Pelajaran 1 pemotongan inti sampel dnaPertimbangan bagaimana kita dapat mendeteksi perbedaan dalam urutan basa.Sekilas tugas anda mungkin tampak agak sulit. Anda perlu untuk menentukan apakah urutan pasangan basa linier dalam sampel dna identik atau tidak! Pemahaman tentang beberapa penemuan penting dalam sejarah tecknology DNA rekombinan dapat membantu anda untuk mengembangkan rencana.Pada tahun 1968 dr. Werner Arber di universitas Basel, Swiss dan dr. Hamilton Smith di universitas Johns Hopkins, Baltimore, menemukan sekelompok enzim dalam bakteri, yang ketika ditambahkan ke dna akan mengakibatkan kerusakan [hidrolisis] dari ikatan gula fosfat antara basa nukleotida khusus tertentu [situs dikenal]. Ini menyebabkan untai ganda DNA untuk istirahat di sepanjang situs yang dikenal dan molekul dna patah menjadi dua bagian. Gunting molekul atau yang "memotong" enzim ini adalah endonuklease restriksi.

Garis antara pasangan basa merupakan situs di mana akan pecah jika pembatasan endonuklease EcoRI recorgnizes itu situs GAATC. Pertanyaan-pertanyaan analisis berikut mengacu pada bagaimana sepotong DNA akan berpengaruh jika endonuklease restiksi "memotong" molekul DNA dengan cara di atas.1. Berapa banyak potongan dari DNA akan dihasilkan dari pemotongan ini? dua (2) fragmen

2. Tuliskan urutan basa dari fragmen DNA pada kedua sisi kiri dan kanan dari "potongan".

Left :Right :ATG AATTCTCAATTACCT TACTTAA GAGTTAATGGA3. Apa perbedaan dari dua bagian tersebut?

Dari kedua potong/fragmen, perbedaan terlihat dari panjang fragmen dan jumlah pasang basa.

4. Ukuran fragmen DNA dapat dinyatakan sebagai jumlah pasangan basa dalam fragmen. Menunjukkan ukuran fragmen [Sebutkan setiap dicrepancy anda dapat mendeteksi]a. Fragment terkecil adalah 3 pasangan basab. berapa panjang dari panjang fragmen? 11 pasangan basa5. Meninjau dua sampel DNA yang ditunjukkan di bawah ini - untai tunggal yang menunjukan kesederhanaan.Sample #1C A G T G A T C T C G A A T T C G C T A G T A A C G T TSample #2T C A T G A A T T C C T G G A A T C A G C A A A T G C AJika kedua sampel diperlakukan dengan enzim restriksi EcoRI [urutan pengakuan GAATTC] kemudian menunjukkan jumlah fragmen dan ukuran masing-masing fragmen dari masing-masing sampel DNA.

Sample #1Sample #2 # of fragments # of fragmentsA A T T C G C T A G T A A C G T TA A T T C C T G G A A T C A G C A A A T G C ADaftar ukuran fragmen dalam rangka terbesar ------------ terkecil.Sample #1Sample #2 C A G T G A T C T C G T C A T G

Pelajaran 1 pemotongan inti sampel dnaSetelah observasi yang cermat, jelas bahwa satu-satunya perbedaan antara DNA dari individu yang berbeda adalah urutan linear pasangan basa mereka. Di laboratorium, tim anda akan diberikan 6 sampel DNA. Ingatlah bahwa tugas anda adalah untuk menentukan apakah salah satu dari mereka berasal dari individu yang sama atau jika mereka dari individu yang berbeda.Sejauh ini anda telah belajar berikut Persamaan dan perbedaan antara DNA dari individu yang berbeda. Bagaimana endonuklease restriksi memotong (menghidrolisis) molekul DNA. Bagaimana menambahkan pembatasan endonuklease yang sama untuk dua sampel DNA bisa memberikan beberapa petunjuk tentang perbedaan dalam urutan pasangan basa mereka.sekarang anda telah memiliki pemahaman yang cukup jelas dari tiga item ini, anda siap untuk melanjutkan ke tahap pertama dari sidik jari DNA prosedur untuk melakukan pemotongan inti sampel DNA anda.

Checklist laporan kerja andaPastikan bahan yang tercantum dibawah disajikan di laporan laboratorium anda sebelum memulai praktikum.Material yang dibutuhkanJumlah

Agarose gel elektroforesis sistem (sumber elektroforesis, nampan, 8 well comb1

EcoRI/PstI enzym mix 1 tube (80 ul)

Pipet tips, 2-200 ul 15 tips

Micropipet,2-200 ul 1

Colored micro test tubes:

Green, blue,orange, violet, red, yellow 1

Permanent marker 1

Waste container 1

Foam micro test tube holder 1

Laboratory tape (not 3M scotch brand or similar tape) 1

Instruktur workstation

Crime scene DNA with buffer, rehydrated 1 vial

Suspect 1 DNA with buffer, Rehydrated 1 vial

Suspect 2 DNA with buffer, rehydrated 1 vial

Suspect 3 DNA with, buffer, rehydrated 1 vial

Suspect 4 DNA with buffer, rehydrated 1 vial

Suspect 5 DNA with buffer, rehydrated 1 vial

Molten 1% agarose 1x TAE (See Advance Prep) 40-50 ml per gel

370C water bath or incubator (optional) 1 per class

Microcentrifuge 1 per class

Or mini centrifuge 4 per class

Observasi 1. Menggambarkan sampel DNA (sifat fisik)2. Apakah ada perbedaan pengamatan antara sampel DNA3. Menggambarkan penampilan campuran endonuklease restriksi4. Menggabungkan dan mereaksikanMenggunakan tip pipet baru untuk setiap sampel, pipet 10 ul dari campuran enzim "ENZ" untuk masing-masing tabung reaksi seperti yang ditunjukkan di bawah ini. Pipet up dan hati-hati saat mengadukCatatan : Ganti tip setiap kali anda mengganti reagen, atau, jika ujung menyentuh salah satu dari cairan di salah satu tabung secara tidak sengaja. Ketika ragu, ganti ujungnya! Masukan DNA kedalam tabung sebelum enzim. Selalu tambahkan enzim di terakhir kalinya.

Now your DNA samples should contain:DNA Samples(10 ul each)EcoRI/PstlEnzyme MixTotalReactionVolume

Crime scene (CS)Suspect 1 (S1)Suspect 2 (S2)Suspect 3 (S3)Suspect 4 (S4)Suspect 5 (S5)10 ul10 ul10 ul10 ul10 ul10 ul20 ul20 ul20 ul20 ul20 ul20 ul

5. Campuran isi tabung

Tutup rapat pada setiap tabung. Menjentikan tabung dengan hati-hati menggunakan jari anda untuk mencampur komponen. Jika centrifuge tersedia, getarkan tabung selama dua detik agar memaksa cairan ke bagian bawah tabung untuk mencampur dan menggabungkan reaktan. (Pastikan tabung dalam susunan SEIMBANG pada rotor). Jika lab anda tidak dilengkapi dengan centrifuge, cepat kocok tabung (sekali sudah cukup) seperti termometer. Penyadapan tabung di bangku laboratorium juga akan membantu untuk menggabungkan dan campuran isi.

6. Menginkubasi sampel

Tempatkan tabung dalam dudukan busa mikro tabung dan menetaskan mereka 370C selama 45 menit. Atau, tabung dapat diinkubasi dalam volume besar kemudian air dipanaskan sampai 370C dan dibiarkan perlahan-lahan mencapai suhu kamar semalam. Setelah mengeram, simpan inti DNA dalam lemari es sampai periode lab berikutnya, atau langsung melanjutkan ke langkah 2 pelajaran 2 jika diperintahkan oleh guru anda.

Catatan : Sementara Anda menunggu, ini adalah saat yang tepat untuk melemparkan gel agarosa Anda, kecuali jika mereka telah siap untuk Anda. Periksa dengan guru anda untuk prosedur yang tepat.

Pelajaran 1 pemotongan inti sampel DNA

Meninjau pertanyaan1. Sebelum anda inkubasi sampel Anda. Jelaskan tanda-tanda yang terlihat dari perubahan isi tabung yang berisi DNA setelah itu dikombinasikan dengan anzymes restriksi.Tidak terlihat/tidak adanya perubahan

2. Bisakah anda memberikan bukti untuk menunjukkan bahwa sampel DNA telah terfragmentasi atau berubah dengan cara apapun penambahan EcooRI / Pstf? JelaskanTidak terlihat, karena fragment DNA hanya dapat terlihat setelah melakukan elektroforesis dan ukurannya sangat kecil.

3. Dengan tidak adanya bukti nyata dari perubahan, apakah masih mungkin bahwa sampel DNA adalah fragmen? Jelaskan alasan Anda.Tidak ada, karena harus melakukan eltroforesis agar dpat menentukan fragmen dari sampel DNA.

4. (Jawaban pada hari berikutnya setelah restriksi dicerna)Setelah masa inkubasi 24 jam, apakah ada petunjuk yang terlihat bahwa enzim restriksi mungkin dalam beberapa cara mengubah DNA dalam salah satu tabung? Jelaskan alasan Anda Tidak ada terlihat, karena ukurannya sangat kecil.

Pelajaran 2 elektroforesis gel agarosa (Prosedur Laboratorium)Student workstationQuantity ()

Agarose gel electroforesis systemAgarose gelDigested DNA samplesHindlll lambda digest (DNA samples)DNA sample loading dyePermanent markerPipet tips, 2-20 ulMicropipet, 2-20 ulWaste containerGel support film (if applicable)Fast Blast DNA stain, 1x or 100xLarge containers for destaining (if applicable)Foam micro test tube holder Power supplyGel staining trayElectrophoresis buffer (1x TAE)11611113111120 ml per 2 stations1-3 per 2 stations111per 2 stations275 ml per stations

Instructors Workstation

MicrocentrifugeOr mini centrifugeRocking platform (optional)141

if performing the quick staining procedure 0.25 x TAE buffer is used for fast gel electrophoresis. Refer to Appendix D for detailed information.

1. Dapatkan gel agarosa prepoured dari guru anda, atau jika guru anda memerintahkan anda untuk melakukan persiapan gel anda sendiri.2. Setelah menyiapkan gel, pindahkan sampel inti dari retigerator menggunakan tip baru untuk setiap sampel tambahkan 5 ul dari sampel loading dye "LD" untuk masing-masing tabung.

DNA SamplesLoading dye

Crime scene (CS)Suspect 1 (S1)Suspect 2 (S2)Suspect 3 (S3)Suspect 4 (S4)Suspect 5 (S5)5 ul5 ul5 ul5 ul5 ul5 ul

LDTutup rapat pada setiap tabung. Jentikan tabung dengan hati-hati menggunakan jari anda untuk mencampur komponen. Jika centrifuge tersedia, getarkan tabung untuk membawa isi ke bagian bawah tabung. jika tidak, tekan dengan lembut tabung di atas meja.3. Tempatkan tuangan nampan dengan gel dipadatkan di dalamnya, ke dalam platform kotak gel. Sumber harus berada di (-) akhir katoda dari kotak, dimana timah hitam terhubung. Sangat berhati-hati, saat melepaskan penggaruk dari gel dengan menariknya lurus ke atas.4. Tuangkan 275 ml elektroforesis penyangga ke dalam ruang elektroforesis. Tuangkan penyangga dalam kotak gel sampai menutupi sumber gel dengan 1-2 mm.

5. Dapatkan tabung Hindlll lambda inti (penanda DNA). Loading dye harus sudah ditambahkan oleh instruktur anda.6. Gunakan ujung pipet terpisah untuk setiap sampel, mengisi sampel inti DNA anda ke gel. Gel dibaca dari kiri ke kanan. Sampel pertama dimuat dalam sumber di sudut kiri gel.Lane 1:Hindlll DNA penanda ukuran, tabung yang jelas, 10 ulLane 2:CS, tabung hijau, 20 ulLane 3:S1, tabung biru, 20 ulLane 4:S2, tabung orange, 20 ulLane 5:S3, tabung ungu, 20 ulLane 6:S4, tabung merah, 20 ulLane 7:S5, tabung kuning, 20 ul

7. Amankan tutup yang ada pada kotak gel. Tutupnya akan terpasang ke dasar hanya dalam satu orientasi: merah ke merah dan hitam ke hitam. Hubungkan lead listrik ke catu daya.8. menghidupkan power supply. Set untuk 100 V dan Electrophorese sampel selama minimal 30 menit. Gel ini dapat berjalan selama hingga 40 menit untuk meningkatkan resolusi dalam waktu tersedia. Fast Gel Protokol dalam Lampiran D memungkinkan gel yang akan dijalankan di 20 menit pada 200 V.

Sementara anda menunggu gel untuk dijalankan, anda mungkin dapat meninjau pertanyaan di halaman berikut.

9. Ketika elektroforesis selesai, matikan suplai daya dan lepaskan tutup dari kotak gel. Hati-hati saat melepas nampan gel dan gel dari ruang elektroforesis. Hati-hati, gel ini sangat licin! Lanjutkan ke pg 35 untuk petunjuk rinci tentang pewarnaan gel anda.

Pelajaran 2 elektroforesis gel agarosa (Prosedur Laboratorium)Meninjau Pertanyaan1. Peralatan elektroforesis menciptakan medan listrik dengan kutub positif dan negatif di ujung gel. Molekul DNA bermuatan negatif. Yang mana medan kutub elektroda elektroforesis DNA yang anda duga berpindah? (+ Atau -)? Jelaskan. DNA akan berpindah ke kutub postif (anoda) pada hasil elektroforesis, karena sudah dilakukan diatas DNA bermuatan negatif. Maka muatan negatif akan bergerak ke kutub positif.2. Warna apa yang menggambarkan kutub negatif? Warna merah3. Setelah sampel DNA yang dimuat ke dalam sumber sampel. mereka "dipaksa" untuk bergerak melalui matriks gel. Apa ukuran fragmen (besar vs kecil) yang anda duga bergerak ke arah ujung gel dengan cepat? Jelaskan Kecil lebih cepat daripada yang besar karena yang besar akan cenderung terhambat oleh pori- pori dari matiks gel agarose.4. Fragmen yang (besar vs kecil) dapat diharapkan melakukan perjalanan jarak terpendek dari sumber? Jelaskan Fragmen DNA yang besar lebih pendek jangkauannya karena memiliki berat yang lebih besar sehingga perjalanan melalui gel agarose lebih lambat.