiferensiasi menjadi sel Leydig. Transdiferensiasi sangat dipengaruhi oleh lingkungan mikro di sekitar sel, dengan adanya CM kultur sel Leydig di dalam medium yang memiliki kandungan bahan bioaktif seperti testosteron, faktor pertumbuhan dan protein yang disekresikan oleh sel Leydig menciptakan kondisi lingkungan untuk mendukung transdiferensiasi sel Leydig dari stem cell mesenkimal yang dikultur. Sifat stem cell mesenkimal yang multipoten dan didukung oleh lingkungan mikronya kemungkinan mengakibatkan terjadinya proses tersebut. Penelitian Wu et al. (2012) yang mengkultur stem cell sumsum tulang manusia dengan medium yang mengandung, LH, hCG, IL-1α dan PDGF menghasilkan sel yang bertransdiferensiasi menjadi sel steroidogenik (sel Leydig)

42

secara in vitro. Hasil tersebut mendukung penelitian ini karena diduga di dalam CM sel Leydig mengandung kedua faktor pertumbuhan tersebut, sehingga dapat menginduksi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig yang dapat mensekresikan testosteron.

Androgen berperan dalam diferensiasi sel Leydig Rodentia (Habert et al. 2001), demikian juga proses diferensiasi progenitor sel Leydig menjadi sel Leydig dewasa secara in vitro dipengaruhi oleh LH dan dihidrotestosteron (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001). Chemes et al. (1992) menyatakan bahwa stem cell mesenkimal dari pasien yang awalnya tidak sensitif terhadap androgen, jika dikultur dalam medium dengan penambahan hCG akan berdiferensiasi dan memproduksi testosteron, selain itu jumlah testosteron yang disekresikan oleh sel prekursor mesenkimal lebih rendah dibandingkan dengan kultur sel Leydig tikus dan manusia. Aktivitas 3 β- HSD dan produksi testosteron meningkat ketika hCG ditambahkan ke dalam medium kultur. Hal tersebut terjadi karena penambahan LH atau hCG diperlukan dalam proses perbanyakan dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994). Penambahan hCG pada medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan perlakuan CM sel Leydig menghasilkan testosteron dengan konsentrasi tertinggi dibandingkan dengan perlakuan lain dan kontrol, tetapi menghasilkan konsentrasi protein yang lebih rendah. Hasil tersebut kemungkinan disebabkan adanya hCG yang menginduksi sel Leydig untuk lebih banyak mensekresikan testosteron daripada protein (Tabel 9).

Pada penelitian ini, kultur stem cell mesenkimal yang dikultur dengan medium mengandung testosteron juga menghasilkan sel yang bereaksi positif (20,5 %) terhadap pewarnaan 3 β-HSD. Terjadi peningkatan testosteron sebesar 4,85 ng/ml dibandingkan dengan yang ditambahkan ke dalam medium yaitu sebesar 10 ng/ml. Hasil ini membuktikankan bahwa androgen (testosteron) juga dapat berperan dalam proses diferensiasi stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig.

Penambahan serum dilakukan sebagai tambahan nutrisi seperti asam lemak esensial dan kolesterol serta beberapa faktor seperti : IGF, EGF dan protein lainnya. Seedelar & Isaacs (2009) melaporkan bahwa terdapat kandungan testosteron di dalam bovine serum sebesar 1,2 -7,5 ng/ml terutama pada serum yang dikoleksi pada saat setelah kelahiran sampai umur 1 tahun. Penemuan sel (4,5%) yang bereaksi positif terhadap 3 β- HSD di dalam kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang pada kelompok kontrol kemungkinan disebabkan adanya hormon testosteron atau faktor lainnya di dalam serum yang digunakan.

SIMPULAN

1. Conditioned medium kultur sel Leydig mengandung testosteron dan protein lainnya yaitu dengan BM mendekati 29 kDa, 62–70 kDa dan 95-130 kDa.

2. Penggunaan CM Leydig sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang menghasilkan sel yang positif terhadap pewarnaan spesifik 3β-HSD (sel Leydig), morfologi sel yang berbeda serta testosteron.

