PEMURNIAN PROTEIN

I. TUJUAN1. Dapat memahami metode pemurnian protein2. Dapat mengetahui ada tidaknya protein di dalam sample3. Dapat memisahkan protein dengan metode salting out.4. Dapat mengetahui cara pemisahan suatu protein berdasarkan perbedaan berat molekul dengan menggunakan kromatografi gelII. TEORI DASARProtein berasal dari bahasa Yunani protos, yang berarti yang paling utama. Protein merupakan senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. (Poejadi, 1994)Protein adalah sekelompok senyawa organik yang hampir keseluruhannya terdiri atas karbon, hidrogen, oksigen, dan nitrogen. Protein biasanya suatu polimer yang tersusun atas banyak subunit (monomer) yang dikenal sebagai asam amino. (Fried dan Hademenos, 2006).Protein merupakan makromolekul yang paling melimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada semua organisme. Sebagai makro molekul, protein merupakan senyawa organik yang mempunyai berat molekul tinggi dan berkisar antara beberapa ribu sampai jutaan dan tersusun dari C, H, O dan N serta unsur lainnya seperti S yang membentuk asam-asam amino. (Patong, dkk., 2012).Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi oleh manusia. Seperti pada telur, tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh. (Triyono, 2007)

Berdasarkan strukturnya, protein dibagi menjadi :1. Struktur PrimerStruktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Frederick Sanger merupakan ilmuwan yang berjasa dengan temuan metode penentuan deret asam amino pada protein, dengan penggunaan beberapa enzim protease yang mengiris ikatan antara asam amino tertentu, menjadi fragmen peptida yang lebih pendek untuk dipisahkan lebih lanjut dengan bantuan kertas kromatografik. Urutan asam amino menentukan fungsi protein, pada tahun 1957, Vernon Ingram menemukan bahwa translokasi asam amino akan mengubah fungsi protein, dan lebih lanjut memicu mutasi genetik. (Bintang, 2010)Struktur primer menyatakan urutan asam-asam amino pada rantai protein dan letak ikatan disulfida bila ada. Karena protein dapat mengandung 100 atau lebih residu asam amino sehingga sulit menggambarkan rumus bangunnya. Oleh karena itu digunakan singkatan 3 huruf untuk tiap asam amino. Misalnya: Glu Ala Lys Gly Tyr Ala. Struktur primer protein bisa ditentukan dengan beberapa metode: (1) hidrolisis protein dengan asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino acid analyzer, (2) analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan degradasi Edman, (3) kombinasi dari digesti dengan tripsin dan spektrometri massa, dan (4) penentuan massa molekular dengan spektrometri massa. (Bintang, 2010)Struktur primer protein ditentukan oleh ikatan kovalen antara residu asam amino yang berurutan yang membentuk ikatan peptida. Urutan, macam dan jumlah asam amino yang membentuk rantai polipeptida, adalah struktur polimer protein. Untuk mengetahui struktur primer suatu protein diperlukan cara penentuan bertingkat: (1) Penentuan jumlah rantai polipeptida yang berdiri sendiri dari protein, (2) Pemutusan ikatan antara rantai polipeptida yang satu dengan yang lain, (3) Pemisahan masing-masing rantai polipeptida, dan (4) Penentuan urutan asam amino dari masing-masing rantai polipeptida dengan metode Sanger. (Bintang, 2010)2. Struktur SekunderStruktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Berbagai bentuk struktur sekunder misalnya ialah sebagai berikut :1. alpha helix (a-helix, "puntiran-alfa"), berupa pilinan rantai asam-asam amino berbentuk seperti spiral;2. beta-sheet (-sheet, "lempeng-beta"), berupa lembaran-lembaran lebar yang tersusun dari sejumlah rantai asam amino yang saling terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H);3. beta-turn, (-turn, "lekukan-beta"); dan4. gamma-turn, (-turn, "lekukan-gammaStruktur sekunder bisa ditentukan dengan menggunakan spektroskopi circular dichroism (CD) dan Fourier Transform Infra Red (FTIR).