Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan r eknologi IsolOp dan Radias~ ZOOO

PEMBENTUKAN RADlKAL BEBAS PADA GRAFT TULANG MANUSIADAN BOVINE lRADIASI

Basril Abbas, Sutjipto Sudiro, daD Nazly Hilmy

Puslitbang Teknologi Isotop dan Radiasi, BATAN, Jakarta

ABSTRAK

PEMBENTUKAN RADIKAL BEBAS P ADA GRAFTS TULANG RAW AN MANUSIA DAN SAPIIRADIASL Graft tulang rawan rnanusia dan bovine liofilisasi steril- radiasi sebagai "allograft" dan "xenograft"telah diproduksi dan digunakan secara rutin di bidang ~~~gi di Indonesia. Dari studi radiobiologidiketahui bahwa salah satu efek dari radiasi ionisasi pada spe~ies biologi adalah dihasilkannya radikal bebasyang mempengaruhi fi.J)iko-kimia daD juga sifat mekanik dari tulang iradiasi. Tujuan penelitian ini adalah untukmengetahui pembent~ bebas dari tulang rawan liofilisasi-radiasi yang diproses dengan metode "TripleA" (Autolyzed Antigen-Extracted Allograft) produksi oleh Batan Research Tissue Bank, Jakarta. Tulang rawandisiapka11 menurut cara AATB (American Association of Tissu Bank). Graft tulang diiradiasi dengan dosis 10,20, daD 30 kGy dengan laju dosis 7,5 kGy/h pada temperatur kamar (30 °C :t 2 °C). Pengukuran radikal bebasdilakukan pada temperatur 24 °C :t 1°C, 30 menit setelah iradiasi dan pengukuran dilanjutkan hinggapenyimpanan 9 bulan menggunakan JES-REIX ESR Spectrophotometer (JEOL) dengan standar Mn ++. Parameteryang diukur adalah efek penggilingan tulang secara mekanik, perendaman tulang iradiasi, dan dosis iradiasiterhadap pembentukan radikal bebas dalam tulang. Hasilnya menunjukkan bahwa luas spektrurn ESR dari tulangbovine dosis 30 kGy lebih tinggi dari tulang rawan lnanusia yaitu berturut-turut 1,4 x 107 dan 6,4 X 106 Au(arbitrry unit)/ g sampel. Spek1rum ESR meningkat seCara linear dengan pertambahan dosis iradiasi dalam rangedosis 10 -30 kgy daD menurun 30% akibat perendarnan dalam air. Sinyal ESR menurun dengan tajam setelah duahari penyimpanan dan kemudia11 meluruh perlahan sampai 14 hari dan kemudian konstall hingga 9 bulanpenyimpanan pada temperatur kamar. Penggilingan tulang dengan mesin dapat menghasilkan radikal bebas.

Kata Kunci : radikal bebas, iradiasi, graft tUlaJlg maJlusia, graft tulaJlg sapi, penggilingan mekanis

ABSTRACT

FREE RADICALS FORMATION OF IRRADIATED LYOPillLIZED CAN-CELLOUS HUMANAND BOVINE BONE. Radiation sterilization of Iyophlized human and bovine bone as allograft and xenografthave been produced and used in orthopaedic practice in hldonesia routinely. It is well known from radiobiologicstudies that one of the most pronounce effects of ionizing radiation on biologic species produced the free radicalsthat influence the physico-chemical as well as the mechanical properties of irradiated bone. The aim of our studyis to investigate the free radicals formation of irradiated Iyophilzed cancellous triple A bone (Autolyzed Atltigen-Extracted Allograft) produced by Batan Research Tissue Bank in Jakarta. The cancellous triple A were preparedaccording to AA TB (American Association of Tissue Bank) method. Gamma Irradiation was done at doses of 10,20, and 30 kGy with a dose rate of 7.5 kGy& at room temperature (30 °C :!: 2 °C). Measurement of free radicalswas done at 24 °C :!: I °C within 30 minutes after irradiation and measurement were continued up to 9 months ofsotrage using a JES-REIX ESR Spectrophotometer (JEOL) with Mn++ standard. Parameters measured, were theeffects of mechanical grinding, water immersion and irrljdiation dose on free radicals formation in the bone.Results show that the signal area of ESRspectra from irradiated bovine bone of 30 kGy was higher than those ofhuman bone i.e. 1,4 x 107 dan 6,4 x lOb Au (arbitrry unit)! g satnples respectively. The signal of ESR spectraincreased linearly with increasing dose in the range of 10-30 kgy and it will reduce about 30% caused by waterilnmersion. The ESR signal reduced sharply after 2 days and gradually decreased up to 14 days and then becameconstant up to 9 months of storage at room temperature. A certain method of crushing can produce free radicals.

