BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sebenarnya hampir disetiap bagian tubuh kita ini terdapat letak-letak

protein utamanya dalam setiap sel makhluk hidup. Kita dapat menjumpai protein

pada rambut, kulit, pembuluh darah, syaraf, otot, sel darah, hormon, dan juga

enzim. Bahkan tidak hanya itu saja,kita juga dapat menjumpai adanya protein

dalam bulu ayam, biji-bijian, dan dalam jaring laba-laba. Protein berasal dari

bahasa Yunani “Proteios” berarti yang pertama atau yang utama.

Protein berupa senyawa polimer (poliamida) dengan monomernya berupa

asam amino yang terbentuk melalui reaksi polimerisasi kondensasi dari

bermacam-macam asam amino. Protein mempunyai molekul besar dengan bobot

molekul bervariasi antara 5.000 sampai jutaan. Dengan cara yang dinamakan

hidrolisis oleh asam atau oleh enzim,protein akan menghasilkan asam-asam

amino.

Protein memegang peranan penting dalam makhluk hidup, perannya yaitu

dalam struktur, fungsi dan reproduksi makhluk hidup dan merupakan salah satu

bahan makanan yang sangat penting. Unsur-unsur utama yang membangun

molekul protein adalah karbon, nitrogen, dan oksigen. Molekul protein

mengandung pula unsur fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung

unsur logam seperti besi dan tembaga.

Untuk berbagai keperluan, kadar suatu protein dapat ditentukan.

Penentuan kadar protein dapat ditentukan. Penentuan kadar dalam bahan makanan

pada umumnya dilakukan berdasarkan peneraan empiris atau secara tidak

langsung, karena pembentukan kadar protein secara absolut sukar dilakukan

sehingga metode tersebut hanya dilakukan untuk keperluan yang mendasar saja.

Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode bergantung

pada jenis sampel dan ketersediaan alat serta bahan (pereaksi). Metode yang

paling umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret.

Berdasarkan beberapa teori di atas, maka dilakukanlah percobaan ini yakni

penentuan kadar protein dengan menggunakan metode Lowry.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan memahami

proses penentuan kadar protein dalam suatu bahan dengan menggunakan metode

tertentu.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk menentukan kadar

protein dalam contoh dengan menggunakan spektrofotometer.

1.3 Prinsip Percobaan

Penentuan kadar protein dalam sampel cair berdasarkan metode Lowry

yang mana terjadi reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam

fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupakan residu

protein) dan akan menghasilkan warna biru, intensitas warna diukur pada panjang

gelombang maksimum dengan spektrofotometer.

1.3 Manfaat Percobaan

Manfaat dari melakukan percobaan penentuan kadar protein ini yaitu

Mengetahui cara penggunaan spektrofotometer dan mengetahui cara penentuan

kadar protein dalam sampel.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup

dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua

sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda

dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri

yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari

rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen

dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai

samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu,

kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur

protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam

amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein

yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini

organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi,

seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan

sebagainya (Lehninger, 1982).

Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan

makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkion fosfat.

Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain numleoprotein, fosfoprotein,

metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan

organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama ialah pertama

protein sederhana yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan

asam amino dan kedua protein terkonjugasi, yaitu protein yang hidrolisis tidak

hanya menghasilkan asam amino tetapi menghasilkan juga komponen anorganik

yang disebut ”gugus prostetic” (Sumarno, 2002).

Langkah awal dalam pemurnian protein ialah menentukan bahan alam

yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang ada di

dalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein yang

tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam

tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan

dimurnikan. Bila protein yang diinginkan tahan terhadap panas, cmpuran protein

dapat dipanaskan sebentar untuk mengendapkan protein lain yang diinginkan. Di

samping itu protein juga sensitif terhadap asam dan basa dengan konsentrasi

tinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan pada pH mendekati netral

dengan menggunakan buffer tertentu. Setelah diperoleh larutan yang berisi

beberapa macam protein maka proses selanjutnya ialah fraksionasi, yaitu

memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi.

Dua cara yang biasa digunakan untuk proses fraksionasi ini yaitu pengendapan

dan kromatografi (Poedjiadi,1994).

Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode yang

mana bergantung dari jenis sample dan ketersediaan alat serta bahan. Metode

yang umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret (Patong, 2007).

Metode yang juga digunakan adalah metode Lowry. Pada metode ini

protein dengan asam fosfotungstat-fofomolibdat pada suasana alkalis akan

memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein

yang tertera. Konsentrasi protein yang diukur berdasarkan optikal density pada

panjang gelombang 600 nm (OD terpilih). Untuk mengetahui banyaknya protein

dalam larutan, lebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan

antara Bovine Serum Albumin (BSA) atau albumin serum darah sapi. Larutan

Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstat-

fosfomolibdat (1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-karbonat 2% dalam

NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-K-Tartrat 2%. Cara penentuannya adalah 1 mL

larutan protein ditambah 5 mL Lowry B, dokocok dan dobiarkan selama 10 menit.

