8/8/2019 Pepper Praktikum
1/9
PEPPER PRAKTIKUM
BIOLOGI PATOGEN TUMBUHAN
TEKNIK SEROLOGI DENGAN ENZYME LINKED
IMMUNOSORBANT ASAY (ELISA) UNTUK DETEKSI DAN
IDENTIFIKASI Tobbaco Mozaik Virus
Disusun oleh :
Sagita Phinanthie A34080090
Dosen Pengajar:
Endang Nurhayati, Ph.D
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
8/8/2019 Pepper Praktikum
2/9
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Tobacco mosaic virus yaitu virus dengan bentuk seperti batang dengan ukuran
lebar 18 nanometer dan panjang 300 nanometer. Warna daun yang terserang virus
menjadi hijau muda dan hijau tua dengan batas yang tidak jelas. Sementara itu daun
yang lebih muda menjadi menggeliat dan berkerut. Virus ini disebarkan melalui
media penyebaran antara lain, yaitu biji yang membawa virus, tanaman sakit,
manusia, alat-alat kerja, akar tanaman yang tanahnya telah tercemar, serta vektor
(Pracaya 2007).
Diagnosis akurat penyakit virus dan penyakit dalam umum, merupakan
langkah penting pertama untuk pengelolaan tanaman sistem. Virus penyakit,
perawatan tanaman setelah terinfeksi sering kali tidak mengarah ke pengendalian
yang efektif. Oleh karena itu, virus penyakit yang dikelola paling efektif jika tindakan
pengendalian yang dilakukan sebelum infeksi terjadi. Penggunaan sehat (virus -
gratis) tanaman bahan propagasi yang paling efektifvpendekatan untuk mengadopsi
oleh petani. Salah satu unsur penting untuk keberhasilan program sertifikasi untuk
menghasilkan bahan propagasi seperti ketersediaan sensitif metode diagnostik.
Beberapa dasawarsa yang lalu, pendeteksian virus didasarkan terutama pada
teknik biologis yang terlalu lambat dan tidak amendable untuk aplikasi skala
besar. Kemajuan molekuler biologi dan bioteknologi selama tiga dekade terakhir itu
diterapkan untuk mengembangkan cepat, spesifik dan sensitif teknik untuk
pendeteksian virus tanaman. Tinjauan ini akan meringkas
pengembangan dan penggunaan imunologi utama dan nukleat - asam berbasis metode
untuk pendeteksian virus.ELISA merupakan teknik deteksi secara cepat yang telah dikembangkan
dengan aplikasi teknik deteksi patogen secara serologis (Jagoueix et al. 1996;
Mathews et al. 1997). ELISA dapat diandalkan sebagai teknik untuk mendeteksi
sampel lapangan (Rochapena and Lee 1991). ELISA telah berkembang dengan
8/8/2019 Pepper Praktikum
3/9
berbagai modifikasi, salah satunya adalah Double Antibodi Sandwich (DAS)-
Compound Direct ELISA. Uji DASCompound Direct ELISA memiliki akurasi yang
tinggi karena antigen yang tertangkap dan terdeteksi sangat spesifik. ELISA telah
dipakai secara luas seperti untuk survei, sertifikasi, dan penelitian (Permar et al.
1990). Tujuan percobaanadalah untuk indeksing virus pada tanaman jeruk yang akan
dijadikan sumber mata tempel dengan menggunakan teknik DAS-Compound Direct
ELISA untuk mendapatkan benih bebas virus.
1.2 Tujuan
Pada Praktikum Teknik Serologi dengan ELISA untuk Deteksi dan
Identifikasi bertujuan mengetahui prosedur teknik serologi danpenggunannya dalam bidang virologi tumbuhan
8/8/2019 Pepper Praktikum
4/9
BAB II
BAHAN DAN METODE
2.1 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada Praktikum Teknik Serologi dengan
ELISA untuk Deteksi dan Identifikasi antara lain antiserum, NaOH (3N),
NaN3 (0,02%), p-nitrophenyl phospate, subtrat untuk alkaline phospate,
enzim konjugat, bahan-bahan pembuat buffer, daun tanaman tembakau
sehat dan sakit, daun tanaman kacang panjang, daun tanaman G.
