PERCOBAAN IV: PENENTUAN KADAR KOLESTEROL

(METODA CHOD-PAP)

I. TUJUAN PERCOBAAN

Setelah menyelesaikan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat:

1. Menyiapkan pasien untuk pemeriksaan kolesterol dalam darah.

2. Menginterpretasikan hasil laboratorium yang diperoleh.

II. PRINSIP PERCOBAAN

Kolesterol total ditetapkan langsung di dalam plasma atau serum dengan

satu sisi reaksi dimana ester kolesterol dihidrolisis, gugus 3-OH kolesterol

dioksidasi, kemudian hydrogen peroksida yang merupakan salah satu hasil

reaksi ditetapkan secara enzimatis.

Ester kolesterol + H20 kolesterol + asam-asamlemak

Kolesterol + O2 kolestenon + H2O2

2 H2O2+ fenol + 4-aminoantipyrine quinoneimine + H20

Absorbansi warna diukur pada panjang gelombang 500nm

III. TEORI

Kolesterol atau yang disebut juga dengan lemak tak jenuh merupakan

substansi seperti lilin yang warnanya putih, kolesterol secara alami sudah ada

dalam tubuh kita. Hati adalah yang memproduksi kolesterol, kolesteorol

berfungsi untuk membangun dinding sel dan juga untuk membuat hormon-

hormon tertentu. Sebenarnya tubuh manusia sudah bisa menghasilkan

kolesterol sendiri, namun karena manusia mengkonsumsi makan-makanan yang

Kolesterol esterase

Kolesteroloksidase

peroksidase

mengandung lemak sehingga menyebabkan seseorang kadar lemak dalam

tubuhnya sangat berlebih.Penyakit jantung dan penyakit pembuluh darah

merupakan penyakit yang disebabkan oleh kadar kolesterol yang berlebihan

dalam darah. Hal itubisa terjadi karena kolesterol yang berlebih akan

membentuk bekuan dan plak yang akan menyumbat arteri dan akhirnya

memutuskan aliran darah ke jantung yang akan menyebabkan serangan

jantung, dan ke otak akan menyebabkan stroke. Jadi agar terhindar dari

serangan jantung sangat disarankan untuk mengontrol kadar kolesterol dalam

tubuh kita. Jika seseorang pernah mengalami serangan jantung atau pembedahan

baypass,kadar kolesterolnya harus diperiksa secara rutin. dengan menjaga

kolesterol agar tetap wajar merupakan jaminan terbaik untuk terhindar dari

penyumbatan pembuluh darah arteri. Kadar kolesterol sendiri terbagi menjadi

dua bagian yaitu:

Kolesterol HDL singkatan dari High-Density Lipoprotein, HDL adalah

“kolesterol baik” karena mempunyai kemampuan untuk

membersihkan pembuluh darah arteri.

Kolesterol LDL singkatan dari Low-Density Lipoprotein, LDL adalah

“kolesterol jahat” yang membuat endapan dan menyumbat

pembuluhdarah arteri

(Ridwanaz, 2010 )

Kolesterol adalah lemak yang sebagian besar dibentuk oleh tubuh

sendiri terutama di dalam hati. Fungsi kolesterol adalah sebagai bahan

pembentuk berbagai jenis hormonsteroid antara lain hormon

estrogen,progesteron, dan androgen. Juga merupakan prvitamin D yang

terdapat di jaringan bawah kulit. Dengan pertolongan sinar matahari, terutama

sinar ultravioletnya, pro vitamin D itu diubah menjadi vitamin D. Fungsi

kolesterol berikutnya adalah sebagai bahan pembentuk asam empedu

dangaram empedu. Bila kadar kolesterol dalam darah tinggi dapat

menyebabkan timbulnya atherosklerosis yaitu kolesterol mengendap di

dinding pembuluh darah membentuk plak, sehingga saluran darah menyempit

dan mengeras lama-lama terjadi penyumbatan. Apabila penyumbatan terjadi

di pembuluh nadi yang mensuplai darah ke dinding jantung maka

menyebabkan penyakit jantung koroner (Soeharto, 2004).

Kolesterol total sebenarnya merupakan susunan dari banyak

zat,termasuk trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL. Kategori

kadarkolesterol total: Normal < 200 mg/dL, Batas tinggi 200 – 239

mg/dL,Tinggi <240 mg/dL (Soeharto, 2004).