Kemudian ditambahkan 0,5 mL Lowry A, dikocok dan dibiarkan 20 menit,

selanjutnya diamati OD-nya pada panjang gelombang 600 nm. Cara Lowry ini 10-

20 kali lebih sensitif daripada cara UV atau cara Biuret (Sudarmadji, dkk., 1996).

Beberapa metode yang juga sering digunakan antara lain (Sudarmadji,

dkk., 1996):

1. Metode spektrofotometer UV

Kebanyakan protein mengabsorsi sinar ultraviolet maksimum pada 280 nm.

Hal ini terutama untuk mengidentifikasi adanya asam amino tirosin,

triptophan dan fenilalanin yang ada pada protein tersebut. Pengukuran protein

berdasarkan absorpsi sinar UV adalah cepat, mudah dan tidak merusak bahan.

Untuk keperluan perhitungan digunakan pula kurva standar.

2. Metode turbidimetri atau kekeruhan

Metode ini didasarkan pada kekeruhan yang terbentuk pada larutan yang

mengandung protein apabila ditambahkan bahan pengendap protein misalnya

Tri Chloro Acetic acid (TCA), kalium ferri sianida [K4Fe(CN)6] atau asam

sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat turbidimeter. Cara ini

hanya dapat dipakai untuk bahan protein yang berupa larutan dan hasilnya

biasanya kurang tepat.

3. Metode pengecatan

Beberapa bahan pewarna misalnya orange G. Orange 12 dan Amido Black

dapat membentuk senyawaan berwarna dengan protein dan menjadi tidak

larut. Dengan mengukur sisa bahan pewarna yang tidak bereaksi dalam

larutan (dengan kolorimeter), maka jumlah protein dapat ditentukan dengan

cepat.

4. Penentuan protein dengan titrasi formal

Larutan protein dinetralkan dengan basa (naOH), kemudian ditambahkan

formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini

berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi

antara asam (gugus karboksil) dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat

diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah PP, akhir titrasi bila

tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam

30 detik. Titrasi formol ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses

terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein.

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini diantaranya ialah

larutan induk (BSA 1 mg/mL), larutan sampel protein, larutan Lowry A (Follin

clocalteus dan akuades), larutan Lowry B (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N, Na-K-

Tartrat, CuSO4.5H2O), akuades dan tissue roll.

3.2 Alat

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah rak tabung, tabung reaksi,

gelas kimia 100 mL, pipet ukur 0,2 mL, pipet volume 1 mL, pipet ukur 5 mL,

pipet ukur 10 mL, pipet ukur 25 mL, pipet ukur 0,1 mL, filler pipet, labu semprot,

gelas ukur 100 mL, pipet tetes, bulp dan spektrofotometer.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Larutan Induk

Pembuatan larutan induk dilakukan dengan membuat larutan BSA (Bovine

Serum Albumin) 1 mg/mL.

3.3.2 Pembuatan Larutan Standar

Pembuatan larutan standar dilakukan dengan mengencerkan larutan induk

dengan aquades hingga mencapai volume 2 mL, dengan volume dan konsentrasi

yang telah ditentukan, seperti pada tabel di bawah :

C standar (ppm) VBSA (mL) Vakuades (mL) Vtotal (mL)0,04 0,08 1,92 20,08 0,16 1,84 20,1 0,2 1,80 20,12 0,24 1,76 2

3.3.3 Pembuatan Pereaksi

A. Lowry A

Dipipet sebanyak larutan Follin Clocalteus, kemudian ditambahkan

dengan akuades dengan perbandingan 1:1.

B. Lowry B

Dipipet sebanyak 50 mL larutan Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N,

kemudian ditambahkan dengan 0,5 mL larutan Na-K-Tartrat 2%, dan 0,5 mL

larutan CuSO4.5H2O 1%.

3.3.4 Preparasi Sampel

Dipipet sebanyak 0,2 mL larutan sampel, kemudian ditambahkan dengan

1,8 mL aquades. Faktor pengencerannya ialah sebesar 10 kali.

