39

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini adalah penelitian true eksperiment

terhadap tikus putih dengan menggunakan 3 kelompok perlakuan dan 2

kelompok kontrol. Penelitian bersifat preventif sehingga dilaksanankan

dengan menggunakan Post Test-Only Control Group Design. Setelah

tikus melalui masa adaptasi, peneliti mengukur intervensi yang diberikan

kepada masing-masing kelompok perlakuan, kemudian membandingkan

hasil pengukuran dengan kelompok kontrol. Pemilihan objek penelitian

untuk pengelompokan dalam perlakuan menggunakan metode Simple

Random Sampling karena tikus, bahan pakan tikus, dan tempat penelitian

dapat dikatakan homogen. Hasil yang akan diteliti adalah perbedaan

kadar kolesterol darah pada kelompok perlakuan dan kontrol.

Pada penelitian ini kelompok perlakuan dibagi menjadi 5 kelompok

yaitu:

1. Kelompok kontrol negatif (P0): kelompok tikus yang hanya diberi

pakan diet normal 30,5 g/hari selama 8 minggu

2. Kelompok kontrol positif (P1): kelompok tikus yang hanya diberi

pakan diet aterogenik 25 g/hari selama 8 minggu

3. Kelompok perlakuan (P2): kelompok tikus yang diberi pakan diet

aterogenik 25 g/hari dan tepung iles-iles kuning dosis 1 selama 8

minggu

40

4. Kelompok perlakuan (P3): kelompok tikus yang diberi pakan diet

aterogenik 25 g/hari dan tepung iles-iles kuning dosis 2 selama 8

minggu

5. Kelompok perlakuan (P4): kelompok tikus yang diberi pakan diet

aterogenik 25 g/hari dan tepung iles-iles kuning dosis 3 selama 8

minggu

4.2 Populasi dan Sampel

4.2.1 Populasi Penelitian

Pada penelitian ini binatang coba yang digunakan adalah tikus

jenis (Rattus novergicus) strain Wistar yang dipelihara di Laboratorium

Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

Pemeliharaan tikus dilakukan dalam kandang bebas patogen penyakit.

4.2.2 Randomisasi dan Desain Layout

Agar setiap percobaan mempunyai peluang yang sama untuk

mendapatkan perlakuan, maka dalam pengambilan sampel dilakukan

pengacakan dengan langkah langkah sebagai berikut:

1. Berikan nomor urut 1-30 pada sampel

2. Ambil bilangan random sebanyak sampel dengan menggunakan

angka acak

3. Beri rangking pada bilangan random yang diperoleh. Tabel

randomisasi dapat dilihat pada lampiran 1.

Dengan demikian hasil randomisasi menunjukkan kelompok

kontrol negatif (P0) terdiri dari peringkat 3, 10, 27, 5, 9, 26;

41

kelompok kontrol positif (P1) terdiri dari peringkat 21, 23, 7, 14, 13,

30; kelompok perlakuan (P2) terdiri dari peringkat 15, 8, 4,6, 2, 24;

kelompok perlakuan (P3) terdiri dari peringkat 18, 11, 29, 1, 12,

19; kelompok perlakuan (P4) terdiri dari peringkat 22, 20, 28, 16,

17, 25.

4. Kemudian masukkan jenis perlakuan dalam sampel pada

rancangan penelitian sebagaimana disajikan pada tabel berikut:

Tabel 4.1 Desain Layout Penelitian

1

P3

2

P2

3

P0

4

P2

5

P0

6

P2

7

P1

8

P2

9

P0

10

P0

11

P3

12

P3

13

P1

14

P1

15

P2

16

P4

17

P4

18

P3

19

P3

20

P4

21

P1

22

P4

23

P1

24

P2

25

P4

26

P0

27

P0

28

P4

29

P3

30

P1

42

4.2.3 Estimasi Jumlah Pengulangan

Dalam penelitian ini terdapat 5 perlakuan, maka jumlah binatang

coba untuk masing-masing perlakuan dapat dicari dengan menghitung

besaran sampel menggunakan rumus Kemas (2005) sebagai berikut :

n =jumlah pengulangan/besar sampel dalam kelompok

t = jumlah perlakuan/banyaknya kelompok (5 kelompok)