Hiperlipidemia

Yang dimaksud dengan Hiperlipidemia adalah suatu keadaan yang

ditandai oleh peningkatan kadar lipid/lemak darah. Berdasarkan jenisnya,

hiperlipidemia dibagi menjadi 2 yaitu:

Hiperlipidemia Primer

Banyak disebabkan oleh karena kelainan genetik. Biasanya kelainan ini

ditemukan pada waktu pemeriksaan laboratorium secara kebetulan. Pada

umumnya tidak ada keluhan, kecuali pada keadaan yang agak berat tampak

adanya xantoma (penumpukan lemak di bawah jaringan kulit).

Hiperlipidermia Sekunder

Pada jenis ini, peningkatan kadar lipid darah disebabkan oleh suatu

penyakit tertentu, misal : diabetes mellitus, gangguan tiroid,penyakit

hepar, dan penyakit ginjal. Hiperlipidemia sekunderbersifat reversible

( berulang ) (Fredrickson, 1967).

Berdasarkan fenotip lipoproteinnya hiperlipidemia primer dibedakan

berdasarkan 6 tipe.

Tipe Sinonim

Fraksi lipoprotein

utama yang

meningkat

Lipid utama yang

meningkat

I

II A

II B

III

IV

V

Hiperkilomkronemia

Hiperbetalipoprotenemia

Hiper-β & pra-β-LPP

lipoprotenemia

Hiper broad band LPPemia

Hoperpralipoprooteinemia

Hiperprabetalipoproteinem

ia

Kilomikron

LDL

LDL dan VDL

IDL

VLDL

VLDL dan

kilomikron

Trigliserid

Kolesterol

Kolesterol dan

trigliserid

Trigliserid dan

kolesterol

Trigliserid

Trigliserid dan

kilomikron

(Fredrickson, 1967)

Kolesterol merupakan substansi lemak, yang secara normal dibentuk

di dalam tubuh. Kolesterol dibentuk di hati dari lemak makanan. Kolesterol

memainkan banyak peran penting dalam fungsi sel tubuh(antara lain produksi

hormon). Kolesterol darah dapat dibagi menjadi 2 bagian utama: kolesterol

LDL (Low Density Lipoprotein) yang dikenal sebagai kolesterol jahat dan

kolesterol HDL (High Density Lipoprotein)yang dikenal sebagai kolesterol

baik. LDL membawa kolesterol dari hatike sel, dan HDL berperan membawa

kolesterol dari sel ke hati(Satriaperwira, 2008 ).

Kadar kolesterol LDL yang tinggi akan memicu penimbunan

kolesterol di sel, yang menyebabkan munculnya atherosclerosis(pengerasan

dinding pembuluh darah arteri) dan penimbunan plak didinding pembuluh

darah. Hal ini dihubungkan dengan penngkatan risikopenyakit akibat

gangguan pembuluh darah (misalnya: penyakit jantungkoroner, stroke,

gangguan pembuluh darah tepi) (Satriaperwira, 2008 ).

Kadar kolesterol darah yang tinggi dapat disebabkan oleh berbagai

faktor. Faktor-faktor penyebab kadar kolesterol yang tinggi adalah

genetic,diet tinggi lemak, kelebihan berat badan, kurangnya aktivitas fisik,

dan merokok. Merokok meningkatkan kadar kolesterol LDL dan menurunkan

kadar kolesterol HDL. Kadar kolesterol LDL yang tinggi dapat

puladisebabkan oleh konsumsi alkohol atau obat-obatan (misalnya: steroid

atau pil kontrasepsi) (Satriaperwira, 2008 ).

IV. ALAT DAN BAHAN

Alat

1. Spektrometer

2. Kuvet

3. Pipet piston

4. Sentrifuga

5. Tabung reaksi dan rak tabung reaksi

6. Spuit 3ml

Bahan

1. Serum, plasma-heparin atau EDTA

2. Alkohol 70%

Reagensia mengandung:

1. Reagen :

4-aminoantipyrin 0.30 mmol/l

Phenol 6 mmol/l

Peroksidase >0.5 U/ml

Kolesterol esterase > 0.15 U/ml

Kolesterol oksidase > 0.1 U/ml

Pipes buffer 80 mmol/l ; pH 6.8

2. Standard:

Kolesterol 5.17 mmol/l (200 mg/dl)

Persiapan dan stabilitas larutan:

1. Reagen:

Larutan siap untuk digunakan. Reagen ini stabil sampai waktu

kadaluarsa bila disimpan pada 2-8 °C, tidak terkontaminasi dan

terlindung dari cahaya langsung.