[6] Spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans negatif pada 208 dan 220 nm dan lempeng-beta menunjukkan satu puncak negatif sekitar 210-216 nm. Estimasi dari komposisi struktur sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD. Pada spektrum FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita amida-I dari lempeng-beta. Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein juga bisa diestimasi dari spektrum inframerah. (Bintang, 2010)Analisis difraksi sinar-X merupakan cara yang baik untuk mempelajari struktur sekunder protein. Struktur ini terjadi karena ikatan hidrogen antara atom O dari gugus karbonil (C=O) dengan atom H dari gugus amino (N-H) dalam satu rantai polipeptida, memungkinkan terbentuknya konformasi spiral yang disebut struktur helix. Bila ikatan hidrogen tersebut terjadi antara dua rantai polipeptida, maka masing-masing rantai tidak membentuk helix, melainkan rantai paralel dengan bentuk berkelok-kelok yang disebut konformasi-. Rantai polipeptida denagn konformasi- ini dihubung silangkan (cross-linked) oleh ikatan hidrogen sehingga membentuk suatu struktur yang disebut lembaran berlipat-lipat (pleated sheets). Perenggangan rantai polipeptida membentuk struktur berkelok-kelok, yang kemudian menghasilkan konformasi lembaran berlipat-lipat diawali oleh putusnya ikatan hidrogen yang berperan dalam pemantapan struktur a-helix yang menyebabkan berubahnya struktur akeratin menjadi keratin yang dapat terjadi protein serabut pada pemanasan dengan uap. (Bintang, 2010)3. Struktur TersierStruktur tersier terbentuk karena adanya pelipatan membentuk struktur yang kompleks. Pelipatan distabilkan oleh ikatan hidrogen, ikatan disulfida, interaksi ionik, ikatan hidrofobik, ikatan hidrofilik.Struktur tersier yang merupakan gabungan dari aneka ragam dari struktur sekunder. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener.Struktur tersier terbentuk karena terjadinya perlipatan (folding) rantai a-helix, konformasi , maupun gulungan rambang suatu polipeptida, membentuk protein globular, yang struktur tiga dimensinya lebih rumit daripada protein serabut. Kemantapan struktur tersier suatu molekul protein, selain disebabkan oleh ikatan kovalen seperti ikatan peptida dan ikatan disulfida, juga oleh ikatan tak-kovalen yang menunjangnya, yaitu yang menyebebkan terjadinya perlipatan terebut. Ikatan tak-kovalen ini terjadi antara gugus rantai samping polipeptida. (Bintang, 2010)4. Struktur KuartenerStruktur kuartener terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan kata lain multi sub unit. Interaksi intermolekul antar sub unit protein ini membentuk struktur keempat atau kuartener. Suatu protein dikatakan mempunyai struktur kuarterner bila protein terdiri atas 2 rantai polipeptida atau lebih disatukan oleh gaya dispersi (ikatan hidrogen). Protein seperti ini dinamakan oligomer, sedangkan asam amino yang menyusunnya disebut monomer.Sebagian besar protein berbentuk globular yang mempunyai berat molekul lebih dari 50.000 merupakan suatu oligomer, yang terjadi dari beberapa rantai polipeptida yang terpisah. Rantai polipeptida ini yang juga disebut protomer saling mengadakan interaksi membentuk struktur kuartener dari protein oligomer tersebut. Dalam proses denaturasi ini, protein oligomer mengalami dua proses bertingkat: (1) Disosiasi rantai polipeptida yang satu dari yang lainnya, dan (2) Merenggangnya sauan rantai polipeptida. Kemantapan struktur kuartener suatu protein oligomer disebaban oleh interaksi dan ikatan non kovalen