BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Protein ialah biopolimer yang terdiri atas banyak asam amino yang

berhubungan satu dengan lainnya lewat ikatan amida (peptida). Protein

memainkan beberapa peran dalam sistem biologis. Beberapa protein merupakan

komponen utama dari jaringan struktur (otot, kulit, kuku, rambut). Protein lain

mengangkut molekul dari satu bagian ke bagian lain dalam makhluk hidup. Masih

ada lagi yang bertindak sebagai katalis dalam banyak rekasi biologis yang

diperlukan untuk mempertahankan hidup.

Protein memegang peranan penting dalam makhluk hidup, perannya yaitu

dalam struktur, fungsi dan reproduksi makhluk hidup dan merupakan salah satu

bahan makanan yang sangat penting. Unsur-unsur utama yang membangun

molekul protein adalah karbon, nitrogen, dan oksigen. Molekul protein

mengandung pula unsur fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung

unsur logam seperti besi dan tembaga.

Untuk berbagai keperluan, kadar suatu protein dapat ditentukan.

Penentuan kadar protein dapat ditentukan. Penentuan kadar dalam bahan makanan

pada umumnya dilakukan berdasarkan peneraan empiris atau secara tidak

langsung, karena pembentukan kadar protein secara absolut sukar dilakukan

sehingga metode tersebut hanya dilakukan untuk keperluan yang mendasar saja.

Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode bergantung

pada jenis sampel dan ketersediaan alat serta bahan (pereaksi). Metode yang

paling umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan

Mempelajari dan memahami cara penentuan kadar protein dengan

menggunakan metode Lowry.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Menentukan kadar protein dalam suatu sampel melalui metode Lowry

dengan menggunakan spektronik 20D+.

1.3 Prinsip Percobaan

Menetukan kadar protein dengan metode lowry A dan lowry dengan

ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin

dan triftofan (merupakan residu protein) dan akan menghasilkan warna biru.

Intensitas warna diukur pada panjang gelombang maksimum dengan spektronik

20D+.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang

sangat bervariasi dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Disamping berat molekul

yang berbeda-beda. Ada protein yang mudah larut dalam air, tetapi ada juga yang

sukar larut dalam air. Rambut dan kuku adalah suatu protein yang sukar larut

dalam air dan tidak mudah bereaksi, sedangkan protein yang terdapat dalam putih

telur mudah larut dalam air dan mudah bereaksi (Poedjiadi, 1994).

Protein umumnya terbagi kedalam 2 golongan utama yaitu serat dan

globular. Protein serat adalah material struktural hewan dan dengan demikian

bersifat tidak larut dalam air, selanjutnya protein serat terbagi lagi menjadi tiga

kategori umum yaitu keratin yang menyusun jaringan pelindung seperti rambut,

kuku, kulit, bulu dan cakar. Kolagen yang membentuk jaringan ikat, seperti

tulang rawan, tendon dan pembuluh darah. Keratin dan kolagen memiliki struktur

helixs, sedangkan sutera mempunyai struktur lembaran terlipat. Sebagian besar

gugus R yang melekat pada kerangka ini tergolong non polar, yang menyebabkan

ketidak larutan protein ini dalam air (Hart, dkk., 2003).

Protein globular sangat berbeda dengan protein serat, protein ini

cenderung larut-air dan bentuknya hampir membulat. Protein bukanlah protein

struktural tetapi melakukan berbagai fungsi biologis lainnya. Contohnya adalah

sebagai enzim, hormon, protein penyangkut, dan sebagai protein penyimpan.

Protein globulur memiliki lebih banyak asam amino dengan rantai samping polar

atau ionik dibandingkan protein serat yang tidak larut air. Enzim dan protein

globulur melakukan fungsinya terutama medium berair (Hart, dkk., 2003).