Key Words: free mdicals, irradiation, allograft, xenograft, mechanical-grinding

PENDABULUAN

Penggunaan jaringan manusia untuk tujuan terapi

mempunyai sejarah yang panjang. Konsep penyimpananjaringan untuk memperpanjang masa simpannya sebelumdi transplantasi atau diimplantasi diawali denganberdirinya bank jaringan pertama di Bathesda, USA padatahun 19501. Walaupun tulang dan jaringan lunak lainnyamerupak.w sesuatu yang biasa digunakan dalam

rekonstruksi sistem muskuloskeletal, tetapi jaringantersebut jarang tersedia.

Oi Indonesia, padatahun 1990 di Pusat Penelitianclan Pengembangan teknologi Isotop clan Radiasi(p3TIR -BATAN) telah didirikan Bank JaringanSurgical pertama yang diberi nam Batan Research TissueBank (BRTB). Oi samping memproduksi amnion graft,BRTB juga memproduksi graft tulang manusia clanbovine liofilisasi steril-radiasi sebagai allograft clan

,'7

Risalah Peltemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan r eknologi IsOIOp dan Radia~ 2tXXJ

11ari ke dua, dan relatif kecil hingga 11ari ke 14 dan relatifstabil hingga penyimpanan 9 bulan. Hal ilU disebabkankarena di dalam tulang terdapat dua komponen kimiapokok yaitu komponen organik yang disebut denganrase kolagen dan komponen anorganik yang disebutdengan rase hidroksiapatit 1.4. Radikal yang berasal darikolagen merupakan radik31 yang tidak stabil sehinggapenumnan jumlall radikal bebas selalna penyimpananrelatif lebih cepat.

Gambar 4 menunjukkan spektnun ESR daTisampel tulang yang digiling menggunakan mesinpenggiling dan mortar. Tulang yang digilingmenggunakan mesin dapat menghasilkan radikal bebasdengan pola yang sarna dengan tulang yang diiradiasidengan sinar gamma, sedangkan tulang yang ditumbukdengan menggunakan mortar, spektmm radikalnya tidakterdeteksi.

.'

IM'O :lOJII 10011 .."..

~ 12~'-'~ 10r/)~~ 8

~c9; 6

~~ 4

--~'I\' )\,/"\/ ,-"". t 0'

--./'0 /'--

Gambar 4. Spektrum ESR dari tulang yang digilingdengan : (a) Mortar (b) Mesin

2 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

0 20 40 60 80100120140160180200220240260280

Waktu Penyimpanan (hari) Gambar 5 menunjukkan radikal bebas yangterbentuk pacta tulang setelah diiradiasi dan tuiangiradiasi yang direndam di dalam air selama 30 meDii.Jumlah radikal bebas daTi tulang iradiasi yang direndamdi dalam air menurun 30% dibandingkan dengan tanpaperendaman. Hal ini membuktikan bahwa sebahagiandaTi radikal bebas yang terbentuk di didalam tuiangiradiasi dapat larut.

Gambar 2. Luas spektrum ESR (Au) dari tulang iradiasipad a temperatur 24 DC.

10"0 20,.. Joost lO...

Menurnt STATCHOWITCZ, dkk (1971Yo radikalbebas yang berasal dari kolagen menurnn selamapenyimpanan 6 -10 hari. Selanjutnya radikal yangberasal daTi hidroksiapatit adalah radikal yang stabil.Pacta penelitian ini radikal bebas relatif stabil setelah14 hari hingga 9 bulan penyimpanan.

Luas spektrum ESR daTi tulang iradiasiberbanding lurns dengan dosis iradiasi, dan selamapenyimpanan pacta subu karnar radikal bebas yang tidakstabil menurun sampai 50% sampai hari ke 14penyimpanan (Gambar 3). Penurunan radikal bebastersebut berlaku untuk ketiga dosis iradiasi (10, 20, dan30 kGy).

