0

MODUL

ANALISIS MIKROBIOLOGI

Yusi Nurmayasari, S.Si

KELAS XI KIMIA ANALISIS

SMK BINA PUTERA NUSANTARA

1

DAFTAR ISI

DEFINISI DAN SEJARAH MIKROBIOLOGI ........................................................................... 3

ANGGOTA DUNIA MIKROBA ............................................................................................. 7

BAB 1 MEDIA PERTUMBUHAN ..................................................................................... 13

BAB 2 STERILISASI ......................................................................................................... 21

BAB 3 ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME ................................................... 29

BAB 4 MORFOLOGI MIKROORGANISME ...................................................................... 36

BAB 5 PEMINDAHAN DAN PENGAWETAN MIKROORGANISME .................................. 58

BAB 6 PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME ... 68

BAB 7 MENENTUKAN JUMLAH DAN UKURAN MIKROORGANISME ............................ 80

BAB 8 UJI REAKSI ENZIMATIS ....................................................................................... 95

BAB 9 ANALISA MIKROBA DALAM AIR ....................................................................... 108

BAB 10 ANALISA MIKROBA DALAM MAKANAN ........................................................... 115

BAB 11 DAYA KERJA ANTI MIKROBA ............................................................................. 125

BAB 12 MONITORING KESTERILAN ............................................................................... 134

2

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah swt., karena atas ridha dan

hidayahNya penulisan modul Analisis Mikrobiologi untuk SMK Bina Putera

Nusantara ini dapat terselesaikan dengan baik. Tidak lupa kami ucapkan terima kasih

kepada semua pihak yang telah membantu terlaksananya penulisan modul hingga

dapat digunakan sebagai bahan ajar di jurusan Kimia Analisis SMK Bina Putera

Nusantara Tasikmalaya.

Modul ini kami susun dengan harapan dapat membantu siswa untuk

memahami materi dasar mikrobiologi dan menguasai cara-cara untuk melaksanakan

anlisis dalam mikrobiologi. Penyajian materi modul ini disesuaikan dengan silabus

pembelajaran sebagaimana tertuang dalam kurikulum SMK Bina Putera Nusantara.

Semoga modul ini dapat memberi motivasi baru kepada peserta didik untuk

belajar dengan lebih baik. Penulis menyadari bahwa penulisan modul ini masih jauh

dari sempurna. Oleh karena itu kami mengharapkan kritik dan saran yang sifatnya

membangun demi perbaikan modul ini di masa yang akan datang.

Tasikmalaya, Agustus 2010

Penyusun

3

Mikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang

mempelajari organisme yang terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan jelas

menggunakan mata telanjang; kajian ini mencakup bakteri, archaea, protozoa, algae

mikroskopik, dan fungi. Beberapa mikroba (seperti algae dan jamur) cukup besar

untuk dapat dilihat dengan mata telanjang, namun kedua organisme masih

dimasukkan dalam kajian mikrobiologi, hal ini karena teknik yang digunakan untuk

mengkajinya (seperti isolasi, sterilisasi, kultivasi dalam media artifisial) sama seperti

anggota mikroorganisme lainnya. Virus sering juga dimasukkan walaupun

sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup.

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari mikroba. Mikrobiologi adalah

salah satu cabang ilmu dari biologi, dan memerlukan ilmu pendukung kimia, fisika,

dan biokimia. Mikrobiologi sering disebut ilmu praktek dari biokimia. Dalam

mikrobiologi dasar diberikan pengertian dasar tentang sejarah penemuan mikroba,

macam-macam mikroba di alam, struktur sel mikroba dan fungsinya, metabolisme

mikroba secara umum, pertumbuhan mikroba dan faktor lingkungan, mikrobiologi

terapan di bidang lingkungan dan pertanian. Mikrobiologi lanjut telah berkembang

menjadi bermacammacam ilmu yaitu virologi, bakteriologi, mikologi, mikrobiologi

pangan, mikrobiologi tanah, mikrobiologi industri, dan sebagainya yang mempelajari

mikroba spesifik secara lebih rinci atau menurut kemanfaatannya.

Whittaker membagi jasad hidup menjadi tiga tingkat perkembangan, yaitu:

(1)Jasad prokariotik yaitu bakteri dan ganggang biru (Divisio Monera), (2) Jasad

eukariotikuniseluler yaitu algae sel tunggal, khamir dan protozoa (Divisio Protista),

dan (3) Jasadeukariotik multiseluler dan multinukleat yaitu Divisio Fungi, Divisio

Plantae, dan DivisioAnimalia. Sedangkan Woese menggolongkan jasad hidup

Definisi & Sejarah Mikrobiologi

4

terutama berdasarkansusunan kimia makromolekul yang terdapat di dalam sel.

Pembagiannya yaitu terdiri Arkhaebacteria, Eukaryota (Protozoa, Fungi, Tumbuhan

dan Binatang), dan Eubacteria.

Ciri Umum Mikroba

Mikroba di alam secara umum berperanan sebagai produsen, konsumen, maupun redusen. Jasad produsen menghasilkan bahan organik dari bahan anorganik dengan energi sinar matahari. Mikroba yang berperanan sebagai produsen adalah algae dan bakteri fotosintetik. Jasad konsumen menggunakan bahan organik yang dihasilkan oleh produsen. Contoh mikroba konsumen adalah protozoa. Jasad redusen menguraikan bahan organik dan sisa-sisa jasad hidup yang mati menjadi unsur-unsur kimia (mineralisasi bahan organik), sehingga di alam terjadi siklus unsur-unsur kimia. Contoh mikroba redusen adalah bakteri dan jamur (fungi).

Sel mikroba yang ukurannya sangat kecil ini merupakan satuan struktur biologi. Banyak mikroba yang terdiri dari satu sel saja (uniseluler), sehingga semua tugas kehidupannya dibebankan pada sel itu. Mikroba ada yang mempunyai banyak sel (multiseluler). Pada jasad multiseluler umumnya sudah terdapat pembagian tugas diantara sel atau kelompok selnya, walaupun organisasi selnya belum sempurna.

Setelah ditemukan mikroskop elektron, dapat dilihat struktur halus di dalam sel hidup, sehingga diketahui menurut perkembangan selnya terdapat dua tipe jasad, yaitu:

1. Prokariota (jasad prokariotik/ primitif), yaitu jasad yang perkembangan selnya belum sempurna.

2. Eukariota (jasad eukariotik), yaitu jasad yang perkembangan selnya telah sempurna.

Selain yang bersifat seluler, ada mikroba yang bersifat nonseluler, yaitu virus. Virus adalah jasad hidup yang bersifat parasit obligat, berukuran super kecil atau submikroskopik. Virus hanya dapat dilihat dengan mikroskop elektron. Struktur virus terutama terdiri dari bahan genetik. Virus bukan berbentuk sel dan tidak dapat membentuk energi sendiri serta tidak dapat berbiak tanpa menggunakan jasad hidup lain.

