BAB I

PENDAHULUAN

Sebenarnya hampir disetiap bagian tubuh kita ini terdapat letak-letak

protein utamanya dalam setiap sel makhluk hidup. Kita dapat menjumpai protein

pada rambut, kulit, pembuluh darah, syaraf, otot, sel darah, hormon, dan juga

enzim. Bahkan tidak hanya itu saja, kita juga dapat menjumpai adanya protein dalam

bulu ayam, biji-bijian, dan dalam jaring laba-laba. Protein berasal dari bahasa Yunani

“Proteios” berarti yang pertama atau yang utama.

Protein berupa senyawa polimer (poliamida) dengan monomernya berupa

asam amino yang terbentuk melalui reaksi polimerisasi kondensasi dari bermacam-

macam asam amino. Protein mempunyai molekul besar dengan bobot molekul

bervariasi antara 5.000 sampai jutaan. Dengan cara yang dinamakan hidrolisis oleh

asam atau oleh enzim,protein akan menghasilkan asam-asam amino.

Protein memegang peranan penting dalam makhluk hidup, perannya yaitu

dalam struktur, fungsi dan reproduksi makhluk hidup dan merupakan salah satu

bahan makanan yang sangat penting. Unsur-unsur utama yang membangun molekul

protein adalah karbon, nitrogen, dan oksigen. Molekul protein mengandung pula

unsur fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsur logam seperti

besi dan tembaga. Untuk berbagai keperluan, kadar suatu protein dapat ditentukan.

Penentuan kadar protein dapat ditentukan. Penentuan kadar dalam bahan makanan

pada umumnya dilakukan berdasarkan peneraan empiris atau secara tidak langsung,

karena pembentukan kadar protein secara absolut sukar dilakukan sehingga metode

tersebut hanya dilakukan untuk keperluan yang mendasar saja. Penentuan kadar

protein dapat dilakukan dengan berbagai metode bergantung pada jenis sampel dan

ketersediaan alat serta bahan (pereaksi). Metode yang paling umum digunakan

adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan

merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan

semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat

ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling

tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian

dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan

yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang

khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul

unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. Yang paling

istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam amino dalam berbagai

kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein yang mempunyai sifat-

sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini organisme yang berbeda dapat

membuat produk-produk yang demikian bervariasi, seperti enzim, hormon, lensa

protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan sebagainya (Lehninger, 1982).

Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan

makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkion fosfat.

Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain numleoprotein, fosfoprotein,

metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan

organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama ialah pertama protein

sederhana yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino

dan kedua protein terkonjugasi, yaitu protein yang hidrolisis tidak hanya

menghasilkan asam amino tetapi menghasilkan juga komponen anorganik yang

disebut ”gugus prostetic” (Sumarno, 2002).

Di samping itu protein dapat dibedakan berdasarkan pada jenis ikatan

peptida antar molekul asam amino, yaitu protein primer, protein sekunder, protein

tertier dan protein kuaterner. Protein primer merupakan polimer asam amino yang

berbentuk rantai panjang, terdapat dalam sel hewan antara lain sebagai collagen

dan elastin. Protein sekunder adalah polimer asam amino rantai polipeptida yang

membentuk struktur helix seperti keratin yang terdapat dalam rambut, tanduk dan

wool. Protein tertier adalah polimer asam amino dalam bentuk globuler, seperti

yang terdapat dalam enzim, hormon dan protein pembawa oksigen (Lehninger,

1975, dan Linder, 1992)

Dari segi nutrisi, asam amino dapat dibedakan antara lain (i) asam amino

non esensial dan (ii) asam amino esensial. Asam amino non esensial adalah asam

amino yang dapat disediakan oleh tubuh organisme melalui proses biosintesa yang

rumit dari senyawa nitrogen yang terdapat dalam makanan, dan asam amino

esensial, adalah asam amino yang tidak dapat disintesa oleh tubuh, (Fennema 1976).