43

3. Penambahan hCG bersama-sama dengan CM kultur sel Leydig mampu meningkatkan jumlah sel Leydig dan sekresi testosteron di dalam medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang.

4. CM sel Leydig dapat mengarahkan stem cell mesenkimal sumsum tulang mengalami transdiferensiasi menjadi sel Leydig.

DAFTAR PUSTAKA

Ariyaratne HBS, Mendis-Handagama SMLC, Hales DB, Mason JI. 2000. Studies on the onset of Leydig precursor cell differentiation in the prepubertal rat testis. Biol Reprod 63 : 165-171.

Avallet O, Vigier M, Chatelain PG, Saez JM. 1991. Regulation by growth factor of Leydig cell differentiated functions. J Steroid Biochem Mol Biol 40(1-3) : 453 – 464.

Bilinska B, Kotula-Balak M, Sadowska. 2009. Morphology and function of human Leydig cells in vitro. Immunocytochemical and radioimmunological analyses. European J Histochem 53(1) : 35-42.

Caplan AI, Bruder SP. 2001. Mesenchymal stem cells: building block for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med 7(6) : 259-264.

Chemes H, Cigorraga S, Bergada C, Schteingart, Rey R, Pellizzari. 1992. Isolation of human Leydig cell mesenchymal precursors from patients with the androgen insensitivity syndrome: testosterone production and response to human chorionic gonadotropin stimulation in culture. Biol Reprod 46 : 793-801.

Cudicini C, Lejeune H, Gomez E, Bosmans E, Ballet F, Saez J, Jegou B. 1997. Human Leydig cells and Sertoli cells are producers of Interleukins-1 and -6. J Clin Endocrin Metab 82 (5) : 1426-1433.

Djuwita I, Mohamad K, Prasetyaningtyas WE, Nurhidayat. 2010. In vitro differentiation of adult rat bone marrow stromal cells into neurons using conditioned medium of newborn rat neuron primary culture. The Proceedings of the first Congress of South East Asia Veterinary School Association. Bogor, Indonesia. Hal 51-52.

Eguizabal C, Montserrat N, Veiga A, Belmonte JCI. 2013. Dedifferentiation, transdifferentiation and reprogramming: Future direction in regenerative medicine. Sem Reprod Med 31: 82-94.

Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono, dan Setiawan B. 2010. Stem Cell. Dasar teori dan aplikasi klinis. Jakarta. Erlangga.

Habert R, Lejeune H, Saez JM. 2001. Origin, differentiation and regulation of fetal and adult Leydig cells. Mol Cell Endocrin 179 : 47-74

Hardy MP, Kelce WR, Klinefelter GR, Ewing LL. 1990. Differentiation of Leydig cell precursors in vitro : a role for androgen. Endocrin 127: 488-490.

44

Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Development of in vitro culture of rat Leydig cells after purification with Nycodenz gradient. Open J Anim Sci 3 (4) : 299-304.

Kropf J, Schurek JO, Wollner A, AM Gressner. 1997. Imunological measurement of transforming growth factor- beta I (TGF-βI) in blood, assay, development and comparison. Clin Chem 43(10) : 1965-1975.

Lakshmanan J, Salido EC, Lam R, Barrjas L, Fisher DA. 1990. Identification of pro-epidermal growth factor and high molecular weight EGF in adult mouse urine. Biochem Biophysic Res Comm 173 (3) : 902-911.

Mendis-Handagama SMLC, Ariyaratne HBS. 2001. Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis. Biol Reprod 65 : 660-671.

Phinney DG, Prockop DJ. 2007. Concise Review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells : The state of transdifferentiation and modes of tissue repair-Current views. Stem Cells 25: 2896-2902.

Prentice DA. 2003. Stem Cells and Cloning. San Francisco. Pearson Education Inc.

Risbridger GP, Kerr JB, Peake R, Rich KA, de Kretser DM. 1981. Temporal changes in rat Leydig cell function after the induction of bilateral cryptorchidism. J Reprod Fertil 63 : 415-423.