Gambar 5. Spektrum ESR dari tulang yang diiradiasidengan dosis 30 kGy :---: Direndam di dalam air selama 15 menit

-: Tanpa perendaman

Gambar 6 adalah luas spektrum ESR dari tulangmanusia daD bovine yang diiradiasi 30 kGy. lumlahradikal bebas dari tulang bovine terlihat lebih tinggidibandingkan dengan tulang manusia yaitu 1,4 xl07 daD6,5 x 106 Au (Arbitrary Unit)/g sampel. Hal inimembuktikan bahwa kandungan hidroksiapatit (fasemineral) di dalmn tulang bovine lebih tinggidibandingkan dengan tulang manusia, karena menurutOstrowski et. al. (1974 Y I, semakin tinggi kandunganmineral di dalmn jaringan biologi iradiasi semakin tinggi

Gambar 3. Hubungan antara luas spektrum ESR dengandosis iradiasi pad a 24 DC.

59

Risalah Pet1emuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan I eknolo.qi IsOlop dan Radias~ 2{)(x)

Resonance (ESR) Spectrophotometer model .JES-REIX(JEOL) buatan Jepang.

Percobaan: Tulang dipotong dengan ukuran Icmx lcm menggunakan band saw. Unhlk merninimalkankandungan marrow daD lemak, tulang dicuci dengan airdaD khloroform-metanol (I: I). Chip tulang dikeringkandengan cara liofilisasi menggunakan freeze-dryer ChristBeta-1 selama 72 jam hingga kadar air mencapai 5%.Tulang liofilisasi di tumbuk di dalam mortar dansebagian lagi digiling dengan mesin. Sampel diiradiasidengan sinar gamma Co-60 pacta temperatur 30 DC :t 2DC dengan dosis 10, 20, daD 30 kGy daD laju dosisnya7,5 kGy/jam. Sebagian dari sampel iradiasi direndamselama 30 menit daD dikeringkan kembali dengan freeze-dryer. Radikal bebas yang terbentuk diukur denganElectron Spin Resonance (ESR) Spektrofotometer modelJES-REIX (JEOL) 30 menit setelah iradiasi hinggapenyimpanan 9 bulan. Kondisi pengukuran sebagaiberikut: Temperatur 24 DC :t I DC, frequency 9,4350Ghz, lnicrowive power I mW, centre field 335,5, sweepwidth I x 10 ruT, sweep time 1,0 ruin, modulation widtll1,25 x 0,1, time constant 0,03 sec, dan humidity 50%.

Parameter yang diukur adalah efek penggilingan,perendaman, daD dosis iradiasi terhadap pembentukanradikal bebas di dalam tulang rawan rnanusia daD hewanyang diproses dengan metode triple A. Radikal bebasyang terbentuk dihitung berdasarkan luas spektrum ESR

per gram sampel.

xenograft. Hingga saat ini graft produksi BRTB telahdipakai dibeberapa mmah sakit di Indonesia secara rutindan dari basil uji klinik yang dilakukan, xenograftproduksi BRTB tidak menunjukkan reaksi imunologi

pacta resipien2.3.Salah satu lnisi dari BRTB adalah

memperkenalkan radiasi untuk tujuan sterilisasi jaringanbiologi, khususnya graft yang siap untukdiimplantasikan. Metoda sterilisasi dengan teknik iradiasikhususnya sinar gmnma mempunyai keunggulan antaralain: kemanlpuan penetrasi yang baik, kenaikan SuilUselama proses sterilisasi relatif kecil sehingga disebutjuga dengan proses dingin, dan sampel jaringan dapatdisterilkan dalam kondisi yang telah dikemas sehinggakontmninasi setelall sterilisasi dapat dihindari4.Sebaliknya penggunaan radiasi sebagai metoda sterilisasipacta graft mempunyai beberapa kelemahan. Satu diantaranya ialall meningkatnya radikal bebas di dalmnjaringan yang telall diiradiasi. Hasil dari beberapapeneliti menunjukkan ballwa graft tulang yang diiradiasipacta temperatur kalnar menglmsilkan konsentrasi radikalbebas relatif tinggi namun demikian komponenparamagnetik ESR yang berasal dari kolagen turun dalamwaktu 6-10 hari penyimpanan5. Radikal bebas yangdihasilkcw dari ballaD organik tulang atau rase kolagenberumur pendek dan akan llilang di dalam udara.Sebaliknya radikal yang stabil berumur panjang yangdiidentifikasi sebagai hidroksiapatit atau rasa minerall.6.Diduga ballwa radikal bebas dapat menyebabkanperubahan kimia dan fisika graft tulang7,8.