Langkah pertama dalam pengenalan secara lengkap dari protein atau

peptida adalah menentukan struktur primer dan urutan dari asam amino, bila

peptida yang diisolasi itu homogen atau tidak siklik maka cara utama untuk

menentukan asam amino adalah pemisahan dari ikatan disulfida dengan gugus-SH

dan mentup semua gugus tersebut, analisis gugus samping, hidrolisa partial dari

peptida dilanjutkan dengan identifikasi dari bagian-bagiannya dan mementukan

urutannya (Fessenden, 1997)

Ada empat struktur dasar dari protein, yaitu struktur primer, sekunder,

tersier dan kuarterner. Struktur primer menunjukkan jumlah jenis dan urutan sama

amino dalam molekul protein. Oleh karena ikatan antar asam amino ialah ikatan

peptida maka struktur primer protein juga menunjukkan ikatan peptida yang

urutannya diketahui. Untuk mengetahui jumlah, jenis dan urutan asam amino

dalam protein dilakukan analisis yang terdiri dari beberapa tahap yaitu

(Poedjiadi, 1994) :

1. Penentuan jumlah rantai polipeptida yang berdiri sendiri

2. Pemecahan ikatan antara rantai polipeptida

3. Pemecahan masing-masing rantai poliptida

4. Analisis urutan asam amino pada rantai polipeptida.

Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam dua golongan besar,

yaitu golongan protein sederhana dan protein gabungan. Yang dimaksud dengan

protein sederhana adalah protein yang hanya terdiri atas molekul-molekul asam

amino, sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri atas protein dan

gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas

karbohidrat, lipid atau asam nukleat. Protein sederhana dapat dibagi dalam dua

bagian menurut bentuk molekulnya yaitu protein fiber dan protein globular.

Protein fiber mempunyai bentuk molekul panjang seperti serat atau serabut

sedangkan protein globular berbentuk bulat (Poedjiadi, 1994).

Stuktur primer protein merupakan rangkaian asam amino dan rangkaian

prostetik pembentuk protein, iakatan peptida merupakan faktor utama dalam

menentukan konformasi peptida. Ikatan hidrogen, tolakan keruagan, tarikan van

der waals, dan solvasi menunjang konformasi tiga matra protein

(Pine, dkk., 1988).

Struktur tersier menunjukkan kecenderungan popeptida membentuk

lipatan atau gulungan dan dengan demikian membentuk struktur yang lebih

kompleks. Struktur ini dimantapkan dengan adanya beberapa ikatan antara gugus

R pada molekul asam amino yang membentuk protein. Beberapa ikatan tersebut

misalnya ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, interaksi hidrofob antara rantai

sampingg non polar, interaksi dipol-dipol dan ikatan disulfida yaitu suatu ikatan

kovalen (Poedjiadi, 1994).

Struktur kuartener menunjukkan derajat unit-unit protein. Sebagian besar

protein globular terdiri atas beberapa rantai polipeptida yang terpisah. Rantai

polipeptida ini saling berinteraksi membentuk suaru struktur, contohnya enzim

fosforilase terdiri atas dua unit protein yang bila terpisah tidak memperlihatkan

aktivitas enzim, tetapi bila bersekutu membentuk enzim yang aktif, karena kedua

unit protein ini sama, maka disebut struktur kuartener homogen dan apabila unit-

unit itu tidak sama, misalnya virus mozaik tembakau, disebut kuatener heterogen.

Protein yang terdiri atas beberapa unit atau disebut oligomer pada umunya

mengalami konsentrasi tinggi (Pedjiadi, 1994).

Sifat-sifat protein salah satunya adalah ionisasi yang protein yang larut

dalam air akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan

membentuk ion negatif. Pada titik isolistrik protein mempunyai muatan positif

dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak kearah elektroda positif maupun

negatif apabila ditematkan di antara dua elektroda (Poedjiadi, 1994)

Protein merupakan suatu polimer heterogen dari molekul-molekul asam

aminoProtein yang terkandung dalam biji kedelai merupakan protein globuler.

Dalam protein globuler, rantai-rantai samping hidrofilik, polar, berada di bagian

luar dan rantai samping hidrofobik, non polar, tersusun pada permukaan dalam

(Septiani, 2004).

Protein gabungan adalah protein yang berikatan dengan senyawa bukan

potein. Gugus bukan protein ini disebut gugus prostetik. Ada beberapa jenis

protein gabungan antara lain mukoprotein, glikoprotein, lipoprotein dan

nukleoprotein. Mukoprotein adalah gabungan antara protein dan karbohidrat

dengan kadar lebih dari 4 % dihitung sebagai heksoamina. Glikoprotein juga

terdiri atas protein dan karbohidrat, tetapi dengan kadar heksoamina kurang dari

4%. Likoprotein adalah gabungan antara protein yang larut dalam air dengan

lipid. Likoprotein terdapat dalam serum darah, dalam otak dan jaringan saraf.