Sejarah Mikrobiologi 1626-1697 Francesco Redi, membantah konsep generasi spontan dengan menunjukkan

bahwa belatung pada daging busuk berasal dari telur lalat yang meletakkan

telur pada daging tersebut, bukan dari daging itu sendiri

1713-1781 John Needham, mendukung teori generasi spontan dengan menunjukkan

bahwa kaldu yang dipanaskan dalam labu dan kemudian ditutup masih

dapat memunculkan mikroorganisme.

5

1729-1799 Lazzaro Spallanzani, menunjukkan bahwa labu yang ditutup dan kemudian

dididihkan tidak ada mikroorganisme yang tumbuh, dan menyatakan bahwa

udara yang masuk ke labu medium membawa benih, dan udara mungkin

diperlukan untuk mendukung pertumbuhan organisme yang sudah ada di

medium.

1822-1895 Louis Pasteur, menjebak organisme yang terbawa udara dalam kapas, dia

juga memanaskan leher labu angsa, mensteril meida, membiarkan labu

terbuka; hasil percobaan menunjukkan tidak ada pertumbuhan organisme

sebab partikel debu yang membawa organisme tidak mencapai medium;

namun debu terjebak dalam leher labu; jika leher labu dipecah, debu akan

mencapai medium dan organisme akan tumbuh; dengan cara ini, Pasteur

telah mematahkan teori generasi spontan

1820-1893 John Tyndall, menunjukkan bahwa debu membawa mikroba dan jika debu

tidak ada, medium tetap steril, bahkan jika medium terkena udara. Tydall

juga memberikan bukti keberadaan bakteri yang resisten panas.

1773-1856 Agostino Bassi , menunjukkan bahwa penyakit ulat sutra disebabkan jamur

1845 M. J. Berkeley, menunjukkan bahwa penyakit kentang (the Great Potato

Blight) Irlandian disebabkan oleh jamur

1822-1895 Louis Pasteur, menunjukkan bahwa penyakit (pine) ulat sutra disebabkan

oleh parasit protozoa

1872-1912 Joseph Lister, menunjukkan suatu sistem pembedahan yang dirancang

untuk mencegah mikroorganisme menginfeksi luka bedah, sehingga pasien

jauh lebih sedikit yang terinfeksi pascaoperasi; Lister memberikan bukti

tidak langsung bahwa mikroorganisme adalah agen penyebab penyakit

manusia

1843-1910 Robert Koch, yang menggunakan kritetia yang dikembangkan oleh

gurunya, Jacob Henle (1809-1895), dapat menjelaskan hubungan

antara Bacillus anthracis and anthrax; kriterianya dikenal sebagai postulat

Koch dan masih digunakan untuk menjelaskan hubungan antara

mikroorganisme tertentu dengan penyakit tertentu.

Robert Koch dan kawan-kawan mengembangkan teknik, reagen, dan

materi lain untuk mengkultur patogen bakteri pada media padat

pertumbuhan, dengan demikian mikrobiologis dapat mengisolasi mikroba

untuk mendapatkan kultur murni (tunggal).

Postulat Koch:

o Mikroorganisme harus ada di setiap kasus penyakit tetapi tidak ada pada

individu sehat.

o Mikroorganisme yang dicurigai (suspected) harus dapat diisolasi dan

ditumbuhkan dalam kultur murni.

o Penyakit yang sama harus timbul jika mikroorganisme hasil isolasi

diinokulasi tersebut pada individu sehat.

o Mikroorganisme yang sama harus ditemukan lagi dari individu yang sakit

tersebut

6

1851-1908 Charles Chamberland, membuat filter (saringan) bakteri untuk menapis

bakteri dan mikroba yang lebih besar dari spesimen; melalui teknik ini juga

memungkinkan ditemukannya virus sebagai agen penyebab penyakit.

1798 Edward Jenner , menggunakan prosedur vaksinasi untuk melindungi

individu dari penyakit cacar (smallpox)

1822-1895 Louis Pasteur, mengembangkan vaksin lain untuk penyakit kolera ayam,

antraks, dan rabies

1854-1917 Emil von Behring dan Shibasaburo Kitasato (1852-1931), menginduksi

pembentuk antitoksin toksin diptera pada kelinci; antitoksin digunakan

secara efektif untuk mengobati manusia dan memberikan bukti imunitas

humoral

1845-1916 Elie Metchnikoff, menunjukkan keberadaan sel fagositik dalam darah, yang

menunjukkan imunitas dimediasi sel

1856-1953 Sergei Winogradsky, yang bekerja dengan bakteri tanah menemukan

bahwa bakteri tanah dapat oksidasi besi, belerang, dan amonia untuk

mendapatkan energi; Winogradsky juga mengkaji fiksasi nitrogen anaerobik

dan dekomposisi selulosa

1851-1931 Martinus Beijerinck, mengisolasi bakteri pengikat nitrogen aerobik, suatu

bakteri bintil akar yang mampu menambat nitrogen, and bakteri pereduksi

sulfat. Beijerinck and Winogradsky memperkenalkan pertama kali

penggunaan kultur yang diperkaya dan media selektif.

7

Bakteri Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas

dibandingkan mahluk hidup yang lain . Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang

hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim.

Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki

ciri-ciri yang membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah

organisme uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan

berukuran renik (mikroskopis).

Ciri-ciri Bakteri:

1. Organisme uniselluler

2. Prokariot (tidak memiliki membran inti sel )

3. Umumnya tidak memiliki klorofil

4. Memiliki ukuran tubuh yang bervariasi antara 0,12 s/d ratusan mikron umumnya

memiliki ukuran rata-rata 1 s/d 5 mikron.

5. Memiliki bentuk tubuh yang beraneka ragam

6. Hidup bebas atau parasit

7. Yang hidup di lingkungan ekstrim seperti pada mata air panas,kawah atau gambut

dinding selnya tidak mengandung peptidoglikan

8. Yang hidupnya kosmopolit diberbagai lingkungan dinding selnya mengandung

peptidoglikan

Bentuk Bakteri

Bentuk dasar bakteri terdiri atas bentuk bulat (kokus), batang (basil),dan spiral

(spirilia) serta terdapat bentuk antara kokus dan basil yang disebut kokobasil.

Berbagai macam bentuk bakteri :

1. Bakteri Kokus :

Anggota Dunia Mikroba

8

a. Monokokus/ mikrokokus, yaitu berupa sel bakteri kokus tunggal

b. Diplokokus, yaitu dua sel bakteri kokus berdempetan

c. Tetrakokus yaitu empat sel bakteri kokus berdempetan berbentuk segi

empat sebagai hasil pembelahan sel ke dua arah.

d. Sarkina/ sarsina yaitu delapan sel bakteri kokus berdempetan

membentuk kubus hasil pembelahan sel ke tiga arah

e. Streptokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan

membentuk rantai sebagai hasil pembelahan sel ke satu atau dua arah

dalam satu garis.

f. Stafilokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan

seperti buah anggur

2. Bakteri Basil :

9

a. Monobasilus, yaitu berupa sel bakteri basil/ batang tunggal

b. Diplobasilus, yaitu berupa dua sel bakteri basil/ batang berdempetan

c. Streptobasilus, yaitu beberapa sel bakteri basil berdempetan membentuk

rantai

3. Bakteri Spirilia atau lengkung:

a. Spiral/ spirillium yaitu bentuk sel bergelombang, spiralnya tebal dan kaku

b. Spiroseta / spirochaeta yaitu bentuk sel seperti sekrup, spiralnya halus dan

lentur

c. Vibrio yaitu bentuk sel seperti tanda baca koma

Archaea Archaea atau arkea dikenal juga sebagai arkeabakteria, merupakan

organisme uniseluler yang tidak mempunyai nucleus (inti selnya tidak memiliki

membran inti) sehingga digolongkan sebagai prokariot.