2. Standar:

Larutan siap untuk digunakan. Larutan standar stabil sampai waktu

kadaluarsa bila disimpan pada 2-8 °C

V. PROSEDUR

Ke dalam kuvet dipipetkan :

Blangko

Reagen (µl)

Standar

(µl)

Sampel (µl)

Aquadest 10 - -

Standar - 10 -

Sampel - - 10

Reagen 1000 1000 1000

Dicampurkan dan diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruangan.

Kemudian baca absorbansi sampel (Asampel) terhadap BR pada panjang

gelombang 500 nm. Diencerkan 0.1ml sampel dengan 0.2ml larutan NaCl

0.9% jika hasil melebihi 1000mg/dl (25.9mmol/I) Setelah itu dihitung

konsentrasi kolesterol dalam sampel, dengan persamaan:

Ckolesterol=

AsampelAs tan dar x 200 mg/dl

Ckolesterol=

AsampelAs tan dar x 5.17mmol/I

Percobaan ini dilakukan secara triplo.

VI. DATA PENGAMATAN

Kelompo

k

Blanko

(A)

Standar

d

(A)

Sampel I

(A)

Sampel II

(A)

Sampel III

(A)

Rata-rata

(A)

I 0,000 0,762 0,328 0,366 0,591 0,428

II 0,000 0,762 0,943 0,937 0,939 0,940

III 0,000 0,762 0,191 0,110 0,632 0,311

Perhitungan

Kelompok Konsentrasi

(mmol/l)

Konsentrasi

(mg/dl)

mg/100ml

(553X A sampel)

Mmol/l

(14.3X A

sampel)

I 0,428/0,762

X5.17

= 2,90

0,428/0,726 X

200

= 110,236

C= 553 X 0,428

=236,68

C=14,3 X 0,428

=6,12

II 0,940/0,762 X

5,17

=6,38

0,9401/0,762 X

200

=246,72

C= 553 X 0,940

= 519,82

C=14,3 X 0,440

= 13,442

III 0,311/0,762 X

5,17

=2,11

0,311/0,762 X200

= 81,63

C= 553 X 0.311

= 171,98

C= 14,3 X0,311

= 4,45

VII. PEMBAHASAN

Kolesterol adalah metabolit yang mengandung lemak sterol yang

ditemukan pada membran sel dan disirkulasikan dalam plasma darah.

Merupakan sejenis lipid yang merupakan molekul lemak atau yang

menyerupainya. Kolesterol ialah jenis khusus lipid yang disebut steroid.

Steroids ialah lipid yang memiliki struktur kimia khusus..

Tubuh manusia dan hewan yang normal akan berusaha memelihara

konsentrasi plasma kolesterol dengan cara mengatur sintesis dan ekskresi

kolesterol. Kolesterol yang melebihi kebutuhan tubuh akan dieliminir melalui

empedu, tetapi walapun begitu jika pasok kolesterol dari makanan berlebih

yang akhirnya melebihi kebutuhan tubuh, maka akan berakibat kurang baik

bagi tubuh dan dapat menimbulkan berbagai gangguan fisiologi seperti

artherosklerosis yang manifestasinya dapat menjadi penyakit jantung koroner

atau stroke.

Pada praktikum kimia klinik pertemuan ketiga adalah menentukan

kadar kolesterol pada darah. Hal ini dilakukan agar mahasiswa dapat

menyiapkan pasien untuk pemeriksaan kolesterol dalam darah, kemudian

mahasiswa dapat menginterprestasikan hasil laboratorium yang diperoleh.

Pada manusia, 60-70% diangkut oleh LDL, 20-35% oleh HDL dan 5-12% ole

VDL. Maka dari itu, praktikan ingin mengetahui seberapa banyakkah

kolesterol di dalam darah manusia, yakni dengan cara pemeriksaan kolesterol

pada sampel darah tertentu.

Preparasi pertama yang harus dilakukan adalah dengan cara

mempersiapkan segala alat dan bahan yang diperlukan untuk praktikum ini

diantaranya yaitu sampel darah. Adapun sampel darah yang akan digunakan

disimpan di dalam tabung darah khusus. Dalam pelaksanaannya harus dengan

hati-hati agar darah tidak terkontaminasi oleh zat lain, sehingga tidak akan

mengganggu dalam hal pemeriksaan.