Maka jumlah sampel yang dibutuhkan dalam kelompok adalah :

dibulatkan menjadi 5

Jadi, jumlah minimal tikus untuk masing-masing perlakuan adalah 5 ekor

dan disiapkan 1 ekor sebagai cadangan. Sehingga, tikus yang digunakan

untuk masing-masing perlakuan adalah 6 ekor, dan untuk 5 kelompok

perlakuan dibutuhkan 30 ekor tikus.

4.2.4 Prosedur dan Teknik Pengambilan Sampel

Seluruh tikus sampel yang tersedia dikelompokkan menjadi 5 kelompok

perlakuan berdasarkan Simple Random Sampling, sehingga tiap tikus

memiliki peluang yang sama untuk semua kelompok.

43

4.2.5 Kriteria Hewan Percobaan

Tikus jenis Rattus novergicus strain wistar

Jenis kelamin jantan

Usia 8-12 minggu

Berat badan ± 200 g

Warna bulu putih bersih

Anggota badan lengkap, dan tidak cacat, gerakan aktif, mata jernih

Tikus sehat dan tidak menderita penyakit

Tidak mendapat pengobatan sebelumnya

4.3 Variabel Penelitian

Variabel bebas pada penelitian ini adalah pemberian per oral dosis

tepung iles-iles kuning, sedangkan variabel terikat pada penelitian ini

adalah kadar kolesterol darah pada tikus coba.

Variabel kendali adalah variabel yang dapat dikendalikan oleh

peneliti agar objek penelitian selalu terkendali dan dalam keadaan

homogen. Variabel kendali dalam penelitian ini meliputi hal-hal sebagai

berikut:

1. Jenis tikus

2. Umur tikus

3. Jenis kelamin tikus

4. Berat badan awal

5. Pemberian diet aterogenik

6. Kondisi lingkungan kandang

7. Pemberian per oral tepung iles-iles kuning dengan sonde

44

4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.4.1 Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi untuk

pemeliharaan hewan coba, dan Laboratorium Faal Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya Malang untuk pengukuran kadar kolesterol darah.

Penelitian ini berlangsung selama dua bulan, yaitu dari bulan Juli 2011

sampai dengan bulan September 2011.

4.5 Bahan dan Alat Penelitian

4.5.1 Bahan Penelitian

4.5.1.1 Bahan Pakan Tikus

1. Diet Normal dan Diet Aterogenik

Dalam penelitian ini terdapat dua macam pakan tikus yaitu pakan

diet aterogenik untuk tikus kelompok kontrol positif (P1) dan kelompok

perlakuan yang juga diberikan tepung iles-iles kuning dosis 0,16 g/hari ,

0,32 g/hari , 0,64 g/hari (P2 sampai P4), serta pakan diet normal untuk

kelompok kontrol negatif (P0). Pakan normal terdiri dari comfeed PARS,

tepung terigu dan air secukupnya sedangkan diet aterogenik terdiri dari

PARS, tepung terigu, kolesterol 2%, minyak babi 5%, asam kolat 0,2%

dan air secukupnya (Muwarni, 2005).

Kebutuhan makan tikus dewasa per ekor untuk diet normal adalah

30,5 g dan untuk diet aterogenik adalah 25 g dengan energi yang sama

yaitu ± 104 kalori. Prinsip pemberian ransum pada beberapa perlakuan

adalah isokalori, yaitu masing-masing jenis pakan tikus yang diberikan

45

memiliki kandungan kalori yang hampir sama, tetapi memiliki berat dan

komposisi yang berbeda. Komposisi diet tikus dapat dilihat pada lampiran

2 dan 3.