3.5 Penentuan Kadar Protein Sampel

Dipipet masing-masing sebanyak 1 mL larutan standar 0,04 M; 0,08 M;

0,1 M; 0,12 M; larutan sampel, dan larutan blanko (akuades) ke dalam tabung

reaksi. Kedalamnya ditambahkan masing-masing sebanyak 8 mL larutan Lowry

B, lalu dibiarkan selama 10-15 menit. Kemudian ditambahkan 1 mL larutan

Lowry A ke dalam masing-masing tabung reaksi, dan dibiarkan selama 20-30

menit. Setelah itu, diukur absorban dari masing-masing larutan dengan

menggunakan spektronik-20 pada panjang gelombang maksimum.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Tabel

Tabel 1. Penentuan panjang gelombang maksimumPanjang gelombang (nm) Absorban

500 0,038510 0.041520 0.039530 0.047540 0.048550 0.050560 0.054570 0.050580 0.056590 0.055600 0.063610 0.066620 0.068630 0.067640 0.069650 0.069660 0.074670 0.070

Tabel.2 Hasil pengamatan penentuan kadar proteinC (mg/ mL) Absorban

0,04 0,0370,08 0,2370,10 0,3590,12 0,410

Sampel A 0,040Sampel B 0,029

4.2 Grafik

Grafik 1. Hasil pengamatan penentuan kadar protein

CuSO4

4.3 Reaksi

+ NaOH

+ H2O

H2N CH

R

C

O

NH CH C

R

O

NH CH C OH

R

O

n

2H2N CH

R

C

O

NH CH C

R

O

NH CH C ONa

R

O

n

+ Na2SO4

4.4 Perhitungan

4.4.1 Penentuan kadar protein

Dari persamaan garis pada grafik di atas dapat ditentukan kadar protein sebagai

berikut:

• y = 3.712x - 0.044

Dimana : y = absorban sampel

x = kadar protein dalam sampel

Sehingga,

0,04 = 3.712x – 0.044

0.084 = 3.712x

x = 0.023 mg/mL

Jadi, kadar protein dalam sampel adalah = x . FP

= 0.023 x 10

= 0.23 mg/ mL

H2N CH

R

CO

HN CH C

R

ONH CH C O-

R On

Cu2+

H2N CH

R

CO

NH

CH C

R ONH CH C O-

R

O

n

• y = 3.712x – 0.044

Dimana : y = absorban sampel

x = kadar protein dalam sampel

Sehingga,

0.029 = 3.712x – 0.044

0.073 = 3.712x

x = 0.02 mg/mL

Jadi, kadar protein dalam sampel adalah = x . FP

= 0,02 x 10

= 0.2 mg/ mL

4.3.2 Perhitungan larutan induk

1 mg = 1 mL

x = 10 mL

x = 10 mL . 1 mg 1 ml

x = 10 mg = 0,01 gr BSA (dilarutkan dalam labu ukur 10 mL).

4.4.3 Perhitungan larutan standar

1. Untuk standar 0,04 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,04 mg/mL

X = 0,08 mL

2. Untuk standar 0,08 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,08 mg/mL

X = 0,16 mL

3. Untuk standar 0,10 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,10 mg/mL

X = 0,20 mL

4. Untuk standar 0,12 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,12 mg/mL

X = 0,24 mL

4.5 Pembahasan

Dalam penentuan kadar protein ini digunakan dengan metode Lowry

dimana menurut literatur yang ada menyebutkan bahwa metode ini lebih sensitif

dibandingkan dengan metode biuret. Penentuan kadar protein dengan metode ini

didasarkan pada reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam

fosfotungstat dan asam fosfomolibdat oleh tirosin dan triptofan yang merupakan

residu protein yang akan memberikan warna biru. Warna yang diperoleh akan

diukur absorbannya dengan menggunakan spektronik-20 pada panjang gelombang

maksimum antara 600-700 nm.

Larutan standar yang digunakan dalam percobaan ini yaitu menggunakan

konsentrasi 0,04 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL, dan 0,12 mg/mL. Adapun

tujuan dari pembuatan larutan standar dengan berbagai konsentrasi adalah untuk

menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan persamaan

garis lurus yang diperoleh dari grafik larutan standar.

Pereaksi yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan Lowry A dan

larutan Lowry B. Larutan Lowry A dibuat dengan mencampurkan larutan follin

ciocalteus dan akuades dengan perbandingan 1:1. Larutan Lowry B dibuat dengan

mencampurkan larutan Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N, Na-K-Tartrat 2% dan

CuSO4.5H2O 1% dengan perbandingan 100:1:1. Larutan Na2CO3 berfungsi

sebagai garam yang mengkoordinasikan reaksi dalam suasana basa bersama

NaOH, larutan Na-K-Tartrat berfungsi mencegah terjadinya pengendapan

kuprooksida dalam reagen Lowry B, sedangkan larutan CuSO4 berfungsi untuk

mereduksi fosfotungstat –fosfomolibdat. Adapun lowry B untuk memberi suasana

basa. Sehingga akan menghasilkan warna biru dimana intensitas warna ini

bergantung dari kadar protein yang akan ditentukan.