Dulu arkea digolongkan sebagai kelompok bakteri yang tidak biasa dan

dinamakan arkeabakteria, tapi karena ternyata arkea mempunyai system biokimiawi

yang berbeda dengan bakteri, maka arkea diklasifikasikan sebagai domain yang

berbeda.

Arkea dan bakteri mempunyai kesamaan dalam hal ukuran dan bentuk,

walaupun beberapa jenis arkea mempunyai bentuk yang sangat tidak biasa, seperti

bentuk rata dan kotak (seperti Haloquadra walsbyi.). arkea bereproduksi secara

aseksual dan melakukan pembelahan biner, fragmentasi atau pertunasan (budding),

tapi berbeda dengan bakteri dan eukariot lain, arkea tidak membentuk spora

10

Awalnya arkea ditemukan di lingkungan yang ekstrem, seperti di sumber air

panas dan danau air asin, tapi sekarang sudah banyak dijumpai di berbagai habitat

seperti lumpur, laut dan rawa-rawa. Belum ditemukan adanya arkea yang bersifat

pathogen atau parasite, biasanya arkea bersimbiosis secara mutualisme atau

komensalisme dengan organisme lain.

Protozoa

Istilah protozoa berasal dari bahasa Yunani, yaitu protos artinya pertama dan

zoon artinya hewan. Jadi,Protozoa adalah hewan pertama. Protozoa merupakan

kelompok lain protista eukariotik. Kadang-kadang antara algae dan protozoa kurang

jelas perbedaannya. Kebanyakan Protozoa hanya dapat dilihat di bawah mikroskop.

Beberapa organisme mempunyai sifat antara algae dan protozoa.

Protozoa dibedakan dari prokariot karena ukurannya yang lebih besar, dan

selnya eukariotik. Protozoa dibedakan dari algae karena tidak berklorofil, dibedakan

dari jamur karena dapat bergerak aktif dan tidak berdinding sel, serta dibedakan

dari jamur lendir karena tidak dapat membentuk badan buah.

Kelas Utama Protozoa:

Kelompok

Utama (Nama

Utama)

Cara Gerak

Cara

Berkembang

Biak

Ciri-ciri Lain

Mastighophora

(Flagelata)

Flagela (satu atau

lebih)

Pembelahan biner

membujur, pada

beberapa

kelompok ada

reproduksi seksual

Nutrisinya

fototropik,

heterotropik atau

keduanya

Sarcodina

(Amoeba) Pseudopodia

Pembelahan biner,

tak ada reproduksi

seksual

Kebanyakan

spesies hidup

bebas,

heterotropik

Ciliata (siliata) Silia (banyak)

Pembelahan biner

melintang,

reproduksi seksual

dengan konjugasi

Kebanyakan

spesies hidup

bebas,

heterotropik

11

Sporozoa

(sporozoa)

Gerak dengan

meluncur atau

tidak bergerak

Pembelahan

bahurangkap,

mungkin ada mikro

gamet berflagela

pada reproduksi

seksual

Semua spesies

parasit

Algae Mikroskopik

Algae adalah organisme eukariotik fotosintetik aerobic. Ukuran algae sangat

beragam, dari beberapa micrometer hingga beberapa meter. Organisme ini

mengandung klorofil serta pigmen-pigmen lain untuk melangsungkan

fotosintesis. Kebanyakan algae berukuran mikroskopis atau disebut sebagai

algae mikroskopis. Dan ilmu yang mempelajarinya disebut fikologi.

Algae biasanya terdapat sebagai sel tunggal yang berbentuk bola, batang,

gada atau kumparan. Ada yang dapat bergerak (dengan flagella) dan ada yang

tidak, bereproduksi secara asekaual dan seksual. Untuk yang berukuran makro,

ada yang multiseluler.

Di dunia mikrobia, algae termasuk eukariotik, umumnya bersifat fotosintetik dengan pigmen fotosintetik hijau (klorofil), coklat (fikosantin), biru kehijauan (fikobilin), dan merah (fikoeritrin). Morfologi algae ada yang berbentuk uniseluler, ada pula yang multiseluler tetapi belum ada pembagian tugas pada sel-sel komponennya. Algae dibedakan dari tumbuhan hanya karena hal tersebut.

Khamir

Pada umumnya, sel khamir lebih besar daripada kebanyakan bakteri, tapi

khamir yang paling kecil tidak sebesar bakteri paling besar. Ukurannya berkisar

antara 1-5 mikron (lebar) dan 5-30 mikron (panjang). Biasanya berbentuk bulat

telur tapi beberapa ada yang memanjang atau berbentuk bola. Khamir tidak

dilengkapi flagella atau alat gerak lainnya.

Pada dasarnya, tubuhnya hanya terdiri dari dua bagian, yaitu

miselium dan spora (sel resisten, istirahat atau dorman). Miselium merupakan

kumpulan beberapa filament yan g dinamakan hifa. Setiap hifa lebarnya 5-10

mikron (sel bakteri biasanya berdiameter 1 mikron). Ada tiga macam morfologi

hifa, yaitu aseptat, septat uninukleat dan septat multinukleat.

12

Khamir atau disebut yeast, merupakan jamur bersel satu yang mikroskopik,tidak berflagela. Beberapa genera membentuk filamen (pseudomiselium). Carahidupnya sebagai saprofit dan parasit. Hidup di dalam tanah atau debu di udara, tanah,daun-daun, nektar bunga, permukaan buah-buahan, di tubuh serangga, dan cairan yangmengandung gula seperti sirup, madu dan lain-lain.Khamir berbentuk bulat (speroid), elips, batang atau silindris, seperti buahjeruk, sosis, dan lain-lain. Bentuknya yang tetap dapat digunakan untuk identifikasi.Khamir dapat dimasukkan ke dalam klas Ascomycetes, Basidiomycetes danDeuteromycetes.

Gambar sel Khamir:

13

Pengertian dan Fungsi

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari

campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk

pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-

molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media

pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga

memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.

Bahan-bahan media pertumbuhan

1. Bahan dasar

air (H2O) sebagai pelarut

agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit

didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 oC.

gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer

asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih

banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.

Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga

sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan

media bagi mikroorganisme autotrof obligat.

2. Nutrisi atau zat makanan

Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel

yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan

unsur pelikan/trace element.

Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik

atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan

sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam

organik.

Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen

lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti

urea.

Vitamin-vitamin.

Bab 1 Media Pertumbuhan

14

3. Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan

tujuan tertentu, misalnya phenolred (indikator asam basa) ditambahkan untuk

indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme.

Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba non-

target/kontaminan.

4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media

Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan

terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai

pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse

untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan

larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan

pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan

kekuatan agar, terutama pada pH yang asam

Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti

otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.

Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara

memperolehnya.

Meatextract. Meatextract mengandung basa organik terbuat dari otak,

limpa, plasenta dan daging sapi.

Yeastextract. Yeastextract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat

alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B

complex).

Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan

asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya

digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.

Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.

Macam-Macam Media Pertumbuhan

1. Medium berdasarkan sifat fisik

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah

dingin media menjadi padat.

Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%

sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi

solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke

seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika

tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB

15

(NitrogenfreeBromthymolBlue) semisolid akan membentuk cincin hijau

kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini

dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk

mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media NitrateBroth,

kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi

bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB

(NutrientBroth), LB (LactoseBroth).

2. Medium berdasarkan komposisi

Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan

takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui

secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar,

dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak

dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak

dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan

dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic

Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan

Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan

mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu

sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan

merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria

Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten

antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth

yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang

toleran terhadap garam.

Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk

pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,

serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba

tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya

membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi

16

membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar,

Serum Agar, dll.

Media untuk peremajaan kultur

Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur

Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme

suatu mikroba. Contohnya adalah Kosers Citratemedium, yang digunakan

untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber

karbon.

Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu

mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya

perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine

Agar.

Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya

berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya

TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria

berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di

sekeliling koloni.

Ciri-ciri beberapa bahan kompleks yang digunakan sebagai bahan pembuat media:

Bahan Mentah Ciri Nilai Nutrisi

Ekstrak daging sapi (beef extract)

Suatau ekstrak cair jaringan daging sapi yang empuk, dikonsentrasikan menjadi pasta

Mengandung karbohidrat, senyawa nitrogen organic, vitamin yang larut dalam air dan berbagai garam

Pepton

Produk yang dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein seperti daging, kasein, dan gelatin

Sumber utama nitrogen organic, dapat pula mengandung vitamin dan kadang-kadang karbohidrat, bergantung pada jenis bahan awal.

Agar

Suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari algae marin tertentu (agar laut), diolah untuk membuang substansi yang tidak dikehendaki

Digunakan sebagai bahan pemadat media, bukan sumber nutrient bagi bakteri

Ekstrak khamir (yeast extract)

Suatu ekstrak cair sel khamir, tersedia juga

Suatu sumber yang sangat kaya dengan vitamin B,

17

dalam bentuk bubuk (komersial)

mengandung nitrogen organic dan senyawa-senyawa karbon

Pembuatan Nutrient Agar

1.Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk

volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:

Beefextract 3 g

Peptone 5 g

Agar 15 g

Akuades s.d 1000 ml

2. Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian

untuk melarutkan Beefextract dan peptone dan sebagian lagi

untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar

lebih banyak

3. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan

diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai

overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah).

4.Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef

extract, cukup dengan pengadukan.

18

5. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai

homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator. Jika

pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH.

6. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan

autoklaf.

7. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media tegak

atau miring pada point ke 5, media langsung dituang ke tabung kemudian

disterilisasi.

Pembuatan Nutrient Broth

Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai

pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tinggal melarutkan peptone

dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi

dan siap disterilisasi. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas, peptone dan

beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk

Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)

1. Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk

volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:

Potato/kentang 3 g

Peptone 5 g

Agar 15 g

Akuades s.d 1000 ml

(sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)

2. Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak,

kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya

menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beakerglass baru.

3. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah

larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi.

4. Setelah semua larut, ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan

dihomogenkan. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.

19

5. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap

untuk disterilisasi.

2. 3. 4.

20

Pengertian

Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan.

Macam-macam sterilisasi

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

Pemanasan

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.

Bab 2 Sterilisasi

21

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.

Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :

Non-disposable filtration apparatus

- Disedot dengan pompa vakum

- Volume 20-1000 ml

Disposable filter cup unit

- Disedot dengan pompa vakum

- Volume 15-1000 ml

Disposable filtration unit dengan botol penyimpan

- Disedot dengan pompa vakum

- Volume 15-1000 ml

Syringe filters

- Ditekan seperti jarum suntik

- Volume 1-20 ml

Spin filters

- Ditekan dengan gaya setrifugasi

- Volume kurang dari 1 ml

22

Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus

Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland Zeitz), membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.

Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan.

Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.

setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer, maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.

Tyndalisasi

Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.

Cara kerja :

Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil.

Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).

Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba).

Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.

Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.

Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas.

23

Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.

Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet atau Laminar Air Flow

Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter.

BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar flowhood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain.

Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.

TEKNIK KERJA ASEPTIS (TANPA KONTAMINASI)

Tehnik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga

sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi

terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan.

Dasar digunakannya tehnik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang

mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam

cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak

diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan.

24

Mikroorganisme dapat juga jatuh dari tangan operator, sarung tangan atau jas

laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan tehnik aseptik

meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya

tehnik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan. Namun

semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang

ditimbulkan.

Tehnik aseptis digunakan pada saat :

- Teknik aseptis seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dan

dengan segala media pertumbuhannya.

- Teknik aseptis sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak

berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun

buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen.

- Teknik aseptis disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang

berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri

sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting.

Beberapa contoh :

- Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh

tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil

yang didapatkan.

- Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi.

Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak

terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri.

- Membuka dan merehidrasi bakteri terliofolisasi. Teknik aseptis dapat menjaga sel yang

terrehidrasi dari bakteri kontaminan dan menjaga tidak keluarnya sel ke meja kerja.

- Melakukan reaksi restriksi atau PCR. Walaupun enzim restriksi pada umumnya disimpan

dalam gliserol 50% (bakteriostatik) tapi enzim yang diencerkan akan lebih rentan rusak

akibat aktivitas mikroorganisme atau dihambat oleh ion atau unsur tertentu. Kontaminasi

DNA asing yang masuk ke dalam tube PCR mungkin dapat teramplifikasi sehingga hasil yang

didapat membingungkan.

- Melabeli sel dengan (32P) fosfat. Pada kasus ini kerja aseptis ditujukan untuk melindungi

operator dari bahan kimia berbahaya. Jika menggunakan teknik aseptis maka Anda tidak

akan membiarkan tutup bahan radioaktif terbuka atau secara tidak sengaja menggunakan

pipet bekas bahan radioaktif.

Aturan umum tehnik aseptis:

- Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya

tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh

dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety dapat menjaga dan mengatur aliran

udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi.

- Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan.

Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit

dibersihkan pada sudut-sudut ruang.

- Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di

25

sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya.

Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya

meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.

- Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua

peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah

disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan.

Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll.)diperiksa

terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek.

- Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan

tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler,

pipet dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri,

erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang

lapang untuk bekerja.

- Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang

menempel.

- Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat

untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan

meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang

diperlukan beserta cadangannya.

- Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi

dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan

dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya.

- Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun

bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan.

Saran-saran tehnik aseptis:

- Minimalisasi gerak : pergerakan tangan dapat menciptakan aliran udara . semakin cepat

pergerakannya semakin cepat aliran udara yang ditimbulkan. Pergerakan lengan sebaiknya

dilakukan seperlu mungin dan bergerak secara lembut.