Nukleoprotein terdiri atas protein yang bergabung dengan asam nukleat. Asam

nukleat ini terdapat dalam inti sel (Poedjiadi, 1994).

Protein dan struktur-struktur yang terkait yang disebut polipeptida

merupakan polimer dari asam amino. Protein merupakan polimer dari 50 atau

lebih asam amino, beberapa protein mengandung lebih dari 800 unit asam amino.

Polipeptida adalah molekul kecil yang mengandung kurang dari sekitar 50 asam

amino. Beberapa polipeptida hormon penting dengan fungsi fisiologis seperti

nyeri dan kontrol tekanan darah mengandung 9 unit asam amino (Oullette, 1997).

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan

Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan induk

(BSA 1 mg/mL), Lowry B (Na2CO3 2 % dalam NaOH 0,1 N, larutan

Na-K-Tartrat 2 % dan larutan CuSO4.5H2O), Lowry A (larutan Follin Clocalteus

dan akuades), larutan sampel M-150, akuades, tissu roll dan kertas label.

3.2 Alat

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah buret 50 mL, statif,

rak tabung, tabung reaksi, gelas kimia 500 mL, pipet skala 0,2 mL dan 1 mL,

pipet volume 1 mL, pipet ukur 5 mL, filler pipet, labu semprot, gelas ukur 100

mL, pipet tetes, kuvet, spektrometer 20 D+, dan bulb.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Larutan Induk

Pada pembuatan larutan dilakukan dengan membuat larutan BSA

(Bovine Serum Albumin) 1 mg/mL dimana tiap 0,01 gram dilarutkan dengan

10 mL akuades.

3.3.2 Pembuatan Larutan Standar

Tabung reaksi 6 buah disiapkan. Larutan standar dibuat di dalam 6 buah

tabung reaksi tersebut dengan pengenceran larutan induk, seperti pada tabel di

berikut ini:

Tabel 1. Pembuatan larutan standar

Konsentrasi

(M)

Volume larutan

induk (mL)

Volume aquades

(mL)

Volume Total

(mL)

0,02 0,04 1,96 2,00

0,04 0,08 1,92 2,00

0,06 0,12 1,88 2,00

0,08 0,16 1,84 2,00

0,10 0,20 1,80 2,00

0,12 0,24 1,76 2,00

3.3.3 Preparasi Sampel

Untuk pengenceran 100X, preparasi sampel dilakukan dengan memipet

sampel sebanyak 0,02 mL kemudian diencerken sampai menjadi 2 mL dengan

cara ditambahkan akuades sebanyak 1,98 mL.

3.3.4 Pembuatan Pereaksi

3.3.4.1 Pereaksi Lowry A

Pada pembuatan pereaksi Lowry A yakni dengan pencampuran antara

follin-clocalteus dengan akuades dengan perbandingan 1 : 1, dimana diambil

larutan follin-clocalteus sebanyak 1,5 mL dan akuades sebanyak 1,5 mL

kemudian dihomogenkan.

3.3.4.2 Pereaksi Lowry B

Pembuatan Lowry B dilakukan dengan pencampuran antara Na2CO3 2%

dalam NaOH 0,01 N, larutan CuSO4.5H2O 1%, dan larutan Na-K-Tartrat 2%

dengan perbandingan 100 : 1 : 1. Dalam percobaan ini, diambil larutan Na2CO3

2% dalam NaOH 0,01 N sebanyak 25 mL, ditambahkan dengan 0,25 mL larutan

CuSO4.5H2O 1% dan ditambahkan lagi dengan 0,25 mL Na-K-Tartrat 2%,

dikocok-kocok agar larutan homogen.

3.3.4 Penentuan Kadar Protein

Tabung reaksi 6 buah yang berisi 2 mL larutan standar pada konsentrasi

berturut-turut 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 dan 1,2 mg/mL, 1 buah tabung reaksi yang

diisi blanko sebanyak 2 mL dan 1 buah tabung reaksi yang diisi 2 mL larutan

sampel, masing-masing ditambah dengan 2,75 mL reagen Lowry B, kemudian

dikocok dan didiamkan selama 10 menit. Setelah itu ditambah lagi dengan 0,25

mL larutan Lowry A, dikocok dan didiamkan pada suhu kamar selama 20 menit.

Lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

maksimum yaitu pada panjang gelombang 710 nm.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini akan ditentukan kadar protein dalam suatu sampel

dengan menggunakan metode Lowry. Penentuan kadar protein ini didasarkan

pada reaksi protein dengan asam fosfotungstat-fosfomolibdat pada suasana alkalis

akan memberikan warna biru yang mana intensitas dari warnanya bergantung

pada konsentrasi dari protein tersebut. Berdasarkan hal inilah sehingga kita dapat

mengukur absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer. Pada percobaan

ini dilakukan tiga persiapan yang utama sebelum diukur yakni mempersiapkan

larutan standar, larutan sampel dan pereaksi yang akan digunakan.

Sebelum mengukur absorban dari masing-masing larutan, terlebih dahulu

dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum. Larutan yang digunakan

untuk menentukan panjang gelombang maksimum yaitu larutan standar dengan

konsentrasi 0,06 mg/ml. Data panjang gelombang dapat dilihat pada tabel berikut:

Tabel 2. Data Penentuan Panjang Gelombang Maximum:

No Panjang Gelombang (nm) Absorban

1 630 0,278

2 640 0,281

3 640 0,287

4 640 0,288

5 640 0,292

6 640 0,294

7 0,289

8. 0,287

Grafik 1. Panjang Gelombang Maksimum

630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 7300.27

0.275

0.28

0.285

0.29

0.295

0.3

Dari grafik diatas maka daapat dilihat bahwa panjang gelombang

maksimumnya yaitu 650 nm. Jadi pengukuran absorban dilakukan dengan

panjang gelombang 650 nm.

Hasil pengukuran absorbansi larutan sampel dan larutan standar dengan

menggunakan spektronik 20 D+ adalah sebagai berikut :

Tabel 3. Data Penentuan Kadar Protein

No Larutan Contoh (mg/mL) Absorban (λ =685)

1 0,02 mg/mL 0,156

2 0,04 mg/mL 0,380

4 0,08 mg/mL 0,480

5 0,10 mg/mL 0,582

6 0,12 mg/mL 0,674

7 Sampel X 0,222

Berdasarkan tabel di atas, diperoleh grafik hubungan konsentrasi dengan

absorban sebagai berikut:

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.140

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 3.76142857142857 x + 0.0798666666666665R² = 0.916845493869679

Berdasarkan grafik hubungan konsentasi dan absorbansi, diperoleh

persamaan garis lurus Y= 3,761X + 0,079, sehingga kadar protein dalam sampel

dapat dihitung:

y = 3,761X + 0,079

1,100 = 3,761X + 0,079

x = 1,100−0,079

3,761

= 0,2715

Kadar protein dalam sampel = x . FP

= 0,2715 x 100

= 27,15 mg/mL

Dari hasil perhitungan, maka dapat diketahui bahwa kadar protein yang

terkandung dalam sampel M150 yaitu sebesar 27,15 mg/mL.

Larutan standar yang digunakan dalam percobaan kali ini berasal dari

larutan induk (BSA 1 mg/mL) yang telah disediakan sebelumnya, yang

diencerkan dengan konsentrasi yang berbeda. Larutan standar ini dibuat dengan

berbagai konsentrasi yaitui 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL,

0,10 mg/mL, dan 0,12 mg/mL. Dalam pembuatan larutan sampel, dilakukan

pengenceran dengan faktor pengenceran sebesar 100 kali. Pada pembuatan

pereaksi Lowry A digunakan larutan follin-clocalteus yang diencerkan dengan

menggunakan akuades dengan perbandingan 1 : 1. Asam fosfotungstat-

fosfomolibdat disini berfungsi memberikan warna pada larutan, yaitu warna biru,

dimana intensitas warnanya bergantung pada konsentrasi dari protein itu sendiri.