globosa , dan daun tanaman Chenopodium amaranticolor. Alat yang
digunakan adalah plat mikrotiter, pipet mikrotiter (150 ul atau 200 ul),
tabel ELISA, micro cup, mortar dan alu,
2.2 Metode
Pertama-tama siapkan buffer ekstraksi (milk extract buffer), yaitu
dengan mencampurkan 1,25 g Tween-20 dan 1 g susu kering nonfat ke
dalam 250ml PBST pH 7.4 (8,2 G NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 12H2O, 0,2 g
KH2PO4 0,2 g KCl dalam 1000ml H2O dan 5% Tween20). Kemudian
8/8/2019 Pepper Praktikum
5/9
daun tanaman digerus dalam buffer ekstraksi tersebut (1/10 b/v) dan
kemudian disaring dengan kain kasa.
Cairan perasan tanaman yang dihasilkan (sap) diambil sebanyak
100 ul kemudian dimasukkan ke dalam sumuran plat mikrotiter. Buat
tabel ELISA dan tulis sap tanaman yang dimasukkan ke dalam sumuran.
Plat mikrotiter ditutup dengan kertas basah atau lembab dan disimpan
dalam kotak plastik yang telah diberi alas kertas basah seama semalam
pada suhu 40 C atau selama 2 jam pada suhu kamar. Selanjutnya
mikrotiter dicuci 4-8 kali dengan PBST. Enzim konjugat yang sudah
diencerkan dimasukkan ke dalam sumuran plat mikrotiter sebanyak 100
ul, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama 2 jam. Plat
mikrotiter dicuci lagi sebanyak 4-8 kali dengan PBST. Sebanyak 100 ul
buffer PNP (0,1 G Magnesium chlorida, 0,2 g Sodium azide, 97 ml
Diethanolamine) dimasukkan ke dalam sumuran plat dan diinkubasikan
selama 30-60 menit. Lihat perubahan warna pada sumuran dan catat
hasilnya.
8/8/2019 Pepper Praktikum
6/9
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil Pengamatan
No.Sumuran Sap Tanaman dalam Sumuran Hasil Reaksi
(-/+)
A Buffer -B Kontrol negatif -
C Kontrol positif +++++
D G. globosa -
E Tembakau +++
F Kacang panjang 1 -
G Kacang panjang 2 -
H Chenopodium amaranticolor +
8/8/2019 Pepper Praktikum
7/9
Keterangan :
(+) = reaksi positif dan kepekatan warna
(-) = reaksi negatif tidak berubah warna
3.2 Pembahasan
Pada Praktikum Teknik Serologi dengan ELISA untuk Deteksi dan
Identifikasi didapat hasil pada sumuran A yang berisi buffer tidak terjadi
perubahan warna selama inkubasi. Pada sumuran B yang berisi kontrol
negatif atau tanaman tembakau yang sehat tidak terjadi perubahan warna
juga yang artinya reaksi negatif dan tidaka da virus TMV didalamnya.
Pada sumuran C yang berisi kontrol positif atau TMV murni terjadi
perubahan warna menjadi kuning pekat yang berarti konsentrasi virus
yang ada sangat tinggi. Pada sumuran D yang berisi sap tanaman G.
globosa tidak terjadi perubahan warna juga. Pada sumuran E yang berisi
sap daun tembakau sakit terjadi perubahan warna menjadi kuning dengan
konsentrasi tidak sebanyak kontrol positif. Pada sumuran F dan G yang
diambil dari sap tanaman kacang panjang yang berbeda yang terkena
penyakit mosaik ternyata tidak terjadi perubahan warna yang artinya
tanaman kacang panjang tererang penyakit mosaik yang bukan diserang
oleh TMV. Pada sumuran H yang berisi tanaman Chenopodium
amaranticolor terjadi perubahan warna menjadi kuning pudar yang
arinya konsentrasi TMV sedikit pada daun Chenopodium amaranticolor.
8/8/2019 Pepper Praktikum
8/9
Setelah dibandingkan dengan hasil yang didapat dari kelompok 1
ternyata terdapat perbedaan pada sumuran H yaitu pada kelompok 1
sumuran H perubahan warnanya lebih pekat dibandingkan dengan
kelompok 2. Hal ini terjadi karena
BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
8/8/2019 Pepper Praktikum
9/9
DAFTAR PUSTAKA
Top Related