Untuk memenuhi kebutuhan protein, suatu organisme memerlukan

tambahan asam amino esensial yang diperoleh dari bahan pangan atau pakan yang

dikonsumsi. Banyak kelainan yang timbul terhadap manusia yang kekurangan

protein. Untuk meningkatkan kadar HB pada penderita anemia, diperlukan makanan

dengan gizi yang lebih baik, artinya perlu tambahan protein hewani maupun nabati,

walaupun pemberian susu untuk diminum sedikit menaikkan status tersebut

(Latupeirissa, dkk 2000). Kekurangan gizi memungkinkan ketahanan terhadap infeksi

lebih banyak dari pada orang bergizi baik, seperti infeksi saluran pernafasan bagian

atas (ISPA) dan infeksi pada kulit, dan ketahanan bagi penderita kurang gizi

waktunya sangat terbatas yang paling lama adalah 6 bulan, (Sihadi, 1998/1999).

Kekurangan gizi ternyata ada kaitannya kadar albumin dalam serum, Sya’bani

(1998), melaporkan para penderita kurang gizi ternyata jumlah pemasukan

proteinnya rendah lebih kurang 1.0 g/kg/hari. Pada hal kadar albumin mempunyai

waktu paro yang panjang disimpan dihati, hal senada dilaporkan oleh Lydia (1997),

bahwa kadar albumin yang rendah pada ginjal dapat mengurangi fungsi kemampuan

filtrasi darah oleh ginjal atau kemungkinan dapat menyebabkan gagal ginjal.

Sekurang-kurangnya, terdapat lima belas macam asam amino esensial yang

harus tersedia dalam makanan, yaitu fenilalanin, tirosin, isoleusin, lisin, metionin,

sistin, treonin, valin, triptofan, arginin, histidin, glisin, serin, asparagin, dan prolin.

Secara kimia, asam amino merupakan asam karboksilat dengan gugus amino - NH2

pada kedudukan , yang dapat dituliskan dalam formula sebagai berikut:

Berdasarkan polaritas gugus - R, asam amino dibedakan menjadi 4 golongan

yaitu (1) asam amino dengan gugus - R yang bersifat nonpolar, seperti alanin, leusin,

isoleusin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan dan metionin, (2) asam amino dengan

gugus - R polar tidak bermuatan, seperti serin, treonin, tirosin, aspargin, glutamin,

sistein dan glisin, (3) asam amino dengan gugus - R bermuatan positif, seperti lisin,

arginin dan histidin, dan (4) asam amino dengan gugus - R bermuatan negatif,

seperti asam aspartat dan asam glutamat. (Bodanszky, 1993).

Hidrolisis rantai polipeptida yang sempurna dilakukan dengan asam HCl 6 N

berlebihan pada 100o sampai 120o C selama 10 sampai 24 jam dalam lingkungan

gas nitrogen. Triptofan tidak stabil dalam lingkungan asam, sehingga rusak dalam

hidrolisis asam. Dengan hidrolisis asam ini serin dan threonin akan mengalami

kerusakan sebagian, sedangkan asparagin dan glutamin akan terhidrolisa sempurna

menjadi asam aspartat dan asam glutamat dengan membebaskan ion amonium,

(Linder, 1992)

Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode yang

mana bergantung dari jenis sample dan ketersediaan alat serta bahan. Metode yang

umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret (Patong, 2007).

Menurut Apriyanto, 1989 analisis protein dapat dilakukan dengan dua

metode, yaitu secara kualitatif dan secara kuantitatif. Analisis protein secara

kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi

Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Sementara itu, analisis protein secara kuantitatif

terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode

spektrofotometri visible (Biuret), metode Bradford dan metode spektrofotometri UV

.

BAB III

METODE PENELITIAN

1. Penetapan Kadar Protein secara Kjehldahl

Lebih kurang 1 gram sampel protein dimasukkan kedalam labu

Kjehldahl, tambahkan 10 g natrium sulfat anhidrat dan 20 mL asam sulfat

pekat, kemudian dipanaskan sampai cairan jernih tak berwarna, setelah

didinginkan ditambahkan air suling 200 ml dan natrium hidroksida 45%

sampai bersifat basa terhadap kertas lakmus dan didestilasi. Destilat yang

mengandung ammonia ditampung dalam HCl 0,1N 100,0 ml. Destilasi

dihentikan bila destilat tidak bersifat basa lagi, kelebihan HCl dititrasi

kembali dengan natrium hidroksida 0,1 N. Penetapan serupa dilakukan

terhadap blanko.

