PENGENDAPAN

Pengendapan merupakan suatu cara klasik untuk pemisahan bermacam protein dengan cara membuat bagian dari campuran protein mengendap.Penggolongan protein :

Albuminmudah larut dalam air dan air berkadar garam rendahmengendap dalam larutan yang berkadar garam ammonium sulfat 70%.Kelarutan protein ditentukan oleh distribusi residu hidrofilik atau hidrofobik pada permukaan molekul protein

2. Golongan globulintidak mudah larut dalam airLarut dalam larutan yang berkadar garam rendahMengendap dalam larutan garam tinggi

3. Golongan prolamintidak larut dam airlarut dalam alkohol 50 90%

Gambar 1. Distribusi muatan hidofob pada protein

Kelarutan protein ditentukan Interaksi polar dengan airInteraksi dengan garamGaya tolak menolak elektrostatik antar molekul ber-muatan

Macam-macam pengendapan:1. Pengendapan melalui titik isoelektrik Pada daerah titik isoelektrik (muatan mendekati nol) kelarutan proten menurunGaya tolak menolak antar molekul turun

Prinsip Pengendapan dg garamJika pada larutan protein ditambahkan garam netral misalnya ammonium sulfat maka kelarutan protein tidak hanya tergantung pada muatan dari garam, tetapi tergantung pada muatan anorganik.Penambahan garam sedikit akan meningkatkan kelarutan (salting in) Menurunkan koefisien aktivita.

Penambahan garam yang tinggi (salting out)

interaksi protein dengan air menurun protein mengendapUrutan pengendapan dimulai dari protein yang kelarutannya kecilPerlu diperhatikan: pH, suhu dan jenis garam yang digunakan Garam yang efektivitasnya tinggi misalnya garam yang bermuatan negatif ganda: sulfat, fosfat, sitrat.

Fraksionasi dengan amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang berbeda-beda pada ekstrak enzim tertentu.Kesimpulan : Enzim yang dipisahkan/dimurnikan mengendap pada tingkat kejenuhan 40-60 lebih besar jika dibandingkan dengan tingkat kejenuhan 60-80, kita coba lakukan 45-70%.

Kejenuhan (NH4)2SO4Enzim yang diendapkan (%)Protein yang direndahkan (%) Kemurnian Percobaan 10 40425-40 6062222,860 8022321,080 supt221-

Kesimpulan : Recovery pada percobaan (2) lebih baik dibandingkan dengan percobaan (1), tetapi kemurniaan enzim kurang baik dibandingkan percobaan (2). Kalau pada percobaan ini penekanannya pada kemurniaan dengan recovery tidak terlalu rendah, kita coba 48-65%.

Kejenuhan (NH4)2SO4Enzim yang diendapkan (%)Protein yang direndahkan (%) Kemurnian Percobaan 245 7038382,470 supt3030-

Kejenuhan (NH4)2SO4Enzim yang diendapkan (%)Protein yang direndahkan (%) Kemurnian Percobaan 30 481035-48 6575253,065 supt1540-

Keuntungan Suspensi protein dalam ammonium sulfat 2-3M stabil dalam beberapa tahun Konsentrasi garam yang tinggi dapat mencegah proteolisisPenyimpanan endapan protein dalam ammonium sulfat adalah cara yang terbaik

3.Pengendapan dengan pelarut organikBanyak digunakan dalam industri, terutama pemisahan protein plasmaPrinsip: adanya pelarut organic (larut dalam air). Akan menyebabkan kekuatan solvasi pada daerah permukaan protein yang hidrofobik berkurang.

Susunan molekul air pada permukaan protein yang hidrofobik diganti oleh molekul organic, sehingga kelarutan protein meningkat, sebaliknya untuk protein yang larut dalam air kelarutannya berkurang Protein yang berat molekulnya besar akan lebih dahulu mengendap

Gambar 2. Agregasi protein dalam campuran pelarut organik

Aseton (pelarut organik) dapat menyebabkan protein terdenaturasi, harus dilakukan pada suhu dibawah nol derajat celsiusPengaruh pelarut organik terhadap larutan protein:

Aseton reduksi konstanta dieletrik dari airpenggantian dari molekul airmobilitas partikel dari molekul air melalui fibrasi

Pelarut organik yang ditambahkan kedalam satu liter protein untuk membuat pelarut dari x% menjadi y%:

Pengendapan dengan polimer organik

Polimer yang digunakan: PolyetilenglikolBerat molekul : 6.000 s/d 20.00020% PEG dapat mengendapkan beberapa komponen protein plasma

Polaritas medium dan Kekuatan ion

Pemurnian protein yang berasal dari membran atau subselular yang perlu dipertimbangkan adalah kepolaran solvenSukrosa, gliserol, dimetil-sulfoksida, dimetil-formamida dapat digunakan untuk protein yang hidrofobikKonsentrasi kira-kira 1 10%

Kalium klorida, natrium klorida, ammonium klorida, dan ammonium sulfat dapat digunakan untuk mempertahankan aktivitasnyaPenilmetilsulfonol fluorida (PMSF) sebagai inhibitor protease.Dietilprokarbonat sebagai inhibitor R-nase

SuhuBeberapa protein stabil pada suhu 0oC. walaupun ada beberapa protein yang sensitif pada suhu ini misalnya enzim piruvat karboksilaseEnzim piruvat karboksilase stabil pada suhu 25oCUntuk mencegah kerusakan protein dalam mencair bekukan dapat ditambahkan sedikit gliserol atau dimetilsulfoksida

Stabilisasi protein atau enzim agar tetap aktif merupakan kerjaan yang sangat sulit.Perlu diperhatikan:pHTingkat oksidasiKonsentrasi logam beratPolaritas mediumKonsentrasi proteaseSuhu

Kebanyakan protein mengandung gugus sulfidril bebasOksidasi gugus sulfidril dapat menurunkan aktivitasKonsentrasi 4 x 10-3 M 2-merkaptoetanol, sistein, tioglikolat dapat mencegah terjadinya ikatan sulfida.

Tingkat oksidasi