Serum merupakan darah yang telah dipisahkan dari sel-sel darah

merah dan zat-zat koagulan serta biasanya berwarna kuning pucat. Larutan

reagen merupakan campuran dari beberapa enzim yang dapat mengubah

kolesterol menjadi suatu senyawa berwarna sehingga dapat dideteksi oleh

spektrofotometri UV-Vis.

Pada proses pengambilan larutan, yaitu aquadest, reagen, dan sampel

dilakukan dengan menggunakan mikropipet (pipet piston). Hal ini disebabkan

jumlah larutan yang diambil sangat sedikit (10 μL). Sebelum pipet piston

digunakan, bagian atas pipet yang disebut thumb knob sebaiknya ditekan

berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. Setelah itu tip bersih

dimasukkan ke dalam nozzle / ujung pipet piston sampai pas (tidak jatuh).

Thumb knob ditekan sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan

lebih ke dalam lagi karena cairan yang terambil akan lebih besar daripada

jumlah yang sebenarnya. Setelah itu, tip dimasukkan ke dalam cairan sedalam

3-4 mm karena jika kurang dari nilai tersebut dikhawatirkan cairan tidak

terambil sempurna (ada gelembung udara yang terambil), sedangkan jika lebih

dari nilai tersebut dikhawatirkan terdapat kontaminan dari tip pipet.

Selanjutnya pipet ditahan dalam posisi vertikal kemudian tekanan dari thumb

knob dilepaskan sehingga cairan masuk ke tip. Ujung tip dipindahkan ke

dalam kuvet. Untuk mengeluarkan cairannya, thumb knob ditekan sampai

hambatan kedua / second stop atau ditekan semaksimal mungkin sehingga

semua cairan keluar dari ujung tip. Pipet piston digunakan dalam percobaan

ini karena memiliki ketelitian, sensitivitas, dan spesifisitas yang tinggi bila

dibandingkan dengan pipet gelas.

Pada kuvet blanko, setelah dimasukkan aquadest dan larutan reagent,

kuvet digoyang agar larutan tercampur secara sempurna. Setelah itu kuvet

diinkubasikan pada suhu ruang yaitu 27 oC selama 10 menit. Proses inkubasi

ini bertujuan memberikan waktu untuk terjadinya reaksi antara kedua larutan

dalam campuran tersebut. Inkubasi ini juga dilakukan untuk kuvet standar dan

kuvet sampel. Pengukuran blanko perlu dilakukan karena dikhawatirkan

terjadi perubahan reagen pada saat inkubasi dan memberikan serapan pada

panjang gelombang pengukuran.

Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol

yang terdapat pada larutan standar dan sampel. Setelah diinkubasi, kedua

larutan yang tadinya berwarna bening dalam masing-masing kuvet berubah

menjadi warna merah rosa. Warna merah tersebut menandakan telah

terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna merah tersebut

berasal dari senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksi antara

reagen dan kolesterol. Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut :

Ester kolesterol+H 2O kolesterol esterase→

Kolesterol+asam−asamlemak

Kolesterol+O2 Kolesterol oksidase→

Kolestenon+ H 2O2

2 H 2O2+4 aminoantipirin+ fenol peroksidase→

quinoneimine+H 2 O

Perubahan warna (menjadi berwarna merah) diperlukan agar campuran

larutan dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer

UV-Vis, khususnya dengan sinar visibel. Quinoeimine akan terukur

absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dan nilai absorbansi tersebut

sebanding dengan kadar kolesterol dalam darah. Setelah inkubasi selesai,

masing-masing larutan blanko, standard dan sampel diukur absorbansinya

dengan spektrofotometer. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang

546 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum untuk quinoeimine.

Untuk larutan sampel, pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali (triplo) agar

kesalahan pada saat pengukuran dapat dihindari sehingga hasilnya lebih

akurat. Ketiga hasil yang didapat dirata-ratakan dan dihitung kadar kolesterol

dalam sampel.

Larutan blanko yang sudah dimasukkan ke dalam tabung reaksi

kemudian disimpan (inkubasi) selama 10 menit minimal pada suhu ruangan

(15-25 oC).

