Nama lengkap : Diana AuliaTempat dan tanggal lahir : Jakarta, 23 Mei 1954Pendidikan 1974 – 1979 : FK Universitas Indonesia, Jakarta1981 – 1984 : Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik FKUI1996 : Konsultan Hematologi Patologi Klinik2007 : Konsultan Nefrologi Patologi Klinik2008 : S-3 Ilmu Kedokteran FKUI, JakartaEmail : diana.aulia23@yahoo.com

Jabatan struktural1981 – sekarang : Staf Pengajar Dept. Patologi Klinik FKUI2002 – 2007; 2009 - 2019 : KaLab Hematologi Dept. Patologi Klinik RSCM2013 – 2019 : Kepala Divisi Nefrologi Dept. Patologi Klinik RSCM

Keanggotaan profesi1980-sekarang : Anggota Ikatan Dokter Indonesia(IDI)1991-sekarang : Anggota Perhimpunan Dokter Spesialis Patologi Klinik (PDS Pat-Klin)1996-sekarang : Anggota Perhimpunan Hematologi & Transfusi Darah Indonesia (PHTDI)2001-sekarang : Anggota Perhimpunan Onkologi Indonesia (POI)2002-sekarang : Anggota International Society of Haematology (ISH)2008-sekarang : Anggota International Society Laboratory Haematology (ISLH)

How to Monitor SARS-Cov-2 Molecular Assayed

DR. dr. Diana Aulia, Sp.PK (K)

Webinar Patelki ke XIIISabtu, 22 Agustus 2020

Departemen Patologi Klinik RSCM

PCR TESTING as a GOLD STANDARD….

Peran Penting Pemeriksaan RT PCR SARS-CoV-2

DIAGNOSISFOLLOW

UPEPIDEMIOLOGY

DASAR KEBIJAKAN

Kemenkes menetapkan bahwa

PCR adalah test Konfirmasi

Ketika pasien dinyatakan

sembuh, maka harus Swab 2x berturut dengan

hasil Negatif

Study Epidemiologi sebagai Dasar penyusunan

Kebijakan

Terjamin Mutunya

https://covid19.kemkes.go.id/protokol-covid-19/kmk-no-hk-01-07-menkes-413-2020-ttg-pedoman-pencegahan-dan-pengendalian-covid-19

Several Indications for SARS-CoV-2Diagnostic Testing• Surveillance - understanding diseaseepidemiology, monitoring impact• Clinical Case Management and Contact Tracing

- Discharge or release from isolation/quarantine• Prior infection/exposure and immunity• Prognosis - predicting who is likely to developsevere disease or who could benefit from Rx

Focus is primarily on humans but needs extend to animals and the environment

Proses Pemeriksaan PCR& Kesalahan

• Waktu Pengambilan tidak sesuai

• Teknik pengambilan• Alat Swab• VTM• Suhu dan Waktu

pengiriman• Kontaminasi saat

pengiriman

§ RNA Terdegradasi ( False Negatif )

§ Adanya Inhibitor ( False Negatif )

§ Kualitas Reagen§ Volume pemipetan tidak

sesuai§ Kontaminasi ( False

Positif )§ Kualitas PCR§ Alat belum terkalibrasi

§ Salah Pengetikan§ Salah interpretasi

Pra Analitik Pasca AnalitikAnalitik

PengambilanPengirimanPenyimpanan Spesimen

Proses EkstraksiMaster MixAmplifikasi

Interpretasi PencatatanPelaporan

KMK_No._HK.01.07-MENKES-413-2020_ttg_Pedoman_Pencegahan_dan_Pengendalian_COVID-19.pdf ( hal 75 )

Extraction

Automation

Manual

PCR( for LDTs)*Application :STD,RV, HPV

RT PCR → QPCR

Microarray

PCR

DNA

RNA

Sequencing

Real Time PCR

Patient Sample Sample PrepAssay setup Assay

ResultAnalysis

Molecular diagnostic workflow

Qiagen, March 2020

https://www.mlo-online.com/management/qa-qc/article/21146852/quality-control-for-sarscov2-testing

Pasca AnalitikAnalitikPra Analitik

§ SOP Handling Spesimen ( Jenis specimen, waktu specimen )

§ Lab Design§ Good Laboratory

Practice

SOP & Dokumentasi validasi dan Interpretasi Hasil

UPAYA PENCEGAHAN

Laboratory Design ExampleMitchell P. S. et al. Nucleic Acid Amplification Methods: Laboratory Design and Operations, 2004, In “Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice, edited by D. H. Persing et al” 99. 85-93.