- Minimalisasi jarak: jarak antar peralatan diatur seefektif dan seefisien mungkn. Antar

peralatan jangan diletakkan terlalu jauh.

- Minimalisasi keterpaparan : semakin sering menggerakkan sesuatu (mis: cawan berisi

media) melewati udara maka semakin besar partikel udara untuk masuk. Semakin lama

tutup erlenmeyer terbuka juga semakin besar terkontaminasi.

Catatan penting dalam kerja aspetis :

- Tutup erlenmeyer, botol atau cawan sebaiknya dibuka kira-kira 450. tujuannya untuk

meminimalisasi udara masuk namun masih dapat mentransfer sesuatu.

- Jika diharuskan untuk membuka penuh dan tutup diletakkan di meja kerja, maka tutup

dapat diletakkan tertelungkup atau terlentang (muka menghadap ke atas). Jika tertelungkup

pastikan permukaannya bersih dan bila terlentang pastikan juga tidak ada gerakan di

atasnya.

- Untuk menghindari bakteri yang menempel pada jarum inokulum terpental/terciprat maka

diameter loops harus berkisar 2-3 mm dan untuk memperkecil getaran panjang kawat tidak

26

lebih dari 6cm.

- Tidak boleh menyedot cairan pada saat pippeting dengan mulut.

- Untuk menghindari penyebaran mikroba dari tetesan pipet yang terjatuh maka dapat

digunakan kain steril yang diberi desinfektan sebagai alas. Kain ini setelah selesai dibuang

sebagai limbah berbahaya.

UJI STERILITAS

Uji sterilitas dilakukan untuk mengetahui apakah bahan atau sediaan yang harus steril

sudah memenuhi syarat atau tidak. Uji sterilitas dilakukan secara mikrobiologi dengan

menggunakan medium pertumbuhan tertentu. Media untuk pengujian diperlukan dalam

uji ini. Beberapa media yang dapat digunakan dalam pengujian ini adalah :

1. Media Tioglikolat Cair

Komposisi :

L-sistin P 0,5 g

NaCl P 2,5 g

Glukosa P 5,5 g

Agar P Granul 0,75 g

Ekstrak ragi P 5,0 g

Digesti pancreas kasein P 15,0 g

Natrium tioglikolat atau P 0,5 g

Asam tioglikolat P 0,3 ml

Larutan natrium resazurin P 1,0 ml

Air 1000 ml

pH setelah sterilisasi 7,1 0,2

Campur dan panaskan hingga larut. Atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 0,2

menggunakan NaOH 1 N. jika perlu saring selagi panas menggunakan kertas saring.

Tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang memberikan perbandingan

permukaan dengan kedalaman media sedemikian rupa sehingga tidak lebih dari

setengah bagian atas media yang mengalami perubahan warna sebagai indikasi

masuknya oksigen pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi dalam autoklaf. Jika lebih dari

sepertiga bagian atas terjadi perubahan warna merah muda, media dapat diperbaiki

satu kali dengan pemanasan di atas tangas air atau dalam uap yang mengalir bebas

hingga warna merah muda hilang. Media siap digunakan jika tidak lebih dari

sepersepuluh bagian atas media berwarna merah muda.

2. Media Tioglikolat Alternatif

Komposisi :

L-sistin P 0,5 g

NaCl P 2,5 g

Glukosa P 5,5 g

Ekstrak ragi P 5,0 g

Digesti pancreas kasein P 15,0 g

Natrium tioglikolat atau P 0,5 ml

Asam tioglikolat P 0,3 ml

Air 1000 ml

pH setelah sterilisasi 7,1 0,2

Soybean-Casein Digest Medium

27

Komposisi :

Digesti pancreas kasein P 17 ,0 g

Digesti papaik tepung kedele 3,0 g

NaCl P 5,0 g

Kalium fosfat dibasa P 2,5 g

Glukosa P 2,5 g

Air 1000 ml

pH setelah sterilisasi 7,3 0,2

Tabel Jumlah Untuk Bahan Cair

Isi Wadah (ml)

Volume

minimum

(ml)

Vol. minimum untuk media Jumlah Wadah

Permedia Untuk inokulasi

langsung Untuk membran

< 1 < 10

10 50

50

28

ultraviolet atau pemaparan non lethal terhadap panas, tidak adanya stimulasi yang

seringkali perlu untuk membuat spora bervegetasi, dan kontak sebelumnya dengan

suatu zat bakteriostatik adalah beberapa efek yang biasa mengganggu pertumbuhan

organisme tersebut. Dalam hal seperti itu akan diperoleh hasil negative palsu.

Prosedur sterilisasi merupakan tahap penting dalam mencapai produk steril, namun

semua prosedur dan kondisi-kondisi lain yang dibutuhkan untuk pembuatan produk

tersebut harus dirancang untuk membantu tahap ini. Pembersihan ruangan yang baik,

lingkungan yang terkontrol dengan efektif, suatu muatan dari produk yang dapat

dikontrol dan diidentifikasi, proses produksi yang direncanakan dan dikontrol dengan

baik, serta personel yang ditatar dengan baik dan berdedikasi tinggi untuk produksi

dan pengujian sangat penting untuk produksi suatu produk steril. Hanya bila semua

factor ini melengkapi penemuan-penemuan dari uji sterilisasi, dapatlah disimpulkan

dengan penuh kepercayaan bahwa produk tersebut steril.

29

Pengertian

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari

campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat

diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari

morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Teknik Pengambilan Sampel

Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut

merupakan prosedur pengambilan sampel.

1. Sampel tanah

Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka

cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang

diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar

perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran..

2. Sampel air

Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika

beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan

bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang

tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air

keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran

dibakar.

Bab 3 Isolasi & Inokulasi Mikroorganisme

30

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)

1. Teknik Preparasi Suspensi

Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan

dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari

substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam

preparsi bergantung kepada bentuk sampel :

a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel

yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan

atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu,

batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar

sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan

permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu

ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.

b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel

pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun

bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke

dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun

diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang

terdapat dalam beakerglass.

c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat

ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada

dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam

air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar

berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk

sampel dari tanh tak perlu dimaserasi

2. Teknik Pengenceran Bertingkat

31

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah

mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat

pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.

Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan

selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel

mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.

Cara Kerja :

a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran

pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan

berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang

digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1.

Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang

benar dapat dilihat pada gambar disamping)

b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung

10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak

tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran

terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang

digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet

ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika

memindahkan cairan dari sumber yang sama.

3. Teknik Penanaman

a. Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan

suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan

isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran

terakhir.

a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di

permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat

dilakukan adalah sebagai berikut :

32

Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian

teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.

Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan

dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu

beberapa detik.

Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar

supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan

ikut diputar.

Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat

menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama

suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan

memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan

agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang

tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang

tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang

dilakukan adalah sebagai berikut :

Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media

padat yang masih cair (>45oC)

Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong

Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk

menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.

33

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk

pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja,

sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya

sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan

kultur ke dalam medium baru.

b.1 Goresan Sinambung

Cara kerja :

Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai

setengah permukaan agar.

Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.

Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal,

melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

b.2 Goresan T

Cara kerja :

Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker

Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag

Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-

zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh

goresan yang sempurna

Lakukan hal yang sama pada daerah 3

34

B.3 Goresan Kuadran (Streakquadrant)

Cara kerja :

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi

empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel

mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan

pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi

koloni tunggal.

Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :

1. Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara

aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8

2. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate

pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam

3. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni

yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali

4. Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru

dengan teknik streak kuadran

5. Inkubasi 1x24 jam.

35

Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :

1. Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30

menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan

2. Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung

pengenceran bertingkat

3. Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke

media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian

diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari

4. Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,

5. Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

Biakan Penyuburan:

Digunakan untuk meningkatkan peluang terisolasinya suatu organisme yang

mempunyai beberapa ciri fisiologi atau biokimiawi yang unik. Langkahnya adalah

sebagai berikut:

Lakukan pemindahan biakan secara berturut-turut (5-6 kali) dalam medium

berisikan nutrient yang dikehendaki

Tanam pada media agar yang berisi nutrient yang sama lalu isolasi koloninya.

36

Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantu. Mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik . Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler) maupun bersel banyak (multiseluler) . Namun, beberapa protista bersel tunggal masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies multisel tidak terlihat mata telanjang. Virus juga termasuk ke dalam mikroorganisme meskipun tidak bersifat seluler .

Perbandingan ukuran sel prokariot dengan sel lain dan biomolekul (skala logaritma)

Bakteri

A. Mengamati Morfologi Bakteri

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)

Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula

penyimpanan

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)

Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora.

Struktur dasar sel bakteri: 1. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan

polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri

Bab 4 Morfologi Mikroorganisme

37

gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila

peptidoglikannya tipis).

2. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun

atas lapisan fosfolipid dan protein.

3. Sitoplasma adalah cairan sel.

4. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas

protein dan RNA.

5. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang

dibutuhkan.

Struktur tambahan bakteri :

1. Kapsul atau lapisan lendir adalah lapisan di luar dinding sel pada jenis bakteri

tertentu, bila lapisannya tebal disebut kapsul dan bila lapisannya tipis disebut

lapisan lendir. Kapsul dan lapisan lendir tersusun atas polisakarida dan air.

2. Flagelum atau bulu cambuk adalah struktur berbentuk batang atau spiral

yang menonjol dari dinding sel.

3. Pilus dan fimbria adalah struktur berbentuk seperti rambut halus yang

menonjol dari dinding sel, pilus mirip dengan flagelum tetapi lebih pendek,

kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun dari protein dan hanya

terdapat pada bakteri gram negatif. Fimbria adalah struktur sejenis pilus

tetapi lebih pendek daripada pilus.

4. Klorosom adalah struktur yang berada tepat dibawah membran plasma dan

mengandung pigmen klorofil dan pigmen lainnya untuk proses fotosintesis.

Klorosom hanya terdapat pada bakteri yang melakukan fotosintesis.

38

5. Vakuola gas terdapat pada bakteri yang hidup di air dan berfotosintesis.

6. Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram

positif dan terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan

bagi kehidupan bakteri. Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi

genetik, dan ribosom. Dinding endospora yang tebal tersusun atas protein

dan menyebabkan endospora tahan terhadap kekeringan, radiasi cahaya,

suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan menguntungkan endospora

akan tumbuh menjadi sel bakteri baru.

B. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri

Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis

bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan

kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk

media untuk dikenali ciri koloninya.

Cara Kerja :

Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran

Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak

lurus

Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stabinoculation

Tumbuhkan biakan pada media NB

A.1. Pertumbuhan pada Cawan Petri

Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :

Ukuran; a

a. pinpoint/punctiform (titik) b

b. Small (kecil)

c. Moderate (sedang) c

d. Large (besar) d

Pigmentasi :

mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa

jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media

39

Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.

a. Opaque (tidak dapat ditembus cahaya)

b. Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian)

c. Transparant (bening)

Bentuk :

a. Circular a

b. Irregular

c. Spindle

d. Filamentous b

e. Rhizoid c

d

e

- Elevasi :

a. Flat a

b. Raised

c. Convex b

d. Umbonate

c

d

Permukaan :

a. Halus mengkilap

b. Kasar

c. Berkerut

d. Kering seperti bubuk

40

Margins : 1

1. Entire 2

2. Lobate

3. Undulate

4. Serrate 3

5. Felamentous

6. Curled 4

6

A.2. Pertumbuhan pada Agar Miring

Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus

Ciri koloni berdasarkan bentuk:

A.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak

Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam

media agar tegak.

Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :

41

Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 :

A.4 Pertumbuhan pada Media Cair

Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2

A. Mengamati Morfologi Bakteri

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan

perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa

pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel

bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat

mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan

sekelilingnya ditingkatkan.

Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,

bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai

muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan

zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena

muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna

42

asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite

Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.

Pewarnaan

Pewarnaan sederhana Pewarnaan diferensial Pewarnaan khusus pewarnaan positif pewarnaan gram pewarnaan endospora pewarnaan negatif pewarnaan acid fast dll. pewarnaan flagella dll.

B.1. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif)

Merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis zat pewarna (tunggal).

Misalnya metylen blue, Carbol fuchsin, dll.

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang

kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi

jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari

bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan

melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

Cara Kerja :

Bersihkan object glass dengan kapas

Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass

Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes

atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok

terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan

jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya

sel merata.

Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di

atas api 2-3 kali)

Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna

(dapat digunakan Methylen blue, Safranin, CrystalViolet) dan tunggu kurang lebih 30

detik.

Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue

Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).

43

B.2 Pewarnaan Negatif

Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan

pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai

lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam.

Prosedur:

1. Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah

satu object glass

2. Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi,

lalu dicampurkan

3. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri

4. Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas

api.

1 2

44

3 4

5. Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri.

A.3. Pewarnaan Gram

Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak

digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting

dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya

lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada

membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua

yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang

tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding

sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Berikut merupakan tabel

prosedur pewarnaan Gram:

45

Dengan metode ini, biasanya bakteri Gram (+) berwarna ungu dan Gram (-)

berwarna merah. Perbedaan tersebut karea perbedaan struktur dinding sel bakteri

Gram (+) yang mengandung peptidoglikan dan Gram (-) yang mengandung kadar

lipid yang tinggi sehingga terjadi perbedaan reaksi dalam permiabilitas zat warna

dan penambahan zat pemucat.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb:

a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang

mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai

46

berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif

tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam

penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine

secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.

b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak

lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel

menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan

menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan

sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang

memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan

Arthrobacter.

PERBEDAAN BAKTERI GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF:

CIRI PERBEDAAN RELATIF

GRAM POSITIF GRAM NEGATIF

Sturktur dinding sel Tebal (15-80 nm), berlapis

tunggal (mono)

Tipis (10-15 nm), berlapis

tiga (multi)

Komposisi dinding sel

Kandungan lipid rendah (1-4

%), peptidoglikan ada

sebagai lapisan tunggal, ada

asam tekoat

Kandungan lipid tinggi (11-

22%), peptidoglikan ada di

dalam lapisan kaku

sebelah dalam, tidak ada

aam tekoat

Kerentanan terhadap

penisilin Lebih rentan Krang rentan

Pertumbuhan

dihambat oleh warna-

warna dasar (seperti

Kristal ungu)

Pertumbuhan dihambat

dengan nyata

Pertumbuhan tidak begitu

dihambat

Persyaratan nutrisi Relative rumit pada banyak

spesies Relative sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik Lebih resisten Kurang resisten

Asam tekoat = polimer gliserol dan ribitol fosfat menempel pada peptodoglikan atau membran sitoplasma. Fungsi asam teikoat (muatan negatif) adalah : untuk transport ion positif dari dan keluar sel penyimpanan fosfor B.4. Pewarnaan Endospora

Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah

bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan

47

bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan

mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi

dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan

endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.

Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa

pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika

dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi

(kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik

pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan

metode Schaeffer-Fulton.

48

49

Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya

B.5. Pewarnaan Khusus (Pewarnaan Bakteri Tahan Asam)/ BTA

Bakteri-bakteri tahan asam memiliki lapisan lipid/lemak yang tebal dalam

dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel bakteri tersebut relatif tidak

permeable terhadap zat warna yang umum sehingga sel-sel tersebut tidak terwarnai

oleh metode pewarnaan biasa. Pada pewarnaan ini, mikroorganisme dapat

menahan zat warna yang tidak terpucatkan oleh asam alcohol sehingga dikatakan

tahan asam dan tampak merah, sedangkan yang tidak tahan asam (terpucatkan)

akan berwarna biru. Metode yang paling sering digunakan adalah Zeihl-Nelssen dan

Kinyoun Gabbet/ Tan Thiam Hok.

C. Mengamati motilitas

C.1 Pengamatan Langsung

Cara Kerja :

50

Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.coli ke object glass (sebaiknya

dari biakan cair). Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu

ditambah akuades satu tetes, ratakan.

Tutup dengan cover glass

Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak. Bakteri akan

tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati jangan salah

membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena

aliran air.

C.2 Pengamatan tidak langsung

Cara Kerja :

Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan

cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm.

Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam

Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan

media, hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah

tusukan saja

Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan

ARKEA

Diameter arkea berkisar antara 0,1 mikrometer (m) hingga 15 m dan terdapat

dalam berbagai bentuk seperti bulat, berbentuk seperti tongkat, spiral, seperti

lempengan, filament seperti jarum atau persegi. Struktur selnya mirip bakteri gram

positif, tapi komponen selnya berbeda serta mempunyai flagella.

51

Salah satu jenis arkea yang hidup di sumber air panas sebuah gunung berapi.

PROTOZOA Ukuran tubuh protozoa biasanya berkisar antara 10-50 m, tetapi dapat tumbuh sampai 1

mm, dan mudah dilihat di bawah mikroskop. Protozoa ada yang bergerak dengan flagela da

nada yang menggunakan silia. Lebih dari 30.000 jenis telah ditemukan. Protozoa terdapat di

seluruh lingkungan berair dan tanah, tubuh protozoa amat sederhana, yaitu terdiri dari satu

sel tunggal (unisel). Namun demikian, Protozoa merupakan sistem yang serba bisa. Semua

tugas tubuh dapat dilakukan oleh satu sel saja tanpa mengalami tumpang tindih. Bentuk

tubuh macam-macam, ada yang seperti bola, bulat memanjang, atau seperti sandal bahkan

ada yang bentuknya tidak menentu.

Protozoa adalah mikroorganisme menyerupai hewan yang merupakan salah satu filum dari

Kingdom Protista. Seluruh kegiatan hidupnya dilakukan oleh sel itu sendiri dengan

menggunakan organel-organel antara lain membran plasma, sitoplasma, dan mitokondria.

Ciri-ciri umum :

Organisme uniseluler (bersel tunggal)

Eukariotik (memiliki membran nukleus)

Hidup soliter (sendiri) atau berkoloni (kelompok)

Umumnya tidak dapat membuat makanan sendiri (heterotrof)

Hidup bebas, saprofit atau parasit

Dapat membentuk sista untuk bertahan hidup

Alat gerak berupa pseudopodia, silia, atau flagela

Semua protozoa mempunyai vakuola kontraktil. Vakuola dapat berperan sebagai pompa

untuk mengeluarkan kelebihan air dari sel, atau untuk mengatur tekanan osmosis. Jumlah

dan letak vakuola kontraktil berbeda pada setiap spesies. Protozoa dapat berada dalam

bentuk vegetatif (trophozoite), atau bentuk istirahat yang disebut kista. Protozoa pada

keadaan yang tidak menguntungkan dapat membentuk kista untuk mempertahankan

hidupnya. Saat kista berada pada keadaan yang menguntungkan, maka akan berkecambah

menjadi sel vegetatifnya. Protozoa tidak mempunyai dinding sel, dan tidak

mengandung selulosa atau khitin seperti pada jamur dan algae.

52

Yeast / Khamir

A. Mengamati morfologi koloni yeast

Sel khamir dapat tumbuh setelah ditanamkan pada media agar selama 1

sampai 3 hari. Selama waktu tersebut, khamir akan menghasilkan koloni berwarna

pucat keruh dan umumnya mempunyai diameter anatar 0.5 sampai 3.0 mm.

Sebagaian kecil species dapat menghasilkan pigmen, tetapi kebanyakan hanya

menghasilkan warna krem. Dibawah mikroskop dan secara morfologi koloni ,

kebanyakan species khamir sulit dibedakan karena perbedaannya yang sangat kecil.

Untuk membedakannya seringkali harus dilakukan tes fisiologi. Ragi dengan nilai

ekonomi paling penting yang saat ini dikenal adalah khamir yang digunakan dalam

pembuatan roti (bakers) dan dalam pembuatan bir (brewers), yang merupakan

anggota dari genus Saccharomyces.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam mengidentifikasi khamir adalah:

1. Ada tidaknya askospora, kalau ada bagaimana pembentukannya (konyugasi isogami, heterogami, atau konyugasi askospora), bentuk, warna, ukuran, dan jumlah spora.

2. Bentuk, warna, dan ukuran sel vegetatifnya. 3. Cara reproduksi aseksual (bertunas, membelah, dsb)

53

4. Ada tidaknya filamen atau pseudomiselium. 5. Pertumbuhan dalam medium dan warna koloninya. 6. Sifat-sifat fisiologi, misalnya sumber karbon (C) dan nitrogen (N), kebutuhan

vitamin, bersifat oksidatif atau fermentatif, atau keduanya, lipolitik, uji pembentukan asam, penggunaan pati, dan lain-lain.

Berikut ini merupakan cara pengamatan morfologi khamir:

a. Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida

albicans) pada PDA dengan cara streakquadrant.

b. Inkubasi selama 2x24 jam.

c. Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciri-ciri morfologi koloni

hampir sama dengan ciri morfologi bakteri.

B. Mengamati Morfologi Sel Yeast

Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak membentuk hifa

(beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Bentuk selnya bervariasi dapat

berbentuk bulat, bulat telur, bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 m. Beberapa

spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau

pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil

pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak melepaskan diri dari induk.

Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti

mitkondria, grannula lemak dan glikogen.

B.1 Melihat bentuk sel Yeast

Cara Kerja :

Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.

Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata

(jangan difiksasi).

Tutup preparat dengan cover glass.

Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10.

B.2 Melihat bentuk spora sel Yeast

Cara kerja :

Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari.

Fiksasi dengan api bunsen.

Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu:

54

Tetesi preparat dengan MalachiteGreen dan biarkan 30-60 detik. Panasi preparat

dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Cuci preparat dengan air

mengalir. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka. Amati di

bawah mikroskop. Perhatikan spora yang berwarna

Kapang / Jamur

Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa

benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium).

Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan

hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi koloni

pada umumnya seperti benang (filamentous) yang

pertumbuhannya membentuk lingkaran. Morfologi

koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa

jenis bakteri yang koloninya mirip jamur, seperti dari kelompok Actinomycetes atau

Bacillus mycoides. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari

sporanya.

A. Mengamati morfologi koloni kapang

Cara kerja :

Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di

tenganh-tengah cawan petri.

Inkubasi selam beberapa hari.

Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar.

B. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode SlideCulture (Microculture)

Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada

object glass yang ditetesi media pertumbuhan. Pengamatan struktur spora dan

miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di

depan. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus

sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. Dengan teknik ini,

spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah

tersebut.

55

B.1 Metode Heinrichs, cara kerja :

a. Siapkan object glass, cover glass, tissue basah yang dimasukkan dalam cawan

dan sterilkan dengan autoclave.

b. Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah

kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis).

c. Tutup dengan cover glass.

d. Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass

yang tidak diberi lilin. Berikan sampai setengah luasan cover glass. Tekan

cover galss secara media merata.

e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.

f. Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop.

B. 2 Metode Riddel, cara kerja :

a. Persiapan sama seperti di atas

b. Setelah semua steril, potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk

kubus dan letakkan di atas object glass.

c. Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar.

d. Tutup potongan agar dengan cover glass.

e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.

f. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.

56

B.3 Prosedur yang lebih sederhana, cara kerja :

a. Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass

dan cover glass.

b. Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair.

c. Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat

(teteskan jangan terlalu banyak).

d. Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L.

e. Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut.

f. Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata.

g. Inkubasi selama 2x24 jam.

h. Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan

perbesaran sedang

57

MIKROBA YANG PENTING DALAM INDUSTRI FERMENTASI

1. BAKTERI

a. Acetobacter aceti. Bakteri ini penting dalam produksi asam asetat dengan

mengoksidasi alkohol sehingga menjadi asam asetat. Banyak terdapat

pada ragi tapai, yang menyebabkan tapai yang melewati dua hari

fermentasi akan menjadi berasa asam

b. Acetobacter xylinum.Bakteri ini digunakan dalam pembuatan nata de

coco. A.xylinum mampu mensintesis selulosa dari gula yang dikonsumsi.

Bakteri ini juga terdapat pada produk kombucha yaitu fermentasi dari teh

c. Bacillus sp. Merupakan genus dengan kemampuan yang paling luas. Pada

mulanya hanya digunakan untuk menghasilkan enzim amylase, namun

berkembang untuk bioinsektisida yang diwakili oleh Bacillus thuringiensis

maupun untuk penanganan limbah seperti B. subtilis dan B. megaterium,

juga digunakan untuk memproduksi bahan baku plastik ramah

lingkungan.

d. Bividobacterium sp. Bersifat anaerob dan digunakan sebagai mikrobia

probiotik, yaitu mikroba yang dikonsumsi untuk mengatur keseimbangan

flora usus.

e. Lactobacillus sp. Digunakan dalam produksi asam laktat, fermentasi

pangan seperti yoghurt, sauerkraut dan juga produk probiotik. Asam

laktat dari bakteri ini dapat juga dibuat poli asam laktat sebagai bahan

baku plastic ramah lingkungan.

2. KHAMIR

a. Saccharomyces cerevisiae, digunakan dalam industry wine dan

pengembang adonan roti

b. Saccharomyces roxii, digunakan dalam pembuatan kecap dan

berkontribusi pada pembentukan aroma

3. JAMUR/ KAPANG

a. Aspergillus niger,digunakan dalam pembuatan asam sitrat (pada

pembuatan permen dan minuman kemasan), sering mengkontaminasi

makanan misalnya roti tawar.

b. Rhizopus oryzae, penting dalam pembuatan tempe

c. Neurospora sitophila, merupakan sumber beta karoten pada fermentasi

tradisional seperti produksi oncom.

d. Monascus purpureus, dalam pembuatan angkak (fermentasi pada beras).

Jamur ini menghasilkan pewarna alami yang umumnya digunakan pada

masakan cina.

e. Penicillium sp., mampu menghasilkan antibiotic yang disebut penisilin.

58

Di samping beragam jenisnya, mikroba juga sangat mudah mengalami

perubahan sifat sehingga menjadi strain baru yang berbeda dengan aslinya. Dalam

melaksanakan kegiatan ilmiahnya, para pakar mikrobiologi dan pakar ilmu yang

terkait seperti pakar fitopatologi dan entomologi perlu mempunyai koleksi plasma

nutfah mikroba, baik untuk digunakan sehari-hari, untuk jangka menengah, maupun

jangka panjang.

Oleh karena itu, perlu melakukan koleksi, menyimpan, dan memelihara

mikroba dengan baik. Para ilmuwan tersebut perlu memiliki metode pembuatan dan

penyimpanan koleksi (preservasi) yang sesuai untuk menjaga agar biakan mikroba

tetap hidup, ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah, serta hemat biaya

dan tenaga. Metode yang dipilih sangat tergantung pada sifat mikroba dan tujuan

preservasi. Sifat mikroba tercermin dalam:

(1) ciri-ciri morfologi mikroba yang beragam (virus, bakteri, jamur, nematoda,

algae, khamir, dan protozoa)

(2) ciri-ciri fisiologi dan biokimia mikroba

(3) kemampuan mikroba bertahan hidup baik dalam lingkungan alaminya

maupun lingkungan buatan.

Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka pendek dan jangka panjang.:

1. Preservasi jangka pendek dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yang

disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu.

2. Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan

konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat diperlukan,

dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia.

Mikroorganisme

Bab 5 Pemindahan & Pengawetan

59

Keberhasilan pembuatan koleksi plasma nutfah mikroba tergantung pada tiga

faktor, yaitu:

(1) penguasaan teknologi

(2) ketersediaan fasilitas preservasi

(3) ketersediaan tenaga terampil, tekun, dan rutin.

Tujuan utama preservasi, yaitu:

(1) mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga

sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya)

(2) memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan

(recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri

yang minimum.

CARA PENYIMPANAN:

1. Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan

secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke

media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak.

Beberapa teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan

isolat jangka pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk

penyimpanan jangka panjang. Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan

dalam minyak mineral, parafin cair, tanah steril, air steril, manik-manik

porselin, lempengan gelatin, dan P2O5 dalam keadaan vakum.

2. Metode penyimpanan jangka panjang yang p