Saez JM. 1994. Leydig cells: endocrine, paracrine, and autocrine regulation. Endocrine Rev 15(5): 574-626.

Sedelaar JPM, Isaacs JT. 2009. Tissue culture media supplemented with 10% Fetal Calf Serum contains a castrate level of testosterone. Prostate 69 (16) : 1724-1729.

Song L, Tuan RS. 2004. Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cell derived from bone marrow. FASEBJ 18 : 980-982.

Suarez-Quian, Niklinski. 1990. Immunocytochemical localization of EGF receptor in mouse testis. Biol Reprod 43 : 1087-1097.

Sun J, Xi Y-B, Zhang Z-D, Shen P, Li H-Y, Yin M-Z, Li W-Y, Shi C-R. 2009. Leydig cell transplantation restores androgen production in surgically castrated prepubertal rats. Asian J Androl 11: 405-409.

Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. 2000. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res 61: 364-371.

Wu YJ, Dong Q, Li SF, Wei X, Long D, Zeng Y. 2012. Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into Leydig or steroidogenic cells in vitro. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 43(4):493-7, 506.(Abstract).

Yazawa T, Mizutani T, Yamada K, Kawata H, Sekiguchi T, Yoshino M, Kajitani T, Shou Z, Umezawa A, Miyamoto K. 2006. Differentiation of adults stem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells. Endocrin 147(9) : 4104-4111.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22997882�

45

PEMBAHASAN UMUM

Sel Leydig merupakan sel yang berperan dalam proses reproduksi jantan karena menghasilkan hormon testosteron sehingga kekurangan hormon testosteron di dalam tubuh jantan dapat menghambat proses spermatogenesis. Kelainan atau kegagalan reproduksi pada jantan seperti penyakit hipogonadism dapat diatasi dengan terapi seluler menggunakan sel Leydig sebagai sumber sel penghasil hormon testosteron yang dapat ditransplantasikan ke dalam testis.

Penyediaan sumber sel Leydig dapat dilakukan dengan cara biopsi dari pasien, namun hal tersebut hanya menghasilkan sel Leydig dalam jumlah terbatas. Untuk memurnikan sel Leydig dilakukan dengan beberapa metode, salah satu metode yang sederhana dan bersifat non toksik terhadap sel Leydig adalah pemurnian dengan gradien Nycodenz. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan gradien Nycodenz II (4%, 8%, 10%, 12%, 15%) efektif untuk mempurifikasi sel Leydig dengan menghasilkan kemurnian dan viabilitas sel yang setara dengan penggunaan gradien Percoll. Sel Leydig yang diperoleh dari purifikasi dengan gradien Nycodenz juga menghasilkan viabilitas sel yang lebih tinggi setelah dikultur. Hasil tersebut menunjukkan bahwa Nycodenz bersifat non toksik terhadap sel Leydig dibandingkan dengan Percoll.

Penambahan ITS ke dalam medium kultur sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz meningkatkan proliferasi sel yang dikultur, sedangkan penambahan hCG meningkatkan sekresi testosteron di dalam medium kultur. Kombinasi ITS dan hCG ternyata dapat meningkatkan proliferasi sel dan konsentrasi testosteron di dalam medium kultur. Penambahan ITS serta kombinasi hCG dan ITS menjadikan sel Leydig yang dikultur memerlukan waktu yang lebih singkat untuk mencapai jumlah sel menjadi dua kali (PDT). Demikian juga pada setiap galur diperoleh jumlah sel yang hidup lebih tinggi dibandingkan perlakuan lainnya.

Pada umumnya, terjadi penurunan kemampuan proliferasi sel Leydig setelah pasase sebanyak dua kali. Hasil tersebut dipengaruhi oleh ketersediaan faktor tumbuh, protein dan bahan bioaktif lainnya yang terdapat di dalam medium kultur. Produksi testoteron oleh sel Leydig secara in vivo memerlukan induksi dari LH. Pada penelitian ini digunakan hCG yang bersifat analog terhadap LH. Berdasarkan hasil tampak dengan penambahan hCG ke dalam medium kultur sel Leydig mampu meningkatkan sekresi testosteron, sedangkan peningkatan kandungan testoteron pada perlakuan penambahan ITS disebabkan jumlah sel Leydig yang lebih banyak.