yang lemah antara masing-masing sub-bagiannya. Kemampuan untuk berhimpun diri daripada beberapa sub bagian ini merupakan ciri struktur kuartener suatu protein oligomer. (Bintang, 2010)Fungsi protein diantaranya sebagai berikut:1. Sebagai enzim hampir semua reaksi biologis dipercepat atau di bantu oleh suatu senyawa makromolekul spesifik yang disebut enzim, dari reaksi yang sangat sederhana seperti reaksi transportasi karbondioksida yang sangat rumit seperti replikasi kromosom. Protein besar peranannya terhadap perubahab-perubahan kimia dalam system biologis.2. Alat pengangkut dan penyimpanan Banyak molekul dengan MB kecil serta beberapa ion dapat diangkut atau dipindahkan oleh protein-protein tertentu. Misalnya hemoglobin mengangkut oksigen dalam eritrosit, sedangkan mioglobin mengangkut oksigen dalam otot.3.Pengatur pergerakan protein merupakan komponen utama daging, gerakan otot terjadi karena adanya dua molekul protein yang saling bergeseran.4. Penunjang mekanik kekuatan dan daya tahan robek kulit dan tulang disebebkan adanya kolagen, suatu protein berbentuk bulat panjang dan mudah membentuk serabut5. Pertahanan tubuh atau imunisasi pertahanan tubuh biasanya dalam bentuk antibody, yaitu suatu protein khusus yang dapat mengenal dan menempel atau mengikat benda-benda asing yang masuk ke dalam tubuh seperti virus, bakteri, dan sel-sel asing lain.6. Media perambatan impuls saraf protein yang mempunyai fungsi ini biasanya berbentuk reseptor, misalnya rodopsin, suatu protein yang bertindak sebagai reseptor penerima warna atau cahaya pada sel-sel mata7. Pengendalian pertumbuhan8.Sebagai bahan pembentuk senyawa kimia seperti enzim yang berperan penting dalam mengatur berbagai proses yang terjadi di dalam tubuh.(Bintang, 2010)Protein memegang peranan penting dalam berbagai proses biologi. Peran-peran tersebut antara lain:1. Katalisis enzimatikHampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh enzim dan hampir semua enzim adalah protein.2. Transportasi dan penyimpananBerbagai molekul kecil dan ion-ion ditansport oleh protein spesifik. Misalnya transportasi oksigen di dalam eritrosit oleh hemoglobin dan transportasi oksigen di dalam otot oleh mioglobin.3. Koordinasi gerakKontraksi otot dapat terjadi karena pergeseran dua filamen protein. Contoh lainnya adalah pergerakan kromosom saat proses mitosis dan pergerakan sperma oleh flagela.4. Penunjang mekanisKetegangan kulit dan tulang disebabkan oleh kolagen yang merupakan protein fibrosa.5. Proteksi imunAntibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel dari organisma lain.6. Membangkitkan dan menghantarkan impuls sarafRespon sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantarai oleh oleh protein reseptor. Misalnya rodopsin adalah protein yang sensitif terhadap cahaya ditemukan pada sel batang retina. Contoh lainnya adalah protein reseptor pada sinapsis.7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasiPada organisme tingkat tinggi, pertumbuhan dan diferensiasi diatur oleh protein faktor pertumbuhan. Misalnya faktor pertumbuhan saraf mengendalikan pertumbuhan jaringan saraf. Selain itu, banyak hormon merupakan protein.(Bintang, 2010)Jenis-jenis protein diantaranya :1. Kolagen, protein struktur yang diperlukan untuk membentuk kulit, tulang dan ikatan tisu.2. Antibodi, protein sistem pertahanan yang melindungi badan dari pada serangan penyakit. 3. Dismutase superoxide, protein yang membersihkan darah kita.4. Ovulbumin, protein simpanan yang memelihara badan.5. Hemoglobin, protein yang berfungsi sebagai pembawa oksigen 6. Toksin, protein racun yang digunakan untuk membunuh kuman.7. Insulin, protein hormon yang mengawal aras glukosa dalam darah.8. Tripsin, protein yang mencernakan makanan protein.