Quality control for SARS-CoV-2 testing

PASKA-ANALITIK

ANALITIK

PRA - ANALITIK

PROSES LABORATORIUM

QUALITYASSURANCE

QUALITYCONTROL

UNTUK MEMASTIKAN BAHWA TEST YANG

DIKERJAKAN BERLANGSUNG DENGAN

TEPAT DAN TELITI

UNTUK MEMASTIKAN HASIL YANG

DIKELUARKAN OLEH LABORATORIUM BENAR

TEST YG BENAR, DIKERJAKAN PADA

SAMPEL YANG BENAR , HASIL DAN INTERPRETASI YG

BENAR DAN DIBERIKAN PADA

ORANG YANG BENAR PADA WAKTU

YG TEPAT

TUJUAN QC

q UNTUK MENDETEKSI ADANYA ERROR

q MONITORING SYSTEM DALAM KEGIATAN LABORATORIUM

q EVALUASI & MEMPERBAIKI KESALAHAN PADA SYSTEM

q DILAKUKAN SEBELUM MENJALANKAN SAMPEL PASIEN

• Methods Validation (LoD) – Assay manufacturers– Labs set up assays as new. – Labs change assays or add another assays.

• Lot to lot validation – Like core labs, when reagent lot is changed

• External run control– To use it every batch to verify result.

TUJUAN PENGGUNAAN QC PADA MOLECULAR SARS-CoV-2 TESTING

https://www.mlo-online.com/management/qa-qc/article/21146852/quality-control-for-sarscov2-testing

Situasi saat ini_Pemantapan Mutu SARS-CoV-2

PMI PME

Menggunakan TCM, dilakukan dgn

Mengirimkan sisa VTM dari :

§ 5 Spesimen Positif pertama

§ 10 Spesimen Negatif pertama dikirim ke

PusLitbangkes

Pra Analysis :SPO Pengumpulan, Pengelolaan spesimen, Penyimpanan reagen, K3, Pencatatan & Pelaporan

Internal Control :Internal Control (dari kit deteksi)

Pasca Analisis :Pencatatan, Pelaporan, Dokumentasi

KMK_No._HK.01.07-MENKES-413-2020_ttg_Pedoman_Pencegahan_dan_Pengendalian_COVID-19 ( hal 82-83 )

Utk pemeriksaan PCR : - 10 Spesimen Negatif- 20 Spesimen Positif

Dikirim keduanya ke Litbangkes Biomedis dan TekDasKes

Second Slide Master

Internal Control

Tipe Kontrol pada PCR

Positif Control Non Template Control

§ Sebagai acuan bahwa proses ekstraksi dan PCR berjalan Normal/ baik.

§ Kit Deteksi biasanya disertai Kontrol

§ Pada SARS Cov-2 bbrp protocol menggunakan gen RP utk menilai baik tidaknya proses sampling sekaligus sbg IC

§ Untuk memastikan bahwa proses mampu meng-Amplifikasi target secara akurat, Kons PC sebaiknya berkisar antara 10-100 kali detection limit

§ Menentukan Treshold

§ Utk mendeteksi bahwa reaksi PCR berjalan sesuai standard nya ( tdk ada kontaminasi pd Reagen PCR dan lingkungan kerja ) selama proses PCR,

§ NFW ( Nuclease Free Water )

Note : pada umumnya Internal Control & Positif Control bawaan kit deteksi hanya mengandung RNA, tidak mengandung gDNA

Negatif Control

§ Bahan yang berisi sample yang mengahsilkan hasil Negatife

§ Hanya mengandung RNA non infectious

1

Frekwensi & Jumlah KontrolSARS-Cov-2 Testing

q WHO merekomendasikan bahwa pengujian QC dilakukan dengan setiap proses dan telah mencatat bahwa, "setiap pengujian amplifikasi asam nukleat (NAAT) harus mencakup kontrol eksternal dan internal dan laboratorium didorong untuk berpartisipasi dalam kualitas eksternal. skema penilaian saat tersedia. ”

q Mikrobiologi College of American Pathologists (CAP) (MIC 65200)

untuk (QC Harian - Pengujian Berbasis Molekuler), “tes kuantitatif dan kualitatif berbasis molekuler, kontrol dijalankan setidaknya setiap hari, atau lebih sering jika ditentukan di instruksi pabrik, prosedur laboratorium, dan ketika terjadi perubahan yang dapat mempengaruhi hasil pasien. ”

5 OF 5 GENE TARGETS FOR COVID-19!!

As ISO 15189:2012(E) sub-clause 5.6.2.2 references,

“Use of independent third-party control materials should be considered, either instead of, or in addition to, any control materials supplied by the reagent or instrument manufacturer. The laboratory shall use quality control materials that react to the examining system in a manner as close as possible to patient samples.”5

