NEW Produksi Abm
-
Upload
djumadi-akbar -
Category
Documents
-
view
221 -
download
0
Transcript of NEW Produksi Abm
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
1/70
1
TEKNIK PRODUKSI ANTIBODI
MONOKLONAL
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
2/70
2
Teknik Hibridoma(teknik produksi antibodi monoklonal)
Hibridoma:
Hasil fusi limfosit + sel mieloma
Sifat:
mensekresi antibodi
imortal (hidup dlm kultur)
Tujuan:
menghasikan antibodimonoklonal (Abm)
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
3/70
3
i
Antibodi poliklonal: isekresikan beberapa klon limfosit
!engenal beberapa epitop
Heterogen" tidak spesifik
Titern#a rendah" sukar dikarakterisasi
Antibodi monoklonal: isekresikan satu klon limfosit
!engenal satu epitop
Homogen" lebih spesifik
Titern#a tinggi mudah dikarakterisasi
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
4/70
$
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
5/70
%
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
6/70
&
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
7/70
'
Tahapan produksi Abm
en#ediaan antigen
*munisasi hean ,oba
ersiapan sel mieloma
ersiapan feeder ,ell -usi limfosit imun + sel
mieloma
Seleksi hibridoma . kloning ropagasi hibridoma
emurnian antibodi
monoklonal
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
8/70
/
en#ediaan antigen
Antigen permukaan:
iperoleh dg ,ara ekstraksi
(detergent)
Antigen 0S:
iperoleh dg ,ara kultur in
itro Antigen somatik:
iperoleh dg ,ara sonikasi
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
9/70
*munisasi hean ,oba: men,it
umlah: beberapa ekor men,it (14 ekor betina) Tujuan: limfosit 5 #g imun
6ara: sub-cutan" intra peritoneal
dosis tertentu" di,ampur ajuan dilakukan 37" interal 12 hari
booster" i (3-4 hari sblm fusi)
8espon imun men,it: ,ara 09*SA ipilih men,it dg respon imun paling tinggi
9ien diambil se,ara steril dlm laminar hood
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
10/70
14
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
11/70
11
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
12/70
12
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
13/70
13
i
*solasi limfosit dari lien #g telah diimunisasi: 9ien dihan,urkan dlm !edia 8!*1&$4
imasukkan kedlm tabung sentrifus" diendapkan
6airan supernatan mengandung limfosit
umlah limfosit dihitung (14/sel)
ersiapan sel mieloma: lasma,#toma: tumor ganas dari sel plasma S#arat:
sel mieloma men,it
tidak mensekresi rantai ringan imunoglobulin
tidak mempun#ai en;#m H
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
14/70
1$
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
15/70
1%
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
16/70
1&
i
-eeder ,ell (makrofag): ipersiapkan 12 hari sebelum fusi
iambil dari intraperitoneal men,it
ijaga sterilitasn#a" diteteskan pd sumuran mikrokultur
-ungsi: membersihkan sel #g mati
membantu pertumbuhan hibridoma
6aran#a:
14 ,, 8!* disuntikkan intraperitoneal men,it
!en,it didiamkan beberapa menit
6airan intraperitoneal men,it diambil kembali dg spuit iteteskan pd sumuran mikrokultur . diinkubasikan dlm
6>2 inkubator %?" suhu 3'46
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
17/70
1'
-usi: limfosit imun + sel mieloma
iperlukan fusogen: polietilen glikol (02%?" suhu 3'46
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
18/70
1/
Hasil fusi
Ada beberapa kelompok sel:
Hasil fusi sel limfosit + sel mieloma (hibridoma)
Hasil fusi sel limfosit + sel limfosit
Hasil fusi sel mieloma + sel mieloma
Sel limfosit #g tidak berfusi
Sel mieloma #g tidak berfusi
5agaimana memisahkan kelompok sel hibridoma
dari kelompok sel lainn#a
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
19/70
1
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
20/70
24
Seleksi hibridoma
!enggunakan media seleksi HAT (hipo7antin"
aminopterin dan timidin)
Sel hibridoma tetap hidup (H
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
21/70
21
Produksi dan seleksi hibridoma
- Sel memiliki dua jalur dalam sintesis nukleotida#aitujalur de novo danjalur salvage
(penyelamatan).- Sel #ang dikultur in itro bisa bertahan hidup
menggunakan kedua jalur tersebut ika dilakukanmutasi pada en;im #ang terkait sintesis nukleotida"
maka kita bisa memanipulasi sel mamalia
tersebut H
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
22/70
9anj Seleksi Hibridoma
0n;im H