(Bintang, 2010)Pemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal dari dari satu campuran kompleks. Biasanya pemurnian ini bertujuan untuk mengetahui lebih jauh mengenai struktur, sifat-sifat kimia maupun fisika suatu senyawa yang terdapat di bahan alam. Sehingga diperlukan suatu proses guna memperoleh senyawa dalam keadaan murni. Mendapatkan suatu jenis protein dari bahan alam dalam keadaan murni bukanlah pekerjaan mudah, sebab molekul protein tidak stabil terhadap pemanasan serta pelarut organik.Untuk mempelajari suatu protein tertentu, perlu dilakukan isolasi perotein tersebut dengan protein yang lain yang mungkin terkandung dalam jaringan. Purifikasi protein merupakan teknin biokimia yang banyak digunakan. Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan dengan menambahkan garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut "salting out". Metode "salting out" ini mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua fenomena tersebut yang penting di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion dari garam dengan air. (Girindra, 1986)Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya. (Girindra, 1986)Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein.Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang (Mayes et al, 1990).Fraksi yang diperoleh dari pengen dapan amonium sulfat perlu dimurnikan lagi dengan metode kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan zat untuk analisis dan preparative dengan melarutkan campuran dalam fase gerak (cairan atau gas), yang mengalir melalui fase diam atau stasioner, zat zat yang hendak dipisahkan harus berinteraksi dengan fase stasioner dengan kuat yang berbeda beda , interaksi ini dapat bersifat adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan interaksi lainnya.Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). (Hamid, 2001)Kromatografi yang digunakan yaitu filtrasi gel. Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro molekul biologi lain berdasarkan ukuran molekul, jadi bekerja sebagai suatu penyaring molekul. Proses pemisahan ini menggunakan gel yaitu dekstran (polimer gula yang larut dalam air) dan mengalami reaksi ikatan silang (cross linkage) sehingga dekstran menjadi tidak larut dalam air, tetapi masih dapat menyerap molekul air dalam molekulnya. (Hamid, 2001)Daya serap matriks bergantung pada jumlah ikatan silang yang terjadi di dalamnya. Matriks atau gel dekstran disebut juga sebagai sefadeks, misalnya sefadeks G-50. Huruf dan nomor menunjukkan bahwa safadeks tersebut dapat dikembangkan (Swelling) dengan air atau larutan penyangga dengan besar pengembangnya 50 kali. Gel atau matriks ini berpori yang dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair mobil. Molekul yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori matriks dan bergerak lebih lambat, sedangkan molekul yang lebih besar akan bergerak lebih cepat karena tidak tertahan di dalam pori matriks. Gambar Kolom Desalting Gambar Kromatografi Filtrasi GelLDH merupakan enzim yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi laktat yang tergantung pada kofaktor nikotinamida. LDH ditemukan hampir pada semua organisme karena mempunyai peran penting pada metabolisme karbohidrat. Selama kondisi dimana produksi piruvat dari glikolisis dapat meningkatkan kemampuan sel untuk memetabolisme piruvat. LDH dapat mengubah piruvat menjadi laktat, dengan demikian akan menghasilkan NAD teroksigenasi yang diperlukan untuk proses glikolisis selanjutnya. LDH juga dapat mengkonversi reaksi sebaliknya yaitu pembentukan piruvat dari laktat yang juga akan menghasilkan NADH, baik NADH ataupun piruvat dapat digunkan untuk proses metabolisme lainnya.