2. Tepung iles-iles kuning

a. Dosis iles-iles

Tepung iles-iles kuning yang digunakan adalah tepung yang berasal

dari iles-iles kuning dari daerah Jawa Timur. Penggunaan dosis

didasarkan akan kebutuhan serat manusia yang kemudian dikonversi

ke kebutuhan serat tikus coba menggunakan persamaan sebagai

berikut (Harmita, 2008):

Kebutuhan serat larut air manusia 6 g/hari (Titissari, 2010)

Jumlah serat larut air (glukomanan) dalam 100 g tepung iles-iles

kuning 65 g

Berat badan rata-rata manusia 70 kg

Berat badan rata-rata tikus 200 g

Kebutuhan serat larut air tikus/hari

Kebutuhan serat larut manusia x faktor konversi dosis untuk tikus (0,018)

Sehingga: 6 g/hari x 0,018 = 0,108 g/hari

Kebutuhan tikus konsumsi tepung iles-iles kuning

Kebutuhan serat larut tikus (g) = X jumlah tepung iles-iles

Kadar serat larut air tepung (g) 100 gram tepung iles-iles

0,0108 = X

65 100

46

X = 0,16 g

Jadi, dalam penelitian ini terbagi menjadi 3 dosis, yaitu

- Dosis I: 0,16 g/200gBB/hari

- Dosis II: 0,32 g/200gBB/hari (2x dosis I)

- Dosis III: 0,64 g/200gBB/hari (4x dosis I)

4.5.2 Alat Penelitiaan

4.5.2.1 Alat Pemeliharaan Binatang Coba

Kandang dari bak plastik

Tutup kandang yang terbuat dari anyaman kawat

Botol air untuk minum

Timbangan analitik

Alat untuk memantau keadaan tikus: form pemantauan harian,

timbangan untuk mengukur BB tikus

4.5.2.2 Alat Pengambilan Sampel Darah Binatang Coba

jarum suntik dan spuit disposable

tabung untuk penyimpanan serum

mikropipet

sentrifuge

4.5.2.3 Alat Pengukuran Serum Kolesterol

mesin Cobas Mira

cuvet disposable

rak reagen, rak sampel

mikro pipet 100 µl, mikro pipet 500 µl, mikro pipet 1000 µl

yellow tip dan blue tip

4.5.2.4 Alat Pembuatan Ransum Makan Tikus

Sendok

47

Timbangan analitik untuk mengukur kebutuhan tepung iles-iles

kuning dan diet aterogenik

Baskom

Pengaduk

Sarung tangan

4.5.2.5 Alat Pemberian Tepung Iles-iles

Tepung iles-iles kuning dicampur dengan air hingga mencapai 3 ml,

lalu diberikan pada tikus melalui spuit yang ujungnya dipasangi suatu

sonde yang bisa melewati mulut, esophagus hingga lambung

4.6 Definisi Operasional

4.6.1 Tepung Iles-iles

Tepung iles-iles kuning merupakan tepung yang terbuat dari umbi iles-iles

kuning dengan kandungan glukomanan sebesar 33%, kemudian

diberikan kepada tikus melalui sonde berdasarkan 3 dosis yang telah

ditetapkan.

4.6.2 Diet Aterogenik

Diet yang digunakan untuk meningkatkan kadar kolesterol total dalam

tubuh tikus diberikan selama 8 minggu dengan kandungan berupa :

PARS, tepung terigu, kolesterol 2%, minyak babi 5%, asam kolat 0,2%,

dan air secukupnya (Muwarni, 2005).

48

4.6.3 Diet Normal

Diet normal merupakan ransum yang komposisinya terdiri dari Confeed

PAR-S sebanyak (53%), tepung terigu sebanyak (23.5%), dan air

sebanyak (23.5%)

