Penetapan Kadar Protein Dengan Metode Bradford
2
Pembuatan Larutan Sitrat-Fosfat Buffer pH 7.2 1. Timbang 2,471 gr asam sitrat (6.5 ml 0.1 M citrate) 2. Timbang 30, 945 gr Na2HPO4 (43.60 ml 2 M Na2HPO4) 3. Larutkan dalam 1000 ml akuades Penetapan Kadar Protein dengan Metode Bradford Metode Bradford didasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tyrosine, Tryptophan dan Phenylalanine) atau bersifat basa (Arginine, Histidine dan Leucine). Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan (λ maks 465 nm), sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru (λ maks 595 nm). Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein. Reagen: Coomassie Blue G250 ; sebanyak 100 mg Coomassie Blue G250 dilarutkan dalam 50 mL etanol 95%. Larutan ini kemudian dicampur dengan 100 mL asam fosfat 85% (1,71gr/ml), diencerkan hingga 1 L dengan akuades. Reagen kemudian disaring dengan kertas Whatman No. 1 sebelum disimpan pada suhu kamar. Reagen ini stabil untuk beberapa minggu, meskipun akan terjadi sedikit pengendapan. Larutan standard: Buat seri kadar larutan standard BSA (Bovine Saline Albumin) 0.1 - 1.0 mg/mL dengan pengenceran dari larutan stok. Prosedur: 1. Ambil 100 μL larutan (sampel/standard), masukkan ke tabung. 2. Tambahkan 5 mL reagen, homogenkan. Hindari terjadinya gelembung (busa). 3. Ukur absorbansi pada 595 nm terhadap blanko (larutan PBS). Interferensi: Detergent: Brij, Triton X, Tween, SDS, CHAPS, CHAPSO, MEGA 10, Octyl-b- D-glucoside Solven organik: ethanol, isopropanol, DMSO Agen pengkhelat: EDTA, DTPA Garam: NaCl, KCl, Na-asetat, NaHCO3, Na-deoxylate Buffer: Sitrat pH 5.0, MES pH6.1, Tris pH 7.4, HEPES pH 7.5, CHES pH 9.0
-
Upload
gregorius-baskara-aji-nugraha -
Category
Documents
-
view
207 -
download
8
Transcript of Penetapan Kadar Protein Dengan Metode Bradford
Pembuatan Larutan Sitrat-Fosfat Buffer pH 7.2
1. Timbang 2,471 gr asam sitrat (6.5 ml 0.1 M citrate) 2. Timbang 30, 945 gr Na2HPO4 (43.60 ml 2 M Na2HPO4) 3. Larutkan dalam 1000 ml akuades
Penetapan Kadar Protein dengan Metode Bradford
Metode Bradford didasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tyrosine, Tryptophan dan Phenylalanine) atau bersifat basa (Arginine, Histidine dan Leucine). Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan (λmaks 465 nm), sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru (λmaks 595 nm). Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein.
Reagen:
Coomassie Blue G250; sebanyak 100 mg Coomassie Blue G250 dilarutkan dalam 50 mL etanol 95%. Larutan ini kemudian dicampur dengan 100 mL asam fosfat 85% (1,71gr/ml), diencerkan hingga 1 L dengan akuades. Reagen kemudian disaring dengan kertas Whatman No. 1 sebelum disimpan pada suhu kamar. Reagen ini stabil untuk beberapa minggu, meskipun akan terjadi sedikit pengendapan.
Larutan standard:
Buat seri kadar larutan standard BSA (Bovine Saline Albumin) 0.1 - 1.0 mg/mL dengan pengenceran dari larutan stok.
Prosedur:
1. Ambil 100 μL larutan (sampel/standard), masukkan ke tabung.2. Tambahkan 5 mL reagen, homogenkan. Hindari terjadinya gelembung (busa).3. Ukur absorbansi pada 595 nm terhadap blanko (larutan PBS).
Interferensi:
Detergent: Brij, Triton X, Tween, SDS, CHAPS, CHAPSO, MEGA 10, Octyl-b-D-glucosideSolven organik: ethanol, isopropanol, DMSOAgen pengkhelat: EDTA, DTPAGaram: NaCl, KCl, Na-asetat, NaHCO3, Na-deoxylateBuffer: Sitrat pH 5.0, MES pH6.1, Tris pH 7.4, HEPES pH 7.5, CHES pH 9.0Agen pereduksi: glukosa, glutatione, asam askorbat, dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol
Catatan:
Reagen CBBG berinteraksi secara kuat dengan kuvet kuarsa. Oleh karena itu, gunakan kuvet gelas atau platik.
Referensi:
Bradford, M.M., 1976, A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-dye Binding, Anal. Biochem., 72: 248-254
Dennison C., 2002, A Guide to Protein Isolation, Kluwer Academic Publishers, New York
Hammond, J.B.W. & Kruger, N.J., The Bradford Method for Protein Quantification, In: New Protein Techniques, Methods of Molecular Biology Volume 3, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Olson, B.J.S.C., & Markwell, J., 2007, Assay for Determination of Protein Concentration, In: Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York.