Medium DMEM merupakan medium yang umum digunakan untuk mengkultur sel mamalia. Medium tersebut mengandung asam amino esensial dan non esensial, mineral dan vitamin sebagai suplemen. Selain itu, dilakukan penambahan natrium bikarbonat untuk mempertahankan pH dan osmolaritas medium. Ketersediaan bahan bioaktif di dalam medium kultur seperti : faktor pertumbuhan, hormon dan protein lainnya diperlukan sebagai nutrisi untuk pertumbuhan sel. Beberapa faktor pertumbuhan sering ditambahkan ke dalam medium kultur sel untuk memperoleh kondisi yang optimal. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa sel yang dikultur dapat mensekresikan berbagai

46

faktor pertumbuhan dan produk metabolit lainnya yang diperlukan oleh sel. Pada penelitian ini dilakukan upaya deteksi produk yang disekresikan oleh sel Leydig yaitu testosteron dan protein lainnya. Berdasarkan hasil yang diperoleh tampak bahwa testosteron ditemukan pada medium maupun conditioned medium kultur sel Leydig. Protein yang dapat dideteksi adalah protein dengan BM mendekati 29 kDa, 62-70 kDa dan 95-130 kDa. Protein tersebut diduga merupakan beberapa faktor pertumbuhan yang disekresikan oleh sel Leydig.

Keterbatasan jumlah sel Leydig hasil biopsi dapat diatasi dengan mengarahkan stem cell sumsum tulang menjadi sel Leydig. Progenitor sel Leydig merupakan stem cell mesenkimal yang mempunyai morfologi yang sama dengan stem cell mesenkimal sumsum tulang. Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan pengujian apakah stem cell mesenkimal sumsum tulang belakang dapat diarahkan diferensiasinya menjadi sel Leydig secara in vitro dengan menggunakan CM sel Leydig. Hasil menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal yang dikultur di dalam medium yang mengandung CM sel Leydig dapat dideteksi adanya sel yang bereaksi positif terhadap pewarnaan histokimia 3β-HSD yaitu pewarnaan spesifik yang digunakan untuk mendeteksi sel Leydig. Perbedaan morfologi juga tampak dengan ditemukannya sel yang memiliki penjuluran, sedangkan stem cell mesenkimal pada umumnya berbentuk seperti fibroblas (fibroblast-like cells). Penambahan hCG ke dalam conditioned medium sel Leydig yang digunakan untuk mengkultur stem cell mesenkimal, dapat meningkatkan jumlah sel positif dan konsentrasi testosteron di dalam medium kultur. Penemuan sel yang positif terhadap pewarnaan 3β-HSD dan ditemukannya kandungan testosteron di dalam medium kultur tersebut menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal sumsum tulang telah mengalami transdiferensiasi menjadi sel Leydig. Meskipun demikian diperlukan marka yang lebih spesifik lagi seperti marka yang digunakan untuk mendeteksi protein permukaan (CD) dan marka molekuler yang dapat digunakan untuk mendeteksi sel Leydig.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

1. Hasil purifikasi dan kultur in vitro memperlihatkan bahwa Nycodenz II (5 kolom) efektif untuk purifikasi sel Leydig.

2. Kombinasi penambahan ITS dan hCG meningkatkan konsentrasi testosteron di dalam medium kultur sel Leydig

3. Penggunaan CM sel Leydig sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dapat mengarahkan diferensiasi menjadi sel Leydig (transdiferensiasi).

47

Saran

1. Untuk meningkatkan perolehan jumlah sel Leydig yang dipurifikasi dengan gradien Nycodenz diperlukan kombinasi rentang konsentrasi gradien Nycodenz yang lebih kecil.