III. ALAT DAN BAHANAlatBahan

Batang pengadukAmmonium sulfat

Beaker glassDada ayam

BlenderDapar tris pH 8,4

Kain kassaDapar yang telah dibekukan

Pipet tetes

Rak tabung

Tabung falcon

Tabung sentrifugasi

IV. PROSEDUR KERJADada ayam ditimbang sebanyak 50 gram kemudian diblender dengan dapar yang telah dibekukan selama 4 x 30 detik dengan jeda 10 detik. Kemudian dibagi menjadi 2 bagian sama banyak, masing-masing bagian 25 gram, 25 gram tersebut dimasukkan kedalam 4 tabung sentrifugasi yang berbeda. Setelah itu disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 15.000 rpm. Supernatan (cairan) yang diperoleh disaring menggunakan kain kassa dan pellet (endapan) yang berada didalam kain kassa diperas hingga tidak ada supernatan yang terkandung didalamnya, diukur supernatannya.Supernatan ditambahkan ammonium sebanyak 5,07 gram sedikit demi sedikit dan diaduk perlahan selama 15 menit. Pengerjaan ini dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu. Setelah itu dimasukkan kedalam 2 tabung sentrifugasi yang berbeda. Disentrifugasi selama 15 menit (apabila supernatan dan pellet belum terbentuk maka perlu dilakukan penambahan waktu selama 15 menit). Setelah itu supernatan dan pelletnya dipisahkan, lalu pellet diambil untuk tahap selanjutnya. Dilakukan resuspensi pellet ammonium sulfat dengan cara pellet ammonium sulfat ditambahkan 1 mL dapar Tris HCl lalu diaduk perlahan hingga semua pellet larut kemudian dimasukan ke dalam tabung lain yang berisi pellet ammonium sulfat dan ditambahkan dapar Tris HCl hingga volumenya mencapai 3 mL lalu diaduk hingga homogen.Disiapkan kolom desalting yang didalamnya berisi dapar, lalu gunting bagian ujungnya hingga diperoleh larutan dapar dan ditampung pada beaker glass. Setelah dapar keluar sampel dimasukan ke dalam kolom desalting dan ditampung menggunakan beaker glass. Setelah itu dielusi dengan menambahkan eluen berupa dapar sebanyak 3 mLV. DATA PENGAMATAN & PERHITUNGANPERCOBAANHASIL DAN GAMBAR

Ditimbang dada ayam sebanyak 50 gram.Berupa potongan dada ayam

Dada ayam + buffer yang telah beku dimasukan ke dalam blender , kemudian di blender selama 4 x 30 detik dengan jeda 10 detik.Dibagi menjadi 2 bagian sama banyak, masing-masing bagian 25 gram.Satu bagian yang berisi 25 gram tersebut dimasukan ke dalam 4 tabung sentrifugasi yang berbeda.

Menghasilkan larutan yang kental dan berwarna peach (+++)

Kemudian disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 15.000 rpm

Terjadi pemisahan, pada bagian atas berupa supernatan yang berwarna peach bening (+) sedangkan pada bagian bawah berupa pellet dengan endapan berwarna peach (+++)

Supernatan disaring menggunakan kain kassa dan sisa pellet yang berada di atas kain kassa diperas hingga tidak ada lagi supernatan yang terkandung didalamnya.Diukur berapa supernatan yang diperoleh.

Diperoleh larutan berupa supernatan berwarna peach (+).Supernatan yang diperoleh akan digunakan untuk tahap selanjutnya, sedangkan pellet yang berupa endapan dibuang.

Lalu supernatan ditambahkan ammonium sulfat sebanyak 5,07 gram sedikit demi sedikit dan diaduk perlahan selama 15 menit. Pengerjaan ini dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu.Ammonium sulfat tersebut larut ke dalam supernatan dan tidak terbentuk busa.

Setelah itu dimasukan ke dalam 2 tabung sentrifugasi yang berbeda

Menghasilkan larutan yang agak pekat dan keruh dengan warna peach (++)

Kemudian disentrifugasi selama 15 menitSetelah disentrifugasi selama 15 menit supernatan dan pellet belum terpisah atau terbentuk maka perlu dilakukan penambahan waktu selama 15 menit.