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
23/70
Camun" sel m#eloma sendiri adalah defisiensi en;im
H
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
24/70
2$
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
25/70
2%
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
26/70
2&
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
27/70
2'
=loning
Tujuan:
!endapatkan satu klon hibrid
6ara: dlm agar lunak (semi solid agar)
pengen,eran terbatas (limiting dilution)
=loning dg limiting dilution: umlah sel hibrid #g tumbuh dihitung
ien,erkan sehingga setiap 144Dl mengandung
satu sel 144Dl medium tsb diteteskan pd setiap sumuran
mikrokultur shg setiap sumuran akan tumbuh
satu klon hibrid
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
28/70
2/
i
=lon hibridoma #g tumbuh: ada dua kelompok:
Hibridoma penghasil antibodi monoklonal
(produ,er) Hibridoma tidak menghasilkan antibodi
monoklonal (non-producer)
Hibridoma produ,er dan non-producerdiseleksi dg,ara:
6airan supernatan #g diduga mengandung
antibodi diambil dan diperiksa dg ,ara 09*SA
Hibridoma produ,er ditumbuhkan: in itro" in
io
Hibridoma nonprodu,er: dibuang
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
29/70
2
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
30/70
34
0lisa plate
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
31/70
Hasil 09*SAsubklas Abm *g
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
32/70
32
ropagasi hibridoma produ,er
(in itro)
Tujuan: !endapatkan titer Abm #g tinggi
6ara:
!ikrokultur & ell" 2$ ell" flask !edia penumbuh (dlm inkubator 6>2 %?" suhu 3'
46:
8!*1&$4" 2% m! H00S
-6S 14?
Antibiotika (enstrep"
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
33/70
33
9aminar Hood -lo
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
34/70
3$
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
35/70
3%
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
36/70
3&
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
37/70
3'
*nerted mi,ros,ope
!elihat pertumbuhan sel dlm
media
6aha#a dari atas
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
38/70
3/
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
39/70
3
=elemahan propagasi hibridoma in itro
Titer Abm #g diperoleh rendah
(Dg @ ml)
!udah terkontaminasi bakteri"
jamur sehingga hibridoma,epat mati
Abm belum murni ter,emar
protein
erlu purifikasi dg kromatografi
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
40/70
$4
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
41/70
$1
ropagasi hibridoma produ,er
(in io)
=lon hibridoma disuntikkan intraperitoneal men,it
Sebelumn#a men,it disuntik pristane" intraperitoneal
Hibridoma akan tumbuh dg ,epat
!ensekresikan Abm dlm intraperitoneal Terjadi as,ites dlm aktu 2 minggu
=elebihan:
Tidak terkontaminasi" titer Abm tinggi (mg @ ml)
=elemahan: !en,it segera mati ok sesak nafas
Abm ter,emar prot lain" harus dipurifikasi
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
42/70
ropagasi in io
$2
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
43/70
Hibridoma
$3
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
44/70
engamatan Hibridoma dengan
!ikroskop *nerted
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
45/70
!en,it 5alb6 asitessiap panen
Abm dari ,airan asites
$%
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
46/70
$&
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
47/70
$'
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
48/70
$/
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
49/70
$
i
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
50/70
%4
urifikasi antibodi monoklonal
*n itro: Abm + protein media (-5S@-6S)
*n io: Abm + protein men,it :
albumin
transferin@feritin
imunoglobulin
6ara:
resipitasi dengan amonium sulfat jenuh =romatografi pertukaran ion
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
51/70
%1
resipitasi amonium sulfat jenuh
6airan asites disentrifugasi
Supernatan diambil
itambahkan amonium sulfat jenuh sama ban#ak
('%4 gram dalam 1 liter aEuadest)
isentrifugasi 1444 ppm (14 menit" suhu $46)
0ndapan: Abm + amonium sulfat
supernatan: protein lainn#a
ilakukan dialisis: memisahkan Abm dg amonium sulfat
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
52/70
%2
=romatographi pertukaran ion(hidroksilapatit" stanker et al" 1/%)
-ase diam:
hidroksilapatit
4"41! Caphosphat +
4"42? Caa;ide) -ase gerak: 4"41!