Tujuan penelitiml adalall untuk mengetahuipembentukan radikal dari ttllang rowan manusia danbovine liofilisasi radiasi yang disiapkan sebagai triple Aoleh Batan Research Tissue Bank,

HASIL DAN DISKUSI

Gambar I menunjukkan spektnun ESR tulangiradiasi, dosis 0, 10, 20, dan 30 kay, yang diobservasi30 menit setelah diiradisi. Garis spektrnm yangditunjukkan oleh tanda panah adalah spektnun mangan,yang digunakan sebagai penanda dari ESR. Spektnuntersbut terlihat secara konsisten pacta semua tingkat dosisiradiasi dari semua sampel.

BAHAN DAN METODA

Bilhan: Tulang lnanusia didapatkankan dariRumall Sakit Siaga Raya, Jakarta. Tulang caput femur dialnbil dari pasien melalui operasi hip replacement,kemudian secara aseptis dimasukkan kedalam kantongplastik poli etilen steril di kamar operasi. Plastik yangberisi tulang dimasukkan ke dalam kontainer yang berisies daD dibawa ke Batan Rese.1rch Tissue Bank.

Tulang femur daD tibia dari bovine yang berumurkurang dc1fi 2 tallun didapat dari RUlnah Potong Hewan(RPH) Darma Jaya, Jakarta. Masing-masing tulangpanjang tersebut dimasllkkan ke dalam kantong plastikpoli etilen steril, kemudian dengan menggunakankontainer yang berisi es tulang tersebut dibawa ke BatanResearch Tissue Bank. Dari kedua jenis hllang tersebutdisiapkan graft huang sebagai allograft daD xenograftdengan metode triple A, menurut American Associationof Tissue Bank (AATB)9.

..0 '0'.'

,co..~

r-~/'-- I.'

... ~. ""'(m" 'to .t.

Spektrum ESR dari tulang bovine iradiasi (a) 0kGy, (b) 10 kGy, (c) 20 kGy, (d) 30 kGy

Gambar

Peralatan: Alat yang digunakaIl daiaIn percobaanini antara lain: lradiator IRPASENA dengaIl smnberiradiasi Co-60, Band saw model AEW buataIl Italia,Lmnpang beserta ahmya, mesin penghaIlcur tuIang merkJANKE & KUNKEL buatan Jennan, Freeze-dryer modelChrist Beta I buatan Jennan, dan Electron .Spin

Berdasarkan luas spektrum radikal bebas daTisignal ESR setelall 30 menit hingga 9 bulan

penyimpanan sebagaimana yang ditunjukkan pactaGambar 2, maka dapat dijelaskan bahwa radikal bebasdari tulang yang diiradiasi menurun dengan cepat sampai

58

Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan r eknologi IsOIOp dan RadiaSl; 2CXXJ

pula radikal bebas yang terbentuk. Baik radikal bebasyang terdapat pacta tulang bovine maupWl tulang I1laDusiairadiasi mempunyai karakteristik yang SaJna yaitumenurun dari hari pertalna pengukuran hingga hari ke 14dengan jUmlaIl yang relatif saJna, selanjutnya konstanllingga 6 bulaJl.

KESIMPULAN

Dari penelitian dapat disimpulkan bahwa:1. Radikal bebas yang terjadi di dalam tulang bukan saja

disebabkan oleh radiasi, tetapi dapat pula disebabkanoleh penggilingan dengan mesin.

2. Radikal bebas menunm hingga 14 hari dan relatifstabil hingga 9 bulan

3. Semakin tinggi kandungan air di dalam tulangsemakin turun radikal bebas ang terbentuk

4. Jumlah Radikal bebas dari tulang iradiasi yang direndam di dalam air selarna 30 menit dapat turunhingga 30%.

5. Jumlall radikal bebas tulang "bovine" lebih tinggidibandingkan dengan tulang manusia.

DAFTARPUSTAKA

<0+wCI-'5"~(k:U)wE~L--~Q)a.

U)onca~

..JTOMFORD, W. W., Musculoskletal Tissue banking,

Raven Press, New York, pp 149-180 (1992).

2. DARWONO,B., Experiences on Autograft,Hydroxyapatite, Allgrafi, and Xenograft Usedon Orthopadic Surgery in Gatot Subroto ArmyHospital, Symposium and Workshop on "Tissue-organ Banking and Trauma", Oct. 19-20, 1995,Jakarta, Indonesia.

Gambar 6. Perbandingan luas spektrum ESR dati tulangmanusia daD tulang bovine yang diiradiasidengan dosis 30 kGy

3 TEGillI,A., Implantasi Tulang Xenograft ProduksiBatan Research Tissue Bank, Tesis, 1997.

Gambar 7 adalah tiga tingkatan kandungan airdidalam tulang yaitu 5, 10 daD 15% yang selanjutnyadiiradiasi dengan 30 kGy. Dati spektrum ESR terlihatbahwa jUlulah radikal bebas berbanding terbalik dengankonsentrasi air yang terdapat di dalmll twang. Didugabahwa air yang terkandung di dalam twang bereaksidengan sebagian dari radikal yang terbentuk di dalamtulang iradiasi. Pengukuran dilakUkan satu jam setelahiradiasi.

4, GOPAL,N.G.S., SHARMA,G., and PATEL,K.M.,Radiation Sterilization of Phannaceuticals andDisposable Madical Products. In IAEA-TECDOC-454: Technical and EconomicComparation of Irradiation and ConventionalMethods, 1986, p. 20.

5. OSTROWSKI, K., DZIEDZIC-GOCLA WSKA, A.,STACHOWICKZ, W., and MICHALIK,I.,Radiation -induced Paramagnetic Centers inResearch on bone Physiopathology, Dept. ofHistology, Institue of Biostructure, MedicalAcademy, Warsaw, Poland, 1990, p.21.

6.

ST ACHOWICKZ, W., OSTROWSKI,K.,DZIEDZIC- GOCLA WSKA, A., andKOMENDER,A., On Free Radicals evoked byRadiosterilization in Preserved Bone Grafts. In:IAEA Panel Proceeding Series "Sterilizationand Preservation of Biological Tissues byIonizing Radiation", IAEA-PL-333/3, Vienna,pp 15-27.

7

6

5

4

3

2

IQ+w

~~II:(/JwE2

!(/)

~-I

1 v0 -I I I I I I

0 10 20 30 40

Dosis (kGy) 7, KOMENDER,J., KOMENDER,A., DZIEDZIC-GOCLA WSKA,A., and OSTROWSKI,K.,Radiation-sterilized Bone Grafts Evaluated byElectron Spin Resonance Technique andMechanical Tests. Transplant PrOto 8, Suppl1:25, 1976.

Gambar 7. Luas spektrum ESR (Au) pada 3 tingkatankandungan air tulang manusia liofilisasi yangdiiradiasi dengan dosis 30 kGy

--60

Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan r eknologi IsOIOp dan Radla~ 2000

8. DZIEDZIC-GOCLA WSKA,A., Effect of RadiationSterilization on Biostatic Tissue and TheirConstituents. In Gaugllran, E.R.L and Goredi,A.J. (eds): Sterilization by Ionizing Radiation,vol. 2, Multi Science, Montreal, 1978, p. 156.

II. OSTROWSKI,K., DZIEDZIC-GOCLA WSKA,A.,STACHOWICZ, W., and MICHALIK,J.,Accuracy, Sensitivity, and Specificity of EPRAnalysis of Mineral Constituents of lrradiatinTissues, Ann.N.Y. Acad. Sci. 238,186-201.

9. AA TB, Technical Manual for Tissue Bangking,Copyright 1987, Suite 220-A, 1350, BeverlyRoad. McLean, Virginia 22101, M-18.

12. SLIWOWSKI,A., and DZIEDZIC.GOCLA WSKA,A., Influence of GammaIrradiation on the solubility of Collagen-derivedMembranes, Materia Medica Polona, No.4,1976, p.310. STACHOWICKZ, W., MICHALIK, J. OSTROWSKI,

K., and DZIEDZIC-GOCLA WSKA, A., BonePowder as Suitable Dosimeter for Control ofRadiation Sterilization of Biostatic Graft, 3mEuropean Conference on Tissue Banking andClinical Application of Grafts, EA TB/IAEA,Oct. 4-7,1994, Vienna, Austria.

61