4.6.4 Kadar Kolesterol Darah

Besarnya kadar kolesterol darah tikus dalam satuan mg/dl yang diperoleh

dari pengujian serum darah tikus dengan menggunakan alat Cobas Mira

setelah 8 minggu perlakuan

4.6.5 Dosis tepung iles-iles kuning

Besarnya jumlah pemberian tepung iles-iles kuning (dosis I : 0,16

g/200gBB; dosis II : 0,32 g/200gBB; dosis III : 0,64 g/200gBB) per hari

yang diberikan kepada tikus strain wistar pada masing-masing perlakuan

49

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Pengkondisian Hewan Coba

Tikus jantan dengan berat badan sekitar 200 gram akan

ditempatkan pada suhu 25 ± 1º C dengan siklus cahaya selama 12 jam

30 ekor tikus wistar

Pakan normal ± 1 minggu dan pengondisian lingkungan

Menimbang berat badan tikus

Randomisasi

Diet normal kontrol (-)

Diet aterogenik kontrol (+)

Diet aterogenik + 0,16 g/200gBB/hari tepung iles-iles kuning yang

dibuat larutan

Diet aterogenik + 0,32 g/200gBB /hari tepung iles-iles kuning yang

dibuat larutan

Diet aterogenik + 0,64 g/200gBB /hari tepung iles-iles kuning yang

dibuat larutan

8 minggu

Pengambilan darah tikus dan penghitungan kadar kolesterol darah tikus

Analisa data

Konsumsi pakan perhari dihitung dari berat awal dan berat akhir pakan

50

(08.00-12.00). Semua hewan coba akan diberikan diet normal yaitu

berupa komposisi comfeed PARS, tepung terigu dan air selama 1 minggu

dan diberikan secara ad libitum. Setelah pengkondisian selama 1 minggu,

hewan coba akan dilakukan penimbangan berat badan untuk kemudian

dibagi secara acak kedalam kelompok negatif, kelompok positif, dan

kelompok perlakuan.

4.7.2 Pemberian Pakan dan Tepung Iles-iles Kuning

Kelompok negatif akan diberikan diet normal berupa komposisi

comfeed PARS, tepung terigu, dan air. Kelompok positif akan diberikan

diet aterogenik berupa komposisi kuning telur, lemak kambing, minyak,

minyak babi, asam kolat, PARS, dan terigu. Diet normal dan diet

aterogenik serta minuman diberikan secara ad libitum. Pada kelompok

perlakuan P2 sampai P4, akan diberikan diet aterogenik yang disertai

dengan pemberian tepung iles-iles kuning yang sudah dilarutkan melalui

sonde.

Untuk kelompok kontol negatif dan positif akan dilakukan sonde

plasebo untuk menyamakan tingkat stress akibat sonde pada semua

kelompok perlakuan. Pemberian tepung iles-iles sesuai dengan dosis

yang telah ditentukan yaitu 0,16 g/200gBB/hari, 0,32 g/200gBB/hari, dan

0,64 g/200gBB/hari dengan memperhatikan volume lambung tikus.

Volume cairan lambung tikus dalam keadaan nyaman penuh adalah 3,38

± 0,52 ; merenggang 4,63 ± 0,44 dan penuh makanan 6,63 ± 0,92

(Harmita, 2008)

51

4.8 Pengumpulan Data

Teknik pengumpulan data dilakukan dengan pengambilan darah

tikus dan penghitungan kadar kolesterol darah pada tikus. Data yang

dikumpulkan meliputi:

1. Berat badan tikus yang diperoleh dari penimbangan tikus setiap hari

2. Data asupan makanan perhari dihitung dari sisa makanan yang

diberikan pada hewan coba setiap harinya

3. Kadar kolesterol darah tikus yang diperoleh dari pengambilan darah

pada tikus

4.9 Analisa Data

Data yang didapat dianalisis menggunakan program SPSS 16 for

windows. Seluruh data yang ada diuji dengan menggunakan test of

homogeneity of variances untuk mengetahui bahwa semua data

homogen. Kemudian, dilanjutkan dengan uji one-way ANOVA untuk

mengetahui adanya perbedaan kadar kolesterol darah antar kelompok.

Jika terdapat perbedaan, maka dapat dilanjutkan dengan uji Post Hoc

Tuckey untuk mengetahui perbedaan tiap kelompok. Uji statistik dilakukan

dilakukan pada tingkat kepercayaan 95% (α = 0,05), perbedaan dikatakan

bermakna jika p < 0,05.