4"3! Caphosphat pH
&/
ompa peristaltik: 24
ml@ jam
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
53/70
%3
6ara:
6airan asites disentrifugasi
Supernatan dimasukkan ke dalam kolom
hidroksilapatit
ialiri fase gerak
-raksifraksi ,airan asites ditampung dalamtabung
6airan asites dlm tabung diperiksa dg 0lisa
Albumin: tabung no 1 s@d 14 (4"41! Caphosphat)
Transferin: tabung no 11 s@d 1%
Abm: tabung no F 1% (4"2! Caphosphat)
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
54/70
%$
Karakterisasi Abm
=lasifikasi (*g
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
55/70
%%
=elasifikasi Abm
6ara 0lisa: mouse typer sub-isotyping kit (5iorat),onjugat: anti *g
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
56/70
%&
SPESIFISIAS
iuji dg protein nematoda lainn#a
iuji dg antigen beredar nematoda lainn#a
6ara:
09*SA: rotein nematoda dilekatkan pada dasar sumuran
Antibodi monoklonal
6onjugat + substrat (peroksidase + >)
ika timbul arna: terjadi reaksi silang
ika tidak timbul arna: spesifik
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
57/70
%'
!A"A #AI$$%A
09*SA inhibisi:
rotein 0S dilekatkan pada dasar sumuran
Antibodi monoklonal + protein nematoda
6onjugat + substrat (alkalin fosfatase + C)
ika timbul arna: spesifik
ika tidak timbul arna: tidak spesifik
pt menentukan derajat raksi silang
09*SA sandi,h: Antibodi poliklonal dilekatkan pada dasar sumuran
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
58/70
%/
Titer antibodi monoklonal
6ara:
09*SA:
protein 0S dilekatkan pada dasar sumuran
antibodi monoklonal dg berbagai pengen,eran ,onjugat
substrat
Titer:pengen,eran Abm tertinggi masih timbul arna
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
59/70
%
Topologi epitop protein 0S
*munobloting:
rotein 0S diuraikan dg SSA
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
60/70
&4
Sensitiitas antibodi monoklonal: !endeteksi protein minimal dalam serum (09*SA)
en#impanan hibridoma: Antibodi monoklonal sudah ,ukup
!edia habis
6ara: -ree;ing medium: 8!* (14?)" !S> (24?)" -6S
('4?)
idinginkan bertahap: 2446 selama 3$ jam
'446 selama 1 malam Citrogen ,air: 1&46
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
61/70
&1
Penerapan antibodi monoklonal
iagnostik (penanda): parasit" bakteri" irus" tumor
Terapi: pen#akit autoimun
8iset dasar: pemurnian protein
iagnostik: parasit (lasmodium" To7oplasma" -ilaria
Tr#panosoma" 9eishmania" S,histosoma)
Gang dideteksi: antigen beredar (circulating antigen)
infeksi masih aktif6ara:
09*SA sandi,h" ot 09*SA" *munositokimia
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
62/70
&2
Aplikasi terapi dari Antibodi monoklonal
1 *nduksi imunisasi pasif
2 iagnostik imaging Antibodi monoklonal dapat digunakan untuk
melihat protein tertentu dalam tubuh" misal antibodi monoklonaldikonjugasikan dengan logam inert pasien #ang dirontgen ari
hasil rontgen tersebut dapat dikenali protein tertentu #ang terlibat
dalam pen#akit 6ara ini juga diterapkan dalam melihat
metastasis sel kanker
3 iagnostik molekular Antibodi monoklonal dapat diaplikasikanuntuk identifikasi pen#akit #ang lebih dikenal dengan imunologikal
diagnostik i mana deteksi imunologik merupakan deteksi
imunologik merupakan sistem deteksi #ang sensitif" spesifik" dan
sederhana !isal: membedakan H- dan tifus
$ !onitoring terapi obat (untuk liesaing drug)% Sistem penghantaran obat (rug delier# s#stem@S)
& *solasi dan atau purifikasi obat baru
' Terapi kanker
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
63/70
Antibodi monoklonal dalam bidang onkologi:
&3
Toksin #ang biasa dikonjugasikan dengan antibodi monoklonal persiapan untuk
penggunaan klinik sebagai agen antikanker:
1 ri,in2 pokeeed
3 gelonin
4. Pseudomonasendotoksin
5. Diptheriatoksin
& abrin
' protein antiiral
ua tipe antibodi monoklonal #ang digunakan untuk terapi
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
64/70
ua tipe antibodi monoklonal #ang digunakan untuk terapi
kanker" adalah :
&. $aked mono'lonal antibodies
&$
$aked mono'lonal antibodies atau antibodi monoklonal murni
adalah antibodi yang penggunaanya tanpa dikombinasikan dengan obat lain atau
material radioakti. Antibodi murni mengikatkan diri mereka pada antigen
spesiik milik selsel kanker dengan berbagai 'ara. *isalnya+ memberi tanda
pada sel kanker agar bisa dikenali dan dirusak oleh sistem imun tubuh. !ara lain
dengan mengikatkan diri pada antigen tertentu yang disebut reseptor+ tempat di
mana molekulmolekul yang berungsi menstimulasi pertumbuhan sel kanker
juga akan mengikatkan diri.