2. Peningkatan jumlah sel hidup pada produksi galur sel Leydig memerlukan modifikasi medium kultur dengan menambahkan faktor pertumbuhan lainnya seperti Transforming Growth Factor (TGF-α), Insulin-like Growth Factor (IGF-I) dan Platelet-derived Growth Factor (PDGF-A).

3. Produk conditioned medium kultur sel Leydig memerlukan standarisasi produksi dan analisis kandungan bahan bioaktif yang lebih spesifik sehingga dapat digunakan sebagai medium standar untuk pengarahan stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig.

4. Perlu dilakukan kajian lanjutan untuk membuktikan adanya transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig dengan menggunakan karakterisasi molekul protein permukaan stem cell (CD) dan juga dengan bantuan marka molekuler.

48

DAFTAR PUSTAKA

Amersham Bioscience. 2010. Percoll : Methodology and Applications. Anonimous 2012. Blue Histology: Male Reproductive System.

http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/corepages/malerepro/malerepro.htm#Testes

Ariyaratne HBS, Mendis-Handagama SMLC, Hales DB, Mason JI. 2000. Studies on the onset of Leydig precursor cell differentiation in the prepubertal rat testis. Biol Reprod 63 : 165-171.

Avallet O, Vigier M, Chatelain PG, Saez JM. 1991. Regulation by growth factor of Leydig cell differentiated functions. J Steroid Biochem. Molec Biol 40(1-3) : 453 – 464.

Behre HM, Kliesch S, Leifke E, Link TM, Nieschlag E. 1997. Long-term effect of testosterone therapy on bone mineral density in hypogonadal men. J Clin Endocrinol Metab 82 : 2386-2390.

Bernier M, Gibb W, Haour F, Collu R, Saez JM, Ducharme JR.1983. Studies with purified immature porcine Leydig cells in primary culture. Biol Reprod 29 : 1172 – 1178.

Bhasin S, Singh AB, Mac RP, Carter B, Lee MI, Cunningham GR. 2003. Managing the risk of prostate disease during testosterone replacement therapy in older men : recommendations for a standardized monitoring plan. J Androl 24(3): 299-311.

Bilinska B, Genissel C, Carreau S. 1997. Paracrine effect of seminiferous tubule factors on rat Leydig cell testosterone production: Role of cytoskeleton. Biol Cell 89:435-442.

Bilinska B, Kotula-Balak M,Sadowska J. 2009. Morphology and function of human Leydig cells in vitro. Immunocytochemical and radioimmunological. European J Histochem 53 (1) : 35-42.

Browning JY, Heindel JJ, Grotjan Jr HE. 1983. Method for primary culture of purified Leydig cells isolated from adult rat testes. J Tissue Culture Methods 7(2) : 55-58.

Butler M. 2004. Animal Cell Culture & Technology 2nd ed. London: Bios Scientific Publisher, Taylor & Francis Group.

Caplan AI, Bruder SP. 2001. Mesenchymal stem cells: building block for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med 7(6) : 259-264.


Chen G-R, Ge R-S, Lin H, Dong L, Sottas CM, Hardy MP. 2007. Development of a cryopreservation protocol for Leydig cells. Hum Reprod 22(8) : 2160-2168.

Cudicini C, Lejeune H, Gomez E, Bosmans E, Ballet F, Saez J, Jegou B.1997. Human Leydigs cells and Sertoli cells are producers of Interleukin-1 and -6. J Clin Endocrin Metab 82 (5) : 1426-1433.

http://www.lab.anhb/�

49

Djuwita I, Mohamad K, Prasetyaningtyas WE, Nurhidayat. 2010. In vitro differentiation of adult rat bone marrow stromal cells into neurons using conditioned medium of newborn rat neuron primary culture. The Proceedings of the first Congress of South East Asia Veterinary School Association. Bogor, Indonesia. Hal 51-52.

Eguizabal C, Montserrat N, Veiga A, Belmonte JCI. 2013. Dedifferentiation, transdifferentiation and reprogramming: Future direction in regenerative medicine. Semin Reprod Med 31: 82-94.