Persamaan berikut dapat digunakan untuk menentukan kadar

nitrogen dalam mg sampel menggunakan larutan HCl xM untuk titrasi.

Dimana vs dan vb adalah volume titrasi sampel dan blanko, 14g adalah berat

molekul untuk nitrogen N. Penetapan blanko biasanya dilakukan pada saat

yang sama dengan sampel untuk memperhitungkan nitrogen residual yang

dapat mempengaruhi hasil analisis. Setelah kadar nitrogen ditentukan,

dikonversi menjadi kadar protein dengan faktor konversi yang sesuai :

% Protein = F x %N.

2. Penetapan Kadar Protein dengan metode Lowry

Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry yaitu

dengan cara :

Larutan enzim sebanyak 0,3 mL ditambah 2 mL reagen Lowry C dikocok pelan

dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Campuran ditambah

reagen Lowry D dengan cepat kemudian diinkubasi selama 30 menit pada

suhu kamar dengan sesekali dikocok. Larutan diukur absorbansinya pada

gelombang optimum BSA kemudian kadar protein ditentukan dengan regresi

linier terhadap kurva standar BSA.

3. Penetapan Kadar Protein dengan Metode Bradford

a. Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri Bacillus subtilis dan Bacillus

sp. umur 18 jam dalam larutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati

tapioca yang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 10 menit pada suhu 4°C. diperoleh supernatant yang kemudian

disebut dengan ekstrak enzim kasar (EEK)

b. Reagen Bradford dibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian

blue (CBB) G 250 yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v),‐

lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85% (v/v). Campuran dihomogenkan

(dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam

botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5

kali sebelum digunakan..

c. Larutan standar protein dibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine

serum albumin) yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml H2O steril

sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm.

Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan

melarutkan 0,5 ml larutan stok

ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100

ppm. Dari larutan stok tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar

protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90

dan 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein

dengan menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen

Bradford. Kemudian larutan divortex dan di inkubasi pada suhu ruang

selama 10 60 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca pada‐

panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan

didapatkan persamaan matematik untuk larutan standar protein yang

diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan digunakan pada

pengukuran kadar protein terlarut.

d. Pengukuran protein terlarut. Pengukuran sampel dilakukan dengan cara

menambahkan 0,1 ml ekstrak enzim kasar dengan 5 ml reagen Bradford

divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 60 menit. Absorbansi‐

Larutan sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan

persamaan matematik dari kurva standar protein, akan didapatkan kadar

protein terlarut yang terkandung dalam larutan ekstrak enzim kasar.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penetapan Protein Dengan Metode Kjehldahl

Pada percobaan ini di gunakan metode kjeldahl yang merupakan

metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino,

protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi

dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga

akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat,

amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan

penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

Berdasarkan penelitian dan perhitungan kadar N Total secara

Kjehldahl dapat dilihat pada tabel berikut

N-total yang tertetapkan adalah jumlah dari N-non protein dan N-protein.

Sampel bahan makanan diatas digunakan oleh masyarakat luas sebagai

sumber protein karena kandungannya yang cukup tinggi. Susu sapi pada

umumnya terdiri dari ±86-90% air, 3-5% lemak, 3-4% protein, 4-5% laktosa.

Putih telur pada dasarnya adalah larutan protein dalam air dengan

konsentrasi ±12%. Kandungan protein dalam kedelai berkisar antara 32-46%

protein (Fennema, 1976). Informasi mengenai kandungan protein diatas

diperoleh dari konversi N-total dengan bilangan 6,25. Untuk jaringan

tanaman, informasi ini kurang tepat, karena disamping protein, jaringan

tanaman mungkin mengandung senyawa amina lain seperti asparagin dan

glutamin, juga senyawa nitrogen seperti purin, pirimidin, nukleosida,

nukleotida, betain, alkaloid, porfirin dan asam amino non protein.

1. Keuntungan :

Metode Kjeldahl digunakan secara luas di seluruh dunia dan masih

merupakan metode standar dibanding metode lain.