Supernatan dan pellet dipisahkan

Terjadi pemisahan, pada bagian atas berupa supernatan yang berwarna peach bening (+) sedangkan pada bagian bawah berupa pellet dengan endapan berwarna peach (++)Pellet yang diperoleh akan digunakan untuk tahap selanjutnya sedangkan supernatan dimasukan ke dalam gelas kimia

Dilakukan resuspensi pellet ammonium sulfat dengan cara : pellet ammonium sulfat + 1 mL dapar Tris HCl lalu diaduk perlahan hingga semua pellet larut, kemudian dimasukan ke dalam tabung lain yang berisi pellet ammonium sulfat dan ditambahkan dapar Tris HCl hingga volumenya mencapai 3 mL lalu diaduk hingga homogen

Pellet ammonium sulfat yang diperoleh berupa endapan berwarna peach (++)

Disiapkan kolom desalting, lalu gunting bagian ujungnya hingga diperoleh larutan dapar dan ditampung pada beaker glass

Menghasilkan larutan tidak berwarna

Kemudian sampel dimasukan ke dalam kolom desalting dan ditampung menggunakan beaker glass. Setelah itu dielusi dengan menambahkan eluen berupa dapar sebanyak 3 mL

Menghasilkan larutan berwarna peach keruh (+). Pada cairan ini mengandung protein LDH.