El-Sherbiny AM, Amin SO, Hernandez C, Carreau S. 1994. The immature rabbit testis : presence of two distinct populations of Leydig cells. World Rabbit Sci 2(4) : 141-146.

Evans WH, Flint N. 1985. Subfraction of hepatic endosomes in Nycodenz gradients and by free electrophoresis. Biochem J 232 :25-32. Abstract

Freshney 1987. Animal Cell Culture : A practical approach. Washington: IRL Press.

Freshney RI. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Inc. Publication.

Ge R-S, Dong Q, Sottas CM, Chen H, Zirkin BR, Hardy MP. 2005. Gene expression in rat Leydig cells during development from the progenitor to adult stage : a cluster analysis. Biol Reprod 72 : 1405-1415.

Gruenewald DA, Matsumoto AM. 2003. Testosterone Supplementation Therapy for Older Men: Potential Benefits and Risks. J American Geriatrics Soc 51(1):101-115

Habert R, Lejeune H, Saez JM. 2001. Origin, differentiation and regulation of fetal and adult Leydig cells. Mol Cell Endocrin 179 : 47-74

Hardy MP, Kelce WR, Klinefelter GR, Ewing LL. 1990. Differentiation of Leydig cell precursors in vitro : a role for androgen. Endocrin 127: 488-490

Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono, dan Setiawan B. 2010. Stem Cell: Dasar teori dan aplikasi klinis. Jakarta. Erlangga

Heller CG, Leach DR. 1971.Quantification of Leydig cells and measurement of Leydig-cell size following administration of human Chorionic Gonadotrophin to normal men. J Reprod Fert 25 : 185-192.

Hendlund TE dan Miller GJ. 1994. A serum-free defined medium capable of supporting growth of four established human prostatic carcinoma cell lines. Prostate 24(5) : 221-228.

Hu J, You S, Li W, Wang D, Nagpal ML, Mi Y, Liang P, Lin T. 1998. Expression and regulation of interferon-γ-inducible protein 10 genes in rat Leydig cells. Endocrin 139 : 3637-3645.

Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz dan kultur in vitro. J K H Unsyiah Vol.7(1) : 75-80.

Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Development of in vitro culture of rat Leydig cells after purification with Nycodenz gradient. Open J Anim Sci 3 (4) : 299-304.

Klinefelter GR, Hall PF dan Ewing LL. 1987. Effect of luteinizing hormone deprivation in situ on steroidogenesis of rat Leydig cells purified by a multistep procedure. Biol Reprod 36 : 769-783.

50

Kropf J, Schurek JO, Wollner A, AM Gressner. 1997. Imunological measurement of transforming growth factor- beta I (TGF-βI) in blood, assay, development and comparison. Clin Chem 43(10) : 1965-1975.

Lakshmanan J, Salido EC, Lam R, Barrjas L, Fisher DA. 1990. Identification of pro-epidermal growth factor and high molecular weight EGF in adult mouse urine. Biochem Biophys Res Commun 173 (3) : 902-911.

Mader SS. 2000. Human Biology. Iowa: McGraw Hill. Manayagi T, Kurosawa R, Ohnuma K, Ueyama A, Ito K, Takahashi J.2003.

Purification of mouse primordial germ cells by Nycodenz. Reprod 125: 667-675.

Mendis-Handagama SMIC, Ariyaratne HBS. 2001. Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis. Biol Reprod 65 : 660-671.

Miller SR. 2006. Assessment of Nycodenz gradient on enrichment and culture of perinatal porcine spermatogonial stem cell. Thesis (pdf). The Graduate Faculty of North Carolina State University.

Nakayama Y, Yamamoto T, Abe S. 1999. IGF-I, IGF-II and insulin promote differentiation of spermatogonia to primary spermatocytes in organ culture of newt testes. Int J Dev Biol 43 : 343-347.

Phinney DG, Prockop DJ. 2007. Concise Review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells : The state of transdifferentiation and modes of tissue repair-Current views. Stem Cells 25: 2896-2902.