Larutan standar, sampel, dan blanko sebanyak 1 mL ditambahkan dengan

8 mL reagen Lowry B, dikocok agar homogen dan didiamkan selama 10 menit

agar reaksi berjalan sempurna. Setelah itu, ditambahkan reagen Lowry A

sebanyak 1 mL, dihomogenkan dan didiamkan lagi selama 30 menit. Hal ini

dilakukan agar kepekatan larutan tersebut lebih maksimal. Selanjutnya, larutan

tersebut diukur absorbannya dengan menggunakan spektronik 20 pada panjang

gelombang maksimum.

Grafik 2 di atas merupakan grafik konsentrasi terhadap nilai absorban, titik

merupakan hubungan antara konsentrasi dengan absorban, sedangkan garis lurus

adalah hasil regresi dari nilai absorban. Dari hasil regresi grafik tersebut kemudian

didapatkan nilai intercept dan slopenya, yang kemudian akan digunakan untuk

menghitung konsentrasi dari sampel yang sudah diketahui nilai absorbannya.

Dari rumus yang tertera di atas (y = 3.712x – 0.044) dengan y adalah

absorban, x adalah konsentrasi, dari rumus ini maka bisa dihitung konsentrasi

sampel yang sudah kita ketahui nilai absorbannya. Sedangkan untuk menghitung

kadar protein dalam sampel tersebut, kita tinggal mengalikan nilai konsentrasi

dengan faktor pengenceran, yaitu sebesar 10 kali. Hasil akhir dari perhitungan

tersebut adalah nilai kadar dari protein.

Dari perhitungan dengan memperhatikan grafik absorban terhadap

konsentrasi maka diperoleh kadar protein untuk sampel A yaitu 0.23 mg/mL dan

untuk sampel B yaitu 0.02 mg/mL. Hasil ini sesungguhnya tidak sesuai dengan

apa yang sebenarnya karena larutan sampel mempunyai nilai absorban yang

berada diluar dari absorban deret standar. Hal ini dikarenakan beberapa kesalahan

diantaranya pembuatan reagen Lowry yang tidak sesuai, atau karena pengambilan

volume dari setiap bahan yang kurang pas karena dibutuhkan ketelitian tingkat

tinggi mengingat volume yang digunakan berada dalam skala cukup kecil atau

mungkin cara pengencaran sample yang kurang tepat. Sebenarnya untuk

memperoleh kadar protein yang akurat maka harus mengulang prosedur

pengukuran kadar protein sample tetapi karena keterbatasan waktu dan bahan

maka prosedur tersebut tidak diulangi.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil percobaan ini, didapatkan kesimpulan bahwa kadar konsentrasi

protein sampel A adalah sebesar 0.023 mg/mL dan sampel B sebesar 0.02 mg/mL.

5.2 Saran

Sebaiknya pada percobaan ini dilakukan juga penentuan kadar protein

dengan menggunakan metode Biuret, agar dapat dibandingkan hasilnya.

DAFTAR PUSTAKA

Lehninger, A. L., 1982, Dasar-dasar Biokimia jilid 1, Erlangga, Jakarta.

Patong, A. R., 2009, Penuntun dan Laporan Praktikum Biokimia, Laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Hasanuddin, Makassar.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.

Sudarmadji, S., 1996, Analisa dan Bahan Makanan dan Pertanian, Liberty, Yogyakarta.

Sumarno, Sri Noegrohati, Narsito, Iip Izul Falah, 2002, Estimasi Kadar Protein dalam Bahan Pangan Melalui Analisis Nitrogen Total dan Analisis Asam Amino, Majalah Farmasi Indonesia, 13(1):hal 34-43.

Lampiran 1. Bagan Kerja Penentuan Kadar Protein

Larutan induk BSA 1 mg/mL 0,1 mL sampel

- Dipipet 0,04 mL; 0,08 mL; 0,16 mL; - Diencerkan hingga

0,2 mL; 0,24 mL. volume 10 mL.

- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi - Larutan diencerkan lagi

yang berbeda. hingga volume 2 mL.

- Diencerkan hingga volume 2 mL.

Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan Blanko standar standar standar standar standar akuades 0,02 M 0,04 mL 0,08 mL 0,1 mL 0,12 mL

- Dipipet masing-masing 1 mL ke dalam tabung reaksi.

- Ditambahkan 8 mL reagen Lowry B, dikocok dan didiamkan.

- Ditambahkan 1 mL reagen Lowry A, dikocok dan didiamkan.

- Diukur absorbannya pada panjang gelombang maksimum.

Data