PERHITUNGANDiketahui : Supernatan yang diperoleh = 13 mL Ammonium sulfat = 0,39 gram/mL Ditanyakan : Berapa gram ammonium sulfat yang perlu ditambahkan ?Jawab := 13 mL x 0,39 gram/mL = 5,07 gramJadi, ammonium sulfat yang perlu ditambahkan sebanyak 5,07 gramVI. PEMBAHASANPemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal dari dari satu campuran kompleks. Pemurnian ini bertujuan untuk mengetahui lebih jauh mengenai struktur, sifat-sifat kimia maupun fisika suatu senyawa yang terdapat di bahan alam, sehingga diperoleh senyawa protein dalam keadaan murni. (Mayes, P.A et al, 1990)Pada praktikum ini, dilakukan pemurnian protein laktat dehidrogenase (LDH) dari dada ayam dengan cara pengendapan protein oleh ammonium sulfat. Proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat berkonsentrasi tinggi atau larutan jenuhnya (salting out). Salting outmerupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Hal ini terjadi karena garam anorganik mempunyai kemampuan untuk mengikat air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang. (Bintang, 2010)Laktat dehidrogenase (LDH) merupakan enzim intraseluler yang terdapat pada hampir semua sel yang bermetabolisme, dengan konsentrasi tinggi yang dapat ditemukan pada jantung, otot rangka, hati, ginjal, otak, dan sel darah merah. LDH juga dapat mengkatalisis perubahan piruvat menjadi laktat. (Girindra, 1986)Langkah pertama yang dilakukan adalah penyiapan jaringan, dada ayam yang akan diambil LDHnya di buang jaringan ikat dengan lemaknya, yang digunakan hanya dagingnya karena LDH muncul atau dapat diambil jika ada kerusakan pada jaringan dan dapat disimpulkan bahwa adanya peningkatan LDH merupakan pertanda telah terjadinya kerusakan jaringan. (Girindra, 1986)Kemudian dada ayam tersebut di gerus menggunakan blender dengan campuran dapar pengekstrasi yang telah dibekukan. Tujuan penggerusan ini untuk memperoleh protein dari organ jantung tersebut maka protoplasma akan keluar dan akan diperoleh protein, sedangkan tujuan dari penambahan dapar pengekstrasi yang telah dibekukan adalah agar protein tidak terjadi denaturasi karena pada saat di blender suhu didalam menjadi panas jadi perlu ditambahkan dapar dengan suhu dingin sehingga dapat menstabilkan suhu pada saat penggerusan dan juga bertujuan agar dapat menginaktivasi enzim yang bekerja pada sampel, LDH (protein dari ayam) mempunyai suhu aktif >800C. Jika pada suhu aktif LDH akan tercerna oleh lisosom maka LDHnya tidak bisa diambil. (Girindra, 1986)Larutan dapar pengekstraksi tersebut terdiri dari Tris-HCl,2-mercaptoethanol, phenylmetylsulfonyl florida (PMSF) dan ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA).Tris-HCl merupakan senyawa organik dengan rumus (HOCH2) 3CNH2. Tris secara luas digunakan dalam biokimia dan biologi molekuler. Dalam biokimia, Tris HCl banyak digunakan sebagai komponen larutan buffer. Tris HCl juga merupakan bahan kimia dengan sifat dasar, yang memiliki pKa 8,1. Hal ini dapat digunakan untuk penyangga dan solusi dari perubahan pH yang drastis, menjaga mereka di kisaran pH 7,0 - 9,0. Sehingga dapat menjaga pHnya agar dapat bekerja dengan baik. Lalu terdiri dari EDTA yang berfungsi sebagai larutan buffer dan sebagai pengkhelat yang dapat mengikat ikatan kation sehingga dapat menurunkan tegangan dan menghasilkan ion untuk menghantarkan arus, umumnya mengikat ion logam jika terdapat pada sample, sampel yang digunakan berupa dada ayam yang umumnya bnyak ion Ca2+ karena merupakan jaringan yang berotot, lalu terdiri dari 2-Mercaptoethanol yang berfungsi menghilangkan senyawa polifenol yang terkandung dalam daging tersebut, dan mendetarurasi protein yang mengkontaminasi LDH yang akan dimurnikan. (Hamid, 2001)Setelah itu campuran dada ayam dan dapar pengekstraksi yang telah homogen dimasukkan ke dalam 4 tabung sentrifugasi yang berbeda dan disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan pengadukan 15.000 rpm. Setelah disentrifugasi terjadi pemisahan, pada bagian atas berupa supernatant (cairan) yang berwarna peach bening (+) sedangkan pada bagian bawah berupa pellet dengan endapan berwarna peach (+++). Hal ini sesuai dengan literatur (Hendra, 1989) dimana prinsip sentrifugasi didasarkan pada pemisahan olekular dari sel atau organel subselular. Pemisahan tersebut berdasarkan konsep bahwa partikel yang tersuspensi di sebuah wadah akan mengendap (bersedimentasi) ke dasar wadah karena adanya gaya gravitasi. Sehingga laju pengendapan suatu partikel yang tersuspensi tersebut dapat diatur dengan meningkatkan atau menurunkan pengaruh gravitasional terhadap partikel. Pengaturan laju pengendapan tersebut dapat dilakukan dengan cara menempatkan wadah yang berisi suspensi partikel kemesin sentrifugasi tepatnya pada bagian rotor yang kemudian akan berputar dengan kecepatan tertentu. Hal tersebut tergantung pada ukuran dan bobot jenis. Hasil sentrifugasi terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pellet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan bawah dan warnanya lebih keruh. (Hendra, 1989)Pada sentrifugasi ini digunakan kecepatan pengadukan 15.000 rpm dengan waktu 20 menit, hal ini menunjukan semakin besar kecepatan pengadukan semakin banyak pula endapan (pellet) yang dihasilkan dan semakin lama juga waktu yang dibutuhkan untuk memisahkan campuran antara supernatant dan pellet. Dapat disimpulkan bahwa kecepatan pengadukan (rpm) sebanding dengan waktu yang dibutuhkan. (Hendra, 1989)Langkah selanjutnya adalah filtrasi, supernatant disaring menggunakan kain kasa dan filtratnya di peras hingga tidak ada supernatant yang terkandung di dalamnya. Supernatant diambil karena didalam supernatan tersebut mengandung protein. Supernatan yang diambil kemudian ditambahkan dengan amonium sulfat (NH4)2SO4 sedikit demi sedikit sebanyak 5,07 gram dan diaduk secara perlahan. Pengerjaan tersebut dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu. Tujuan penambahan ammonium sulfat adalah untuk mengendapkan protein, ion garam tersebut mengikat air dan akan borkempetisi dengan molekul protein dalam mengikat air sehingga kelarutan protein akan berkurang dan protein akan mengendap. (Hamid, 2001) Didalam pengerjaannya perlu diaduk secara perlahan agar tidak terjadi denaturasi pada protein dan dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu yang bertujuan agar dengan suhu yang rendah akan memudahkan proses pengendapan dan mengakibatkan turunnya daya larut protein sehingga protein mudah berikatan dengan ammonium sulfat. (Bintang, 2010)Selanjutnya disentrifugasi kembali, pada sentrifugasi kedua ini yang diambil adalah pelletnya karena didalam pellet tersebut mengandung protein yang telah berikatan dengan ammonium sulfat. Kemudian diresuspensi yaitu disuspensikan kembali dengan cara pellet ammonium sulfat ditambahkan 1 mL dapar Tris lalu diaduk perlahan hingga semua pellet larut, kemudian dimasukan ke dalam tabung lain yang berisi pellet ammonium sulfat dan ditambahkan dapar Tris hingga volumenya mencapai 3 mL lalu diaduk hingga homogen. Tetapi protein tersebut masih belum murni, masih ada ammonium sulfat yang tersisa sehingga harus di lakukan kromatografi sebagai tahap pemurnian selanjutnya agar ammonium sulfat dapat dipisahkan dengan protein. (Bintang, 2010)Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Kromatografi yang digunakan pada praktikum ini adalah kromatografi filtrasi gel. Prinsip dari kromatografi filtrasi gel adalah pemisahan berdasarkan perbedaan ukuran, molekul yang mempunyai ukuran besar yang tidak dapat masuk ke daerah gel yang merupakan rongga-rongga gel sehingga akan keluar dari kolom, sedangkan molekul yang mempunyai ukuran kecil akan terjerap pada fase diam yang berupa rongga/butiran berpori. (Poedjiadi, 2005)Kemudian digunakan salting kolom, kolom kromatografi yang digunakan adalah sephadex G-150 dengan eluen buffer Tris-HCl pH 8,4. Sephadex terbuat dari protein berhidrat tinggi dengan pori-pori yang sangat halus. Kolom Sephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan buffer pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 menit per tetes. (Williamson, 1992). Lalu kolom tersebut digunting bagian bawahnya agar dapar keluar, setelah dapar keluar seluruhnya kemudian ditambahkan sample berupa pellet yang telah diresuspensi dan dielusi dengan menambahkan eluen berupa dapar sebanyak 3 mL. Diperoleh sample (protein) adalah 4,1 mL. Sebenarnya protein yang di hasilkan masih belum murni dan perlu dilakukan dengan tahap selanjutnya yaitu dengan cibacron blue. Namun pengerjaannya tidak dilakukan karena di dalam laboratorium tidak memiliki cibacron blue sehingga hanya dilakukan sampai tahap kromatografi filtrasi gel dan protein yang didapatkan belum murni seluruhnya.VII. KESIMPULAN1. Metode yang digunakan untuk pemurnian protein LDH (Laktat Dehidrogenase) dari bagian daging dada ayam adalah dengan metode pengendapan protein dengan ammonium sulfat.2. Kromatografi yang digunakan adalah kromatografi filtrasi gel yaitu pemisahan protein dari ammonium sulfat berdasarkan perbedaan ukuran.3. Diperoleh protein sebanyak 4,1 mL dan ammonium sulfat yang harus ditambahkan sebanyak 5,07 gram.VIII. DAFTAR PUSTAKA1. Bintang, Maria.2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga2. Fried 20063. Girindra, Aisjah. 1986. BIOKIMIA I. Jakarta: Gramedia4. Hamid,Abdul,2001.Biokimia Metabolisme Biomolekul.Jakarta:Penerbit Alfabeta5. Hendra Adijuwana. 1989.Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press6. Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990, Biokimia Harper Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta7. Patong 20128. Poedjadi,Anna.1994.Dasar-dasar Biokimia.Penerbit UI-press.Jakarta9. Poedjiadi, A., 2005,Dasar-Dasar Biokimia,UI Press, Jakarta10. Triyono 200711. Williamson,K.L & L.F.Fieser. (1992). Organic Experiment 7th Edition. D C Health ang Company. United States of America.