Prentice DA.2003.Stem Cells and Cloning. San Francisco. Pearson Education Inc. Pointis G, Rao B, Latreille MT, Cedard L. 1984. Hormonal regulation of

testosteron in short term primary culture of fetal mouse Leydig cells. J Steroid Biochem 20(1) : 525-528.

Renlund N. 2006. Hormonal and paracrine influences on Leydig cell steroidogenesis [dissertation]. Stockholm: Karolinska Institutet.

Risbridger GP, Kerr JB, Peake R, Rich KA, de Kretser DM. 1981. Temporal changes in rat Leydig cell function after the induction of bilateral cryptorchidism. J Reprod Fert 63 : 415-423.

Risbridger GP, Hedger MP. 1992. Adult rat Leydig cell cultures: minimum requirement for maintenance of luteinizing hormone responsiveness and testosterone production. Mol Cell Endocrin 83: 125-132.

Saez JM. 1994. Leydig cells: endocrine, paracrine, and autocrine regulation. Endocrin Rev 15(5): 574-626.

Salva A, Klinefelter GR, Hardy MP. 2001. Purification of rat Leydig cells: Increased yields after unit-gravity sedimentation of collagenase-dispersed interstitial cells. J Androl 22: 665-671

Senger PL. 2005. Pathway to Pregnancy and Parturition. Washington: Current Conception Inc.

Sedelaar JPM, Isaacs JT. 2009. Tissue culture media supplemented with 10% Fetal Calf Serum contains a castrate level of testosterone. Prostate 69 (16) : 1724-1729.

Sharpe PT. 1988. Methods of Cell Separation Vol. 18.http://books.google.co.id/ Song L, Tuan RS. 2004. Transdifferentiation potential of human mesenchymal

stem cell derived from bone marrow. FASEBJ 18 : 980-982. Suarez-Quian, Niklinski.1990. Immunocytochemical localization of EGF receptor

in mouse testis. Biol Reprod 43 : 1087-1097.

51

Sun J, Xi Y-B, Zhang Z-D, Shen P, Li H-Y, Yin M-Z, Li W-Y, Shi C-R. 2009. Leydig cell transplantation restores androgen production in surgically castrated prepubertal rats. Asian J Androl 11: 405-409.

Thermo. 2012. Basic centrifugation. http://www.coleparmer.com/TechLibraryArticle/30

Wakefield J St John, Gale JS, Berridge MV, Jordan TW ,Ford HC. 1982. Is Percoll innocuous cells? Biochem J 202 : 795-797.

Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. 2000. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res 61: 364-371

Wu YJ, Dong Q, Li SF, Wei X, Long D, Zeng Y. 2012. Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into Leydig or steroidogenic cells in vitro. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 43(4):493-7, 506.(Abstract)

Yang J-M, Arnush M, Chen Q-Y, Wu X-D, Pang B, Jiang X-Z.2003. Cadmium-induced damaged to primary cultures of rat Leydig cells. Reprod Toxicol 17 : 553-560.

Yazawa T, Mizutani T, Yamada K, Kawata H, Sekiguchi T, Yoshino M, Kajitani T, Shou Z, Umezawa A, Miyamoto K. 2006. Differentiation of adults stem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells. Endocrin 147(9) : 4104-4111.

http://www.coleparmer.com/%20TechLibraryArticle/30�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22997882�

52

LAMPIRAN

Lampiran 1 Pewarnaan Histokimia 3β-HSD (Modifikasi Chemes et al. 1992)

Larutan A :

1 mg nitrotetrazolium blue chloride (Sigma N6876) dilarutkan dalam 0,6 ml larutan 1 mg/ml etiocholanα-01-17-one (Sigma E5126) dalam DMSO (Sigma D5879)

Larutan B:

10 mg β-NAD (Sigma N7004) ditambah dengan DPBS hangat (Gibco)

Cara kerja :

Suspensi sel Leydig

Dikeringkan di atas gelas obyek (1 jam, temperatur ruang)

Fiksasi dengan glutaraldehyde (Sigma) (1 jam, inkubator 37 C)

Diteteskan larutan A dan B (2 -3 jam)

Dicuci dengan air destilasi

Fiksasi dengan 10% formalin (Merck) dalam DPBS dengan 5% sukrosa (Sigma S 0389) (pH7,4)

Ditutup dengan cover gelas dengan glycerol : DPBS (1:1)

Bagian pinggir gelas cover ditutupi cat kuku bening

Pengamatan di bawah mikroskop

53

Lampiran 2.