Sifatnya yang universal, presisi tinggi dan reprodusibilitas baik

membuat metode ini banyak digunakan untuk penetapan kadar

protein.

2. Kerugian :

Metode ini tidak memberikan pengukuran protein sesungguhnya,

karena tidak semua nitrogen dalam makanan bersumber dari protein.

Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda

karena susunan residu asam amino yang berbeda.

Penggunaan asam sulfat pada suhu tinggi berbahaya, demikian juga

beberapa katalis.

Teknik ini membutuhkan waktu lama.

B. Penetapan Kadar Protein Metode Lowry

Pada percobaan ini, Penentuan kadar protein digunakan metoda Lowry

dengan menggunakan larutan standart protein kasein. Metoda ini dapat

mengukur kandungan protein sampel yang rendah. Warna biru yang terjadi oleh

pereaksi Folin Ciocalteu disebabkan reaksi antara pro-tein dengan ion kupri

( Cu++) dalam larutan alkalis dan terjadi reduksi garam fosfomolibdat

fosfotungstat oleh tirosin dan triptopan yang ada pada protein. Karena

kandungan kedua macam asam amino tersebut bervariasi pada berbagai

macam protein, maka intensitas warna yang ditimbulkan per miligram

proteinpun berbeda (Sudarmadji, 1984).

Hasil serapan yang diukur pada panjang gelombang 760 nm sebagai panjang

gelombang maksimum untuk kasein sebagai larutan standar protein.Hasil

penelitian menunjukkan bahwa kadar protein enzim kasar bromelin dari buah

nanas adalah 10,299 mg/mL.

C. Penetapan kadar protein metode Bradford

Metode Bradford adalah salah satu metode dalam penentuan kadar

protein suatu bahan. Prinsip kerja dari metode Bradford didasarkan pada

pengikatan secara langsung zat warna Coomassie Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh

protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik

(Tyrosine, tryptophan, dan phenylalanine) atau bersifat basa (Arginine, Histidine,

dan Leucin). Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan (lmaks 465 nm),

sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion

yang akan mengikat protein membentuk warna biru (lmaks 595 nm). Jumlah CCBG

yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan

pada protein.

Dari hasil pembacaan spektrofotometri larutan standar BSA maka diperoleh kurva

standar sebagai berikut.

Dari nilai absorbansi standar BSA, maka diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan

regresi y = 1.445x + 0.258. Apabila absorbansi sampel adalah 0.360 dan 0.369 dari ekstrak

enzim kasar yang diperoleh dari biakan Bacillus sp. lalu dimasukkan ke dalam persamaan

regresi, maka rata rata kadar proteinnya adalah 0.074 mg/ml atau 74 ppm larutan EEK‐

sedangkan untuk ekstrak enzim kasar dari biakan Bacillus subtilis diperoleh absorbansi

sampelnya adalah 0.347 dan 0.350, maka rata rata kadar protein adalah 0.063 mg/ml atau‐

63 ppm larutan EEK. Oleh karena itu, dari hasil percobaan tersebut dapat diketahui bahwa

protein terlarut pada EEK dari biakan Bacillus sp. lebih banyak daripada protein terlarut

yang ada pada EEK dari biakan Bacillus subtilis.

Kesimpulan

1. Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan

secara kuantitatif. Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi

Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi

Sakaguchi. Sementara itu, analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode

Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible

(Biuret), metode Bradford dan metode spektrofotometri UV

DAFTAR PUSTAKA

Amino, Majalah Farmasi Indonesia, 13(1):hal 34-43.

Bodanszky M., 1993,Chemistry of Peptide, Springer-Verlag, Berlin 47-52

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of

microorganisms quantities of protein in utilizing the principle of

protein dye binding‐ . Anal. Biochem 72:248 254. ‐

Lehninger., 1982., Dasar-Dasar Biokimia, Erlangga: Jakarta., hlm 248-249.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.

Sudarmadji, S., 1996, Analisa dan Bahan Makanan dan Pertanian, Liberty,

Yogyakarta.

Tugas individu!!!

ANALISIS PROTEIN DALAM BAHAN MAKANAN

RETNO DWIWANRA R. UMAR081314016

C

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MAKASSAR 2012