,engan menghambat molekulmolekul pertumbuhan untuk tidak mengikatkan
diri+ maka antibodi monoklonal ini sama saja men'egah sel kanker untuk tumbuh
dengan 'epat. rastu-umab (er'eptin)+ yang merupakan *Ab murni dan
digunakan untuk kanker payudara stadium lanjut+ adalah 'ontoh antibodi
monoklonal yang bekerja dengan 'ara ini.
5eberapa !Abs murni #ang sudah disetujui -A
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
65/70
5eberapa !Abs murni #ang sudah disetujui -A
"itu/imab ("itu/an)08itu7imab digunakan untuk terapi sel 1 padanonodgkin lymphoma Agen ini merupakan antibodi monoklonal dengan
sasaran antigen !,23" #ang ditemukan pada sel 5rastu-umab (er'eptin)0Trastu;umab adalah antibodi #angmen#erang protein E"2 rotein ini terlihat dalam jumlah besar pada sel
sel beberapa kasus kanker payudara
Alemtu-umab (!ampath)0Alemtu;umab merupakan antibodi #ang
men#erang antigen !,42" #ang terlihat pada sel 5 maupun sel T Agen inidigunakan untuk terapi 1 'ell lympho'yti' leukemia(5699) kronik #ang
sudah mendapat kemoterapi
!etu/imab (Erbitu/)06etu7imab" antibodi dengan sasaran proteinE5F"(epidermal groth fa,tor re,eptors) 0-
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
66/70
j g
!onjugated mono'lonal antibodiesadalah antibodi
#ang dikombinasikan dengan berbagai jenis obat" toksin"dan materimateri radioaktif Antibodi monoklonal jenis
ini akan berkeliling ke seluruh bagian tubuh sampai ia
berhasil menemukan sel kanker #ang ,o,ok dengan
antigen #ang ia baa Agen ini kemudian akanmenghantarkan ra,un di tempat paling krusial" namun
hebatn#a" ia bisa meminimalkan dosis pada sel normal
untuk menghindari kerusakan di seluruh bagian tubuh
6onjugated !Abs kadang dikenal juga sebagai Jtagged"J
Jlabeled"J atau JloadedJ antibodies
&&
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
67/70
!Abs #ang dikombinasikan dengan obat
obat kemoterapi disebut 'hemolabeled
!Abs #ang dikombinasikan dengan
partikel radioaktif disebut radiolabeled+dan tipe terapi ini sering juga disebut
radioimmunotherap# (8*T)
!Abs #ang melekat dengan ra,un disebutimmunoto/ins
&'
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
68/70
!himeri'+ #angkah *aju erapi Abm
Hingga kini" keefektifan terapi !Ab masih terbatas mengingat fakta
baha antibodi diproduksi oleh selsel hibridoma men,it i aalterapi" antibodi ini seringkali bekerja baik Camun pada beberapa
kasus" sistem imun mulai mengenali antibodi men,it ini sebagai
Kbenda asingL setelah pemberian beberapa kali" dan mulai
merusakn#a saat KmusuhL ini masuk ke dalam tubuh
=arena alasan ini" ilmuan mengkombinasikan antibodi men,it#ang bertanggungjaab untuk mengenali antigen tumor spesifik
dengan bagian gen antibodi manusia Produk gabungan antara
gen antibodi manusia dan men'it ini disebut 7'himeri'8 atau
9humani-ed9 mono'lonal antibody.
"itu/imab ($aked 'himeri' mono'lonal antibody against !,23antigen) adalah antibodi monoklonal pertama #ang termasuk dalam
,himeri, mAb 6himera diambil dari nama sebuah hean mistis
8itu7imab dibuat dari fusi dua sel dari men,it dan manusia
&/
iagnosis pen#akit parasit dg antibodi
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
69/70
&
iagnosis pen#akit parasit dg antibodi
monoklonal
Se,ara rutin belum diaplikasikan
enelitian @ kepentingan ilmiah
5elum ban#ak diaplikasikan di lapangan
5ia#an#a mahal
enderita : sosial ekonomi rendah
= l bih tib di kl l
-
7/26/2019 NEW Produksi Abm
70/70
=elebihan antibodi monoklonal
Hasiln#a spesifik jika dibandingkan dg antibodi
poliklonal
!endiagnosis stadiumn#a: lara
!engetahui infeksi masih aktif perlu
pengobatan !endiagnosis stadium prepaten (aal)
!endiagnosis pen#akit asimtomatik" intensitas
infeksi rendah
!enentukan intensitas infeksi (> antigen
beredar)
!endiagnosis immunocompromised