Penghitungan Sel Menggunakan Haemositometer (kamar hitung) Improved Neubaeur

1. Bersihkan kaca penutup dan haemositometer dengan alkohol 70% 2. Tempatkan kaca penutup pada daerah berskala 3. Masukkan suspensi sel (10 µl) untuk dihitung 4. Kotak memiliki sisi 1 mm terdiri dari 25 kotak kecil, masing-masing kotak

terdiri dari 16 kotak (4x4) yang dibatasi oleh tiga garis. 5. Hitung jumlah sel total pada kotak 1x1 mm dengan cara :

a. Hitung sel pada 5 dari 25 kotak : A b. Hitung rata-rata jumlah sel dalam 1 kotak : (A : 5) = B c. Jumlah sel dalam 25 kotak adalah : B x 25 = C

6. Jumlah sel per 1 mm 3 = C x 10 Jumlah sel per ml = C x 10 x 103= C x 10 4

Gambar 2. Haemositometer Improved Neubaeur (sumber dari :Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Inc. www.currentprotocols.com/protocol/cb0101)

http://www.currentprotocols.com/protocol/cb0101�

54

Lampiran 3.

Komposisi medium DPBS serum

Komponen Stok 1000 ml

DPBS tanpa Ca dan Mg 9,6 g

Newborn Calf Serum 0,1% 1 ml

Gentamycin 50 mg/ml 1,25 ml

Air Milli-Q s/d 1000 ml

Lampiran 4.

Komposisi medium DMEM serum

Komponen Stok 1000 ml

DMEM 10 g

NaH CO3 3,7 g

Non Essential Amino Acid (10%)

1 ml

Gentamycin 1,25 ml

Newborn Calf Serum 10% 100 ml

Air Milli-Q s/d 1000 ml

55

RIWAYAT HIDUP

Penulis lahir di Kota Bandung pada tanggal 14 September 1966. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Drs. Mulyana Kaiin, MM (almarhum) dan Ibu Suryati Elia. Pendidikan sarjana ditempuh di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung, lulus tahun 1991. Pada tahun 1995, penulis melanjutkan pendidikan S2 di Pasca Sarjana ITB dan lulus pada tahun 1998. Pada tahun 2008, penulis melanjutkan pendidikan S3 di Program Studi Biologi Reproduksi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Penulis sejak tahun 1992 bekerja di Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi LIPI (sekarang: Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI) sebagai peneliti di Kelompok Peneliti Reproduksi Ternak dan Kultur Sel Hewan sampai sekarang. Pada tahun 1994 penulis menikah dengan Ir. Harry Prabowo Nikodemus dan dikaruniai dua orang putri (Sarah Aryka dan Kezia Rachel).

Publikasi ilmiah yang sudah dan akan diterbitkan selama menempuh pendidikan di Program Studi Biologi Reproduksi, yaitu : 1. Djuwita I, Harlystiarini, Widyaputri T, Efendi A, Kaiin EM, Nurhidayat.

2010. Tingkat Pertumbuhan dan Analisa Protein Sel-sel Fibroblast Fetal Tikus Hasil Kultur In Vitro. Hemerazoa 1 (2) : 9-16.

2. Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Konsentrasi, Kemurnian dan Viabilitas Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan Gradien Nycodenz dan Kultur In Vitro. Jurnal Kedokteran Hewan Unsyiah 7(1): 75-80. 2013.

3. Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Development of In Vitro Culture of Rat Leydig Cells After Purification With Nycodenz Gradient. Open Journal of Animal Sciences 3 (4) : 299-304.

4. Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. Biological Analysis of Leydig Cells Conditioned Medium to Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Submitted to Pakistan Veterinary Journal.

KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM … · KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED...

Documents

Transcript of KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM … · KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED...