Pemotongan molekul DNA menggunakan Enzim

Restriksi Endonuklease

Oleh:Kelompok 1

30/05/2011

Apakah DNA itu ?

• Merupakan salah satu makromolekul yang memiliki peranan penting pada jasad hidup.

• Merupakan polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis.

• Merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada keturunannya.

30/05/2011

Struktur DNA

Pertama kali oleh J. Waston dan F. Crick pada tahun 1953 yang membuat struktur untai ganda (double helix) yang tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin dan mempunyai orientasi yang berlawanan serta berikatan dengan ikatan hidrogen antara basa A dengan T dan C dengan G.

30/05/2011

Gambar struktur DNA dalam bentuk Watson and Crick

30/05/2011

Sejarah pemotongan DNAPada akhir 1960-an, ilmuwan Stewart Linn dan Werner Arber mengisolasi dua contoh enzim yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteriofag yang menyerang E. coli. Salah satu enzim bekerja memetilasi DNA, sedangkan enzim yang satunya bekerja memotong DNA yang tidak termetilasi pada beberapa lokasi di sepanjang molekul DNA. Enzim yang pertama disebut metilase (methylase), sedangkan enzim yang satunya disebut nuklease restriksi (restriction nuclease).Kemudian pada tahun 1968, H.O. Smith, K.W. Wilcox, dan T.J. Kelley, yang bekerja di John Hopkins University, mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim nuklease restriksi pertama.

Enzim ini berasal dari bakteri Haemophilus influenzae, dan diberi nama HindII. Enzim ini selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik dengan panjang situs pengenalan enam pasang basa.

30/05/2011

Pemotongan DNA

• Melibatkan beberapa enzim nuklease dengan cara memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya.

• Enzim nuklease terbagi dua yaitu eksonuklease dan endonuklease (memotong bagian internal DNA pada ikatan fosfodiester).

30/05/2011

Gambar pemotongan molekul DNA

30/05/2011

Tipe enzim retriksi endonuklease

• Tipe I, bergerak secara acak, dan memotong DNA pada daerah yang berlainan dengan daerah pengenalannya.

• Tipe II, bergerak secara duplek, dan memotong DNA pada target sasaran tertentu di tempat atau di dekat daerah pengenalannya.

• Tipe III, memotong DNA pada bagian yang spesifik pada derah yang berdekatan dengan daerah pengenalannya.

30/05/2011

Perkiraan pemotongan DNA• 6 cutters

Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan yang spesifik pada 6 nukleotida. Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim dapat memotong satu atau dua situs pada plasmid, tetapi jarang memotong bagian penting seperti titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin. Contoh enzim 6-cutters adalah HindIII (AAGCTT) yang memotong genome bakteriofage lambda (48 kbp) pada 7 situs.

30/05/2011

Lanjutan...

• 8 cuttersEnzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok digunakan untuk membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian. Jika langsung menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-cutters

30/05/2011

Lanjutan...• 4 cutters

Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion) menggunakan enzim 4-cutters

30/05/2011

Hasil pemotongan DNA

1. unjung blunt atau flush, menghasilkan fragmen yang double-stranded.

30/05/2011

30/05/2011

Lanjutan...

Ujung tumpulEnzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI

30/05/2011

30/05/2011

Ujung tumpul

2. ujung sticky atau cohesive, menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’ yang menggantung.

30/05/2011

• Ujung menggantung 5’Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah BamHI

30/05/2011

30/05/2011

Ujung menggantung 5’

Lanjutan...

• Ujung menggantung 3’Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, namun menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI

30/05/2011

30/05/2011

Ujung menggantung 3’

Contoh enzim retriksi endonuklease

30/05/2011

enzim restriksi dengan sekuens pengenal dan organisme asalnya

30/05/2011

Nama Enzim Sekuens Pengenal Organisme Asal

EcoRI G↓AATTC Escherichia coli

HindIII A AGCTT Haemophilus influenzae

HhaI GCG C Haemophilus haemolyticus

TaqI T↓ CGA Thermis aquaticus

BsuRI GG CC Bacillus subtilis

BalI TGG ↓CCA Brevibacterium albidum

luthfi al fairuz/biologi UIN Makassar 23

Bagaimana jika sekuens DNA tidak dikenali ?

Jika sekuens pengenal pada urutan DNA tidak diketahui, maka dilakukan pengklasifikasian DNA untuk mengetahui daerah pengenal yang terdapat pada DNA tersebut.

30/05/2011

Tahapan Pengklasifikasian DNA

• Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membrane nilon.

• Menyediakan hybrization probe (pelacakan DNA). Sekuens molekul DNA yang komplementer dengan DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida sintetik. Pelabelan kemudian dideteksi dengan menggunakan autoradiography.

30/05/2011

25

NAMA KELOMPOK

• LUTHFI• MUALLIMAH• LUTFIATUL HIDAYAT• ANDI MUNAWIR• HILDA

30/05/2011 luthfi al fairuz/biologi UIN Makassar

Renungilah apa yang telah anda kerjakan,Dan pikirkanlah apa yang akan anda lakukan.Sesungguhnya Kesempatan itu selalu menyertai anda, tetapi anda tidak menydarinya.Hari ini adalah hari yang baik untuk anda,Maka berbuat baiklah mulai hari ini.(luthfi/kata bijak 05)

26

sekian

Thank You

Assalamualaikum Wr.Wb.

30/05/2011 luthfi al fairuz/biologi UIN Makassar