Pepper Praktikum

8/8/2019 Pepper Praktikum

1/9

PEPPER PRAKTIKUM

BIOLOGI PATOGEN TUMBUHAN

TEKNIK SEROLOGI DENGAN ENZYME LINKED

IMMUNOSORBANT ASAY (ELISA) UNTUK DETEKSI DAN

IDENTIFIKASI Tobbaco Mozaik Virus

Disusun oleh :

Sagita Phinanthie A34080090

Dosen Pengajar:

Endang Nurhayati, Ph.D

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009


2/9

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tobacco mosaic virus yaitu virus dengan bentuk seperti batang dengan ukuran

lebar 18 nanometer dan panjang 300 nanometer. Warna daun yang terserang virus

menjadi hijau muda dan hijau tua dengan batas yang tidak jelas. Sementara itu daun

yang lebih muda menjadi menggeliat dan berkerut. Virus ini disebarkan melalui

media penyebaran antara lain, yaitu biji yang membawa virus, tanaman sakit,

manusia, alat-alat kerja, akar tanaman yang tanahnya telah tercemar, serta vektor

(Pracaya 2007).

Diagnosis akurat penyakit virus dan penyakit dalam umum, merupakan

langkah penting pertama untuk pengelolaan tanaman sistem. Virus penyakit,

perawatan tanaman setelah terinfeksi sering kali tidak mengarah ke pengendalian

yang efektif. Oleh karena itu, virus penyakit yang dikelola paling efektif jika tindakan

pengendalian yang dilakukan sebelum infeksi terjadi. Penggunaan sehat (virus -

gratis) tanaman bahan propagasi yang paling efektifvpendekatan untuk mengadopsi

oleh petani. Salah satu unsur penting untuk keberhasilan program sertifikasi untuk

menghasilkan bahan propagasi seperti ketersediaan sensitif metode diagnostik.

Beberapa dasawarsa yang lalu, pendeteksian virus didasarkan terutama pada

teknik biologis yang terlalu lambat dan tidak amendable untuk aplikasi skala

besar. Kemajuan molekuler biologi dan bioteknologi selama tiga dekade terakhir itu

diterapkan untuk mengembangkan cepat, spesifik dan sensitif teknik untuk

pendeteksian virus tanaman. Tinjauan ini akan meringkas

pengembangan dan penggunaan imunologi utama dan nukleat - asam berbasis metode

untuk pendeteksian virus.ELISA merupakan teknik deteksi secara cepat yang telah dikembangkan

dengan aplikasi teknik deteksi patogen secara serologis (Jagoueix et al. 1996;

Mathews et al. 1997). ELISA dapat diandalkan sebagai teknik untuk mendeteksi

sampel lapangan (Rochapena and Lee 1991). ELISA telah berkembang dengan


3/9

berbagai modifikasi, salah satunya adalah Double Antibodi Sandwich (DAS)-

Compound Direct ELISA. Uji DASCompound Direct ELISA memiliki akurasi yang

tinggi karena antigen yang tertangkap dan terdeteksi sangat spesifik. ELISA telah

dipakai secara luas seperti untuk survei, sertifikasi, dan penelitian (Permar et al.

1990). Tujuan percobaanadalah untuk indeksing virus pada tanaman jeruk yang akan

dijadikan sumber mata tempel dengan menggunakan teknik DAS-Compound Direct

ELISA untuk mendapatkan benih bebas virus.

1.2 Tujuan

Pada Praktikum Teknik Serologi dengan ELISA untuk Deteksi dan

Identifikasi bertujuan mengetahui prosedur teknik serologi danpenggunannya dalam bidang virologi tumbuhan


4/9

BAB II

BAHAN DAN METODE

2.1 Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan pada Praktikum Teknik Serologi dengan

ELISA untuk Deteksi dan Identifikasi antara lain antiserum, NaOH (3N),

NaN3 (0,02%), p-nitrophenyl phospate, subtrat untuk alkaline phospate,

enzim konjugat, bahan-bahan pembuat buffer, daun tanaman tembakau

sehat dan sakit, daun tanaman kacang panjang, daun tanaman G.

globosa , dan daun tanaman Chenopodium amaranticolor. Alat yang

digunakan adalah plat mikrotiter, pipet mikrotiter (150 ul atau 200 ul),

tabel ELISA, micro cup, mortar dan alu,

2.2 Metode

Pertama-tama siapkan buffer ekstraksi (milk extract buffer), yaitu

dengan mencampurkan 1,25 g Tween-20 dan 1 g susu kering nonfat ke

dalam 250ml PBST pH 7.4 (8,2 G NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 12H2O, 0,2 g

KH2PO4 0,2 g KCl dalam 1000ml H2O dan 5% Tween20). Kemudian


5/9

daun tanaman digerus dalam buffer ekstraksi tersebut (1/10 b/v) dan

kemudian disaring dengan kain kasa.

Cairan perasan tanaman yang dihasilkan (sap) diambil sebanyak

100 ul kemudian dimasukkan ke dalam sumuran plat mikrotiter. Buat

tabel ELISA dan tulis sap tanaman yang dimasukkan ke dalam sumuran.

Plat mikrotiter ditutup dengan kertas basah atau lembab dan disimpan

dalam kotak plastik yang telah diberi alas kertas basah seama semalam

pada suhu 40 C atau selama 2 jam pada suhu kamar. Selanjutnya

mikrotiter dicuci 4-8 kali dengan PBST. Enzim konjugat yang sudah

diencerkan dimasukkan ke dalam sumuran plat mikrotiter sebanyak 100

ul, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama 2 jam. Plat

mikrotiter dicuci lagi sebanyak 4-8 kali dengan PBST. Sebanyak 100 ul

buffer PNP (0,1 G Magnesium chlorida, 0,2 g Sodium azide, 97 ml

Diethanolamine) dimasukkan ke dalam sumuran plat dan diinkubasikan

selama 30-60 menit. Lihat perubahan warna pada sumuran dan catat

hasilnya.


6/9

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan

No.Sumuran Sap Tanaman dalam Sumuran Hasil Reaksi

(-/+)

A Buffer -B Kontrol negatif -

C Kontrol positif +++++

D G. globosa -

E Tembakau +++

F Kacang panjang 1 -

G Kacang panjang 2 -

H Chenopodium amaranticolor +


7/9

Keterangan :

(+) = reaksi positif dan kepekatan warna

(-) = reaksi negatif tidak berubah warna

3.2 Pembahasan

Pada Praktikum Teknik Serologi dengan ELISA untuk Deteksi dan

Identifikasi didapat hasil pada sumuran A yang berisi buffer tidak terjadi

perubahan warna selama inkubasi. Pada sumuran B yang berisi kontrol

negatif atau tanaman tembakau yang sehat tidak terjadi perubahan warna

juga yang artinya reaksi negatif dan tidaka da virus TMV didalamnya.

Pada sumuran C yang berisi kontrol positif atau TMV murni terjadi

perubahan warna menjadi kuning pekat yang berarti konsentrasi virus

yang ada sangat tinggi. Pada sumuran D yang berisi sap tanaman G.

globosa tidak terjadi perubahan warna juga. Pada sumuran E yang berisi

sap daun tembakau sakit terjadi perubahan warna menjadi kuning dengan

konsentrasi tidak sebanyak kontrol positif. Pada sumuran F dan G yang

diambil dari sap tanaman kacang panjang yang berbeda yang terkena

penyakit mosaik ternyata tidak terjadi perubahan warna yang artinya

tanaman kacang panjang tererang penyakit mosaik yang bukan diserang

oleh TMV. Pada sumuran H yang berisi tanaman Chenopodium

amaranticolor terjadi perubahan warna menjadi kuning pudar yang

arinya konsentrasi TMV sedikit pada daun Chenopodium amaranticolor.


8/9

Setelah dibandingkan dengan hasil yang didapat dari kelompok 1

ternyata terdapat perbedaan pada sumuran H yaitu pada kelompok 1

sumuran H perubahan warnanya lebih pekat dibandingkan dengan

kelompok 2. Hal ini terjadi karena

BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan


9/9

DAFTAR PUSTAKA

Pepper Praktikum

Documents

Transcript of Pepper Praktikum