Sedangkan pada permbuatan pereaksi Lowry B yaitu dengan pencampuran antara

Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N, CuSO4.5H2O 1%, dan Na-K-tartrat 2% dengan

perbandingan 100 : 1 : 1. Bahan-bahan dalam pereaksi Lowry B ini memiliki

fungsi yang berbeda-beda dimana CuSO4 disini mereduksi fosfomolibdat dan

fosfotongstat, Na-K-Tartrat berfungsi mencegah terjadinya pengendapan kupro

oksida dalam reagen lowry B, sedangkan Na2CO3 digunakan sebagai garam yang

mengkoordinasikan reaksi dalam suasana basa bersama dengan NaOH. Setelah

mempersiapkan bahan-bahan, kemudian reagen Lowry B dicampurkan pada

larutan sampel, larutan sampel dan blanko kemudian dihomogenkan agar

bercampur dengan baik dan didiamkan selama 10 menit agar reaksinya berjalan

dengan sempurna. Setelah itu ditambahkan reagen Lowry A, dihomogenkan dan

didiamkan selama 20 menit, pada suhu kamar. Hal ini dilakukan agar reaksi

berjalan dengan sempurna. Setelah itu diukur dengan menggunakan

spektrofotometer dengan panjang gelombang maksimum (710 nm) yang ditujukan

untuk mengetahui absorban dari protein dengan menghitung %T yang diperoleh.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat diperoleh dari percobaan ini adalah kadar protein

yang terkandung dalam larutan sampel adalah 21,49 mg/mL.

5.2 Saran

5.2.1 Saran Untuk Laboratorium

Saran untuk laboratorium yakni sebaiknya bulb filler yang rusak dapat

diganti dan diperbanyaknya kuantitasnya, agar proses praktikum dapat berjalan

dengan lancar.

5.2.2 Untuk Percobaan

Saran yang dapat saya berikan kepada percobaan yakni ada baiknya jika

kita juga menggunakan metode yang lain dalam menentukan kadar protein dalam

larutan sampel.

.

DAFTAR PUSTAKA

Fessenden, J.R., dan Fessenden S.J.,1997, Dasar-Dasar Kimia Organik, Binarupa Aksara, Jakarta

Hart, H., Craine, L.E., dan Hart, J.D., 2003, Kimia Organik edisi kesebelas, diterjemahkan oleh Suminar Setiati Achmadi, Erlangga, Jakarta.

Pine, H.S., Hendricson, B.J., Cram, J.D., 1988, Kimia Organik, ITB, Bandung

Poedjadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.

Oullette, R.J., 1997, Organic Chemistry, Macmillan Publishing Company, New York.

Septiani, Yona., Tjahjadi P., Artini P., 2004, Kadar Karbohidrat, Lemak, dan Protein pada Kecap dari Tempe, Bioteknologi 1, vol (2), 48-53, (http://www.google.com), diakses tanggal 6 Maret 2014, pukul. 16.00 WITA.

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 7 Maret 2014

Asisten Praktikan

(Sartika) (Yunita Pare Rombe)

PERHITUNGAN1. Larutan Induk

BSA 1 mg/mL1 mg 1 mL x 10 mL x 0,01 g dilarutkan dalam labu ukur 10 mL hingga batas tanda.

2. Larutan Standar

a. Konsentrasi = 0,02 mg/mL

V1M1 = V2M2

V1 .1 mg/mL = 2 mL. 0,02 mg/mL

V1 = 0,04 mL

a. Konsentrasi = 0,04 mg/mL

V1M1 = V2M2

V1 .1 mg/mL = 2 mL. 0,04 mg/mL

V1 = 0,08 mL

b. Konsentrasi = 0,06 mg/mL

V1M1 = V2M2

V1 1 mg/mL = 2 mL. 0,06 mg/mL

V1 = 0,12 mL

c. Konsentrasi = 0,08 mg/mL

V1M1 = V2M2

V1 1 mg/mL = 2 mL. 0,08 mg/mL

V1 = 0,16 mL

d. Konsentrasi = 0,10 mg/mL

V1M1 = V2M2

V1 1 mg/mL = 2 mL. 0,10 mg/mL

V1 = 0,20 mL

e. Konsentrasi = 0,12 mg/mL

V1M1 = V2M2

V1 1 mg/mL = 2 mL. 0,12 mg/mL

V1 = 0,24 mL