According to CLSI-C24-A4,

“advantages for participating to an interlaboratory QC program are: Verifying that a laboratory is producing QC results that are consistent with other laboratories using the same measurement procedure, and thus demonstrating that the laboratory is using the measurement procedure correctly.”3

Yang harus diperhatikan dalam memilih Control SARS-Cov-2 :

q MengCover semua gen Target RNA Virus SARS-Cov-2q Terbuat dari RNA sintetis, karena jika berasal dari RNA virus yg dimatikan dapat berisiko q Mengandung gDNA q Bersifat Independent ( bukan bawaat kit deteksi )q Direkomendasikan oleh Regulasi

https://www.mlo-online.com/management/qa-qc/article/21146852/quality-control-for-sarscov2-testing

• For Research Use Only• This standard and negative are designed

for use on molecular diagnostic tests that detect SARS-CoV-2 nucleic acid

from human specimens. The products are not designed for use with either

antigen diagnostic tests or serological diagnostic tests.

• Molecular diagnostic tests

5 of 5 gene targets for COVID-19!!

The SARS CoV-2 Standard and SARS CoV-2 Negative contain genomic DNA allowing laboratories to validate the entire process of a molecular assay including extraction, amplification, and detection.

Misal : biasanya untuk Covid pengambilan sample dgn Swab

• Masukan swab kering ke dalam tabung mikro yang telah diisi 1 mL Lysis Buffer

• Vortex selama 1 menit• Spin Down• Inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit

§ Ambil RNA 200 uL untuk Deteksi

Dimulai dari sinilah pengambilan bahan

Standard nya

Teknik pengerjaan bahan SARS-CoV-2 Standard / Negative

200 µl 10 µl

300 µl60.000 copies

200.000 copies/ mL

Of each Gen Target

• Memberikan Grafik yang jelas pada hasil analysis• Hasil Standard/Positif -> CT value menunjukkan

kurva sesuai dengan Batasan dari kit yang dipakai ( tergantung dari kit deteksi )

• Hasil Negatif -> Flat / NO CT

QC dapat dikatakan masuk/baik, jika :

VALIDASI hasil RT PCR :

Tanggal PengambilanTanggal PemeriksaanJenis SpesimenKondisi Spesimen

CatatanPenerimaan Spesimen

Nilai CT dan Kurva Amplifikasi Kontrol PositifNilai CT harus masuk dlm Range

TargetHasil Negatif control : jika nilai

NC positif ? Nilai CT Internal Control ( IC) :

jika IC tdk keluar / diluar batas

Perhatikan Hasil

Kontrol

Adanya kontaminasi,Maka batch tsb dinyatakan invalid

Indikasi Adanya inhibitor dlm pengujian, perlu pengulangan.Kecuali : Gen Target Positif , tdk perlu ulang Perhatikan

Penggunaan Reagen

§ Apakah ada perubahan Lot / Batch§ Apakah pada Lot / Batch ini sudah di

control dgn Kontrol Eksternal ?

https://www.mlo-online.com/management/qa-qc/article/21146852/quality-control-for-sarscov2-testing

TAKE HOME MESSAGEq Pemeriksaan PCR SARS-CoV-2 saat ini menjadi tes Confirmatory,

Sehingga harus terjamin kualitas hasilnya

q SARS-CoV-2 merupakan virus yang baru , sehingga diperlukan sebuah

Quality Control yang memiliki latar belakang gDNA dan berkualitas

sehingga dapat benar memonitor proses pemeriksaan PCR , mulai

dari Ekstraksi-Amplifikasi dan deteksi

qQuality Control saat pandemic seperti ini tidak bisa diabaikan , justru

harus jadi perhatian dan dilakukan untuk sebuah ketepatan diagnosa

References:Laboratory testing for coronavirus disease 2019 (COVID-19) in suspected

h u m a n c a s e s . W o r l d H e a l t h Organization. WHO.int. https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/331329/WHO-COVID-19-laboratory-2020.4-eng.pdf. 2 March 2020. Accessed 1 June 2020.

M i c r o b i o l o g y C h e c k l i s t M I C 6 5 2 0 0 . C o l l e g e o f A m e r i c a n Pathologists. CAP.org. https://elss.cap.org/elss/ShowProperty?nodePath=/UCMCON/Contribution%20Folders/DctmContent/education/OnlineCourseContent/2017/LAP-TLTM/checklists/cl-mic.pdf. 21 August 2017. Accessed 1 June 2020.

Parvin, Curtis A. Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions, 4th Edition. CLSI. 2020; C24 A4.

Terimakasih…

#Staysafe#Stayhealthy#jagakualitashasil