Blanko yang sudah disimpan kemudian diperiksa oleh instrumen

spektofotometri untuk mengetahui  panjang gelombang (λ) yang nantinya

akan digunakan dalam pemeriksaan sampel. Absorbansi yang diperoleh pada

saat pengukuran larutan sampel adalah 0,328 ; 0,366 ; dan 0,591. Rata-rata

absorbansi larutan sampel adalah 0,28. Sedangkan absorbansi larutan standar

adalah 0,762. Karena larutan blanko memberikan absorbansi yaitu 0,001 maka

absorbansi masing-masing sampel dan standar dikurangi dengan nilai

absorbansi blanko agar diperoleh absorbansi sampel dan standar yang

sebenarnya. Nilai dari kedua absorbansi tersebut dapat digunakan untuk

menghitung kadar kolesterol dalam sampel dengan menggunakan rumus :

[ Kolesterol ]dalam sampel=A sampel

A standar

×[kolesterol ]standar

Konsentrasi kolesterol standar (normal) adalah dibawah 200 mg/dl.

Nilai konsentrasi kolesterol dalam sampel yang diperoleh dari perhitungan

sebesar 112,34 mg/dl. Nilai tersebut merupakan nilai standar buat normal

Penentuan kadar kolesterol dilakukan dalam beberapa tahap,

diantaranya yakni mempersiapkan larutan baku pembanding (standar) atau

biasa kita kenal sebagai larutan Blanko. Larutan blanko diambil dari reagen

kit kolesterol untuk perbandingan sampel dengan larutan baku standar.

Setelah itu lalu masuk ke dalam perlakuan sampel darah yang akan

digunakan dalam pemeriksaan kali ini. Sampel terbaik adalah serum.

Kolesterol dalam serum stabil selama 1 minggu pada suhu kamar (18-30  oC)

dan 6 bulan pada keadaan beku. Adapun nilai kolestrol yang normal pada

tubuh manusia yakni < 200 ml/dl.

Seperti halnya pada larutan blanko, sampel darah dimasukkan kedalam

tabung reaksi menggunakan clinipette sebanyak 10 µl kemudian masukkan

reagen glukosa sebanyak 1,0 µl setelah itu sample di inkubasi selama 10

menit. Setelah penambahan reagen pada sampel terbentuk larutan berwarna

merah muda (pink). Sampel yang sudah di inkubasi kemudian di uji

menggunakan Spektrofotometer untuk mengetahui panjang gelombang (λ)

dan absorban pada sampel.

Setelah dilakukan pemeriksaan terhadap sampel, tahapan selanjutnya

yakni dengan melakukan perhitungan nilai absorban standard dan nilai

absorban sampel dengan konsentrasi standar. Hal ini dilakukan agar nilai

kolesterol dalam sampel dapat diketahui. Perhitungan nilai konsentrasi

kolesterol dapat dilakukan dengan menggunakan rumus, yakni :

Csampel =  x Cstandar

Adapun nilai konsentrasi kolesterol dalam darah (serum) yang didapat

adalah sebesar 112,34 mg/dl.

VIII. KESIMPULAN

Daripada percobaan yang dilakukan,didapati konsentrasi kolestrol

dalam sampel adalah 2,90 mmol/l dan 112,43 mg/dl manakala konsentrasi

kolestrol dalam sampel dengan panjang gelombang 500 nm adalah 236,68

mg/100ml dan 6,12 mmol/l.Pasien didapati pada tahap perbatasan.Pasien

untuk pemeriksaan kolestrol dalam darah telah disiapkan dan data telah

diintepretasikan.

DAFTAR PUSTAKA

Fridrickson.1967.Hyperlipidemia.http://medicastore.com/nutracare/isi_choles

s.php?isi_choless=hiperlipid (akses tanggal 30 maret 2013

 

Ridwanaz. 2010. Pengertian kolesterol. http://ridwanaz.com/http://

ridwanaz.com/kesehatan/pengertian-kolesterol/akses tanggal(30 Maret

2013)

Satriaperwira. 2008. Patofisiologi Pembentukan Plaque from various sources.

http://satriaperwira.wordpress.com/2008/12/26/patofisiologi-

pembentukan-plaque/ (akses tanggal 31 maret 2012)

Soeharto, I. 2004.Serangan Jantung dan Stoke Hubungannya Dengan Lemak

dan Kolesterol. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama