BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Jenis Penelitian

Pada penelitian ini terdapat perlakuan terhadap objek yang diteliti dan kontrol sebagai

pembanding maka jenis penelitian yang dilakukan adalah eksperimen. Penelitian eksperimen

adalah penelitian yang observasinya dilakukan terhadap efek dari manipulasi peneliti terhadap

satu atau sejumlah ciri (variabel) subjek penelitian (Praktiknya, 1993).

3.2. Desain Penelitian

Desain penelitian ini menggunakan metode Rancangan acak Lengkap (RAL) karena

percobaan yang dilakukan bersifat homogen seperti pada percobaan yang dilakukan dalam

laboratorium (nazir, 2003). Mencit yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 25 ekor yang

dipilih secara acak dengan jenis kelamin betina. Sedangkan 20 ekor diberikan perlakuan berupa

pemberian sari buah jambu biji dengan dosis 30 mg, 40 mg, 50 mg dan 60 mg, sedangkan lima

ekor lainnya sebagai control. Pemberian sari buah jambu biji kepada hewan uji (mencit)

dilakukan dengan cara peroral atau gavage selama tujuh hari. sebelumnya mencit yang terpilih

menjadi kontrol dan mencit yang terpilih menjadi perlakuan di aklimatisasi terlebih dahulu

selama tujuh hari, selanjutnya sama-sama diberi makan tinggi kolestrol selama tujuh hari dan

setelah itu baru dilakukan perlakuan.

Masing-masing kelompok tersebut dilakukan replikasi sebanyak lima ekor mencit

didapatkan berdasarkan Gomez (1995).

Rumus :

T (r-1) ≥ 20

5 (r-1) ≥ 20

r ≥ 5

Keteraangan:

T : Jumlah perlakuan

r : Jumlah replikasi

Setiap kotak diberi tanda dan nomor untuk mencit. Penempatan perlakuan pada setiap

kandang dilakukan randomisasi. Setelah random, maka didapatkan penempatan perlakuan pada

setiap kandang sebagai berikut:

Tabel 3.1. Pengaturan Randomisasi Mencit

1a 2c 3b 4b 5d

6d 7a 8b 9c 10b

11e 12e 13a 14c 15e

16e 17a 18d 19e 20b

21c 22c 23d 24a 25d

Tabel 3.2. Penempatan Perlakuan pada Setiap Kandang

Kandang No.Mencit

A 3 7 12 19 25

B 5 10 15 16 23

C 2 9 13 17 21

D 4 8 11 18 22

E 1 6 14 20 24

Keterangan :

Perlakuan A = 0 ml; B = 30 ml; C = 40 ml; D = 50 ml; E = 60 mg konsentrasi sari buah jambu

biji.

3.3. Populasi dan Sampel Peneltian

Populasi yang digunakan adalah kadar kolesterol mencit (Mus musculus. L.) swiss

Webster yang berumur delapan minggu. Sampel yang digunakan adalah kadar kolesterol 25 ekor

mencit (Mus musculus. L) swiss webster betina dara yang berumur delapan minggu dan

gambaran histology dari organ hati.

3.3.1. Kriteria inklusi

a. Berat tubuh 180-200 gram pada umur delapan minggu

b. Kondisi sehat

3.3.2. Kriteria Drop-out

a. Tikus mengalami diare selama masa penelitian yang ditandai dengan feses tidak

berbentuk

b. Tikus mati selama perlakuan berlangsung

3.3.3. Kriteria Ekslusi

Bila pada tikus yang drop-out, diganti dengan tikus lain sesuai dengan kriteria

inklusi, sehingga didapat jumlah tikus sesuai yang diinginkan.

3.4. Variabel penelitian

3.4.1. Klasifikasi variabel

a. Variabel bebas; variabel bebas dalam penelitian ini adalah diet tinggi kolesterol dan

pemberian sari buah jambu biji.

b. Variabel terikat; variabel terikat pada penelitian ini adalah kadar kolesterol darah

pada mencit dan gambaran histology organ hati.

3.5. Definisi Operasional

a. Diet kolesterol tinggi ialah pemberian 5 gram daging sapi lewat sonde lambung setiap

hari selama tujuh hari.

b. Pemberian jambu biji adalah pemberian sari buah jambu biji lewat jarum gavage setiap

hari, dosis didapatkan berdasarkan dosis lazim manusia yang dikonversikan pada tikus.

c. Kadar kolesterol darah adalah kadar kolesterol yang diukur secara enzimatik dengan

menggunakan digital pengukur kolesterol.

d. Gambaran histologi adalah hasil preparat histologi berdasarkan metode pewarnaan.

3.6. Alat dan Bahan

3.6.1. Alat

a. Untuk pemeliharaan dan pemberian perlakuan adalah kandang hewan, sonde

lambung, dan jarum gavage.

b. Untuk pemeriksaan kadar kolesterol darah menggunakan alat digital pemeriksa

kolesterol dan strip kolesterol.

c. Untuk pembuatan preparat histologi.

3.7.2. Bahan

a. Hewan coba berupa tikus betina galur swiss webster, dari pusat pemeliharaan hewan

percobaan....., memenuhi kriteria inklusi, mendapat pakan standar , dan minum secara

ad libitum.

b. Bahan perlakuan berupa daging sapi yang telah diolah, dibuat halus dengan cara

digiling. Buah jambu biji dibuat menjadi sari dengan cara dibuat jus murni (liquid).

3.8. Lokasi Penelitian

Pembuatan sari mengkudu dilakukan di Laboratorium, pemberian perlakuan, serta

mengambil sampel darah dilakukan di Laboratorium, pengukuran kadar kolesterol mencit di

lakukan di Laboratorium. Pembuatan preparat histologi di lakukan di Laboratorium.

3.9. Prosedur Kerja

3.9.1. Tahap Penelitian

3.9.1.1. Aklimatisasi mencit

Pemeliharaan dilakukan di................ . sebelum diberi perlakuan, mencit-mencit

diaklimatisasi pada suhu ruangan rata-rata 23-26̊̊̊̊C, periode ini dilaksanakan selama

seminggu dengan tujuan agar hewan uji teradaptasi dengan kondisi yang akan di tempati

selama percobaan. Mencit-mencit dikelompokan di dalam kandang berukuran 30 x 20 cm x

12 cm berdasarkan perlakuan yang diberikan dengan kepadatan lima ekor setiap kandang.

Pemilihan jenis kelamin betina berumur dua bulan dilakukan karena adanya suatu

kondisi bahwa penurunan esterogen dapat menyebabkan naiknya kadar total lipid,

kolesterol LDL serta penurunan kadar HDL (Mu’minah,2007). Dan adanya suatu

penelitian yang melaporkan bahwa pemberian lemak dan kolesterol yang berlebihan pada

mencit jantan dapat mempengaruhi keagresifan (Clarce et al, 1996) sehingga akan

membuat data menjadi bias.

Selama aklimatisasi, mencit-mencit tersebut hanya diberi pakan biasa dan diberi air

minum secara ad libitum. Makanan diberikan 5gram setiap hari dan botol minuman

dibersihkan tiap tiga hari sekali dan diganti airnya atau diisi ulang dengan air yang baru

apabila air sudah habis. Aklimatisasi biasanya digunakan untuk menghadapi faktor-faktor

yang terjadi dalam lingkungan lebih terkontrol di Laboratorium.

3.9.1.2. Pembuatan sari Jambu Biji

Buah Jambu biji

Sortasi (kondisi baik dan segar)

Pencucian

Penghancuran

Pengepresan denganpres hidrolik

Ampas

Cairan

Skema proses pengolahan sari buah jambu biji (Pohan dan Antara.2001).

3.9.1.3. Penentuan Dosis

Bahan yang di uji adalah larutan sari buah jambu biji dengan dosis 0 ml, 30 ml, 40

ml, 50 ml, 60 ml per hari. Bahan pakan berlemak yang diberikan berasal dari daging sapi

sebanyak 5 gram/hari.

3.9.2. Tahap Perlakuan

3.9.2.1. Pemberian pakan berlemak

Pemberian pakan berlemak dilakukan selama seminggu, mencit diberi makan

berlemak dengan komposisi pakan daging sapi murni yang digiling dengan penggilingan

sampai halus, dan minum seperti biasa.

3.9.2.2. Pemberian Sari Buah Jambu Biji

Perlakuan dilaksanakan selama seminggu, mencit di beri minum seperti

biasa.pemberian dosis secara oral dengan menggunakan jarum gavage.

3.9.2.3. Pengambilan sampel darah

Sampel darah mencit diambil dari bagian abdominal aorta (Terpstra et al., 1998 ;

Garcia-Diez et al., 1995), dan jantung (Hassel, 1996).

3.9.2.4. Pengukuran Kadar Kolesterol Total Darah

Kadar kolesterol diukur dengan digital dan strip pengukur kolesterol, dengan cara

mengambil sampel darah mencit secukupnya dan dengan itu langsung dilihat kadar

kolesterol darah pada tampilan alat pada pengukur kolesterol.

Alasan menggunakan alat ini selain mudah didapat, dan juga praktis dalam

penggunaan nya.

3.9.2.5. Tahap pengambilan organ

Setelah melewati masa perlakuan (treatmen) dengan cara pemberian asupan sari

jambu biji selama tujuh hari. Selanjutnya, dilakukan tahap pengambilan organ

pembedahan hewan uji. Mencit yang telah dibedah kemudian mengambil bagian organ-

organ yang akan diuji, yakni organ hati dengan cara digunting atau dipotong

menggunakan alat-alat bedah. Hal tersebut dilakukan dengan hati-hati agar organ-organ

yang akan di uji tidak rusak. Kemudian organ-organ tersebut di timbang, lalu disimpan

kedalam tabung yang telah diisi larutan formalin 5%.

3.9.2.6. Tahap pembuatan preparat

Pada tahap pembuatan preparat dilakukan dengan melakukan dua metode yakni

metode beku dan metode paraffin. Metode beku adalah salah satu cara dalam membuat

preparat irisan dengan tekhnik pembekuan suatu jaringan tertentu, sehingga jaringan

dapat menjadi keras dan mudah diiris. Cara membekukan jaringan ini adalah dengan

menyemprotkan gas N2 (nitrogen cair) pada jaringan tersebut (Suntoro, 1983: 42).

Metode ini lebih baik daripada menggunakan metode paraffin dikarenakan dengan

menggunakan metode beku jaringan hanya mengalami sedikit pengerutan dan hamper

setiap metode pewarnaan dapat dikerjakan bila menggunakan metode beku

(Suntoro,1983: 42). Tetapi kelemahan metode beku menurut Suntoro bahwa hamper tidak

mungkin untuk dapat melihat elemen-elemen structural dalam kedudukan yang asli,

sangat sukar untuk dapat memperoleh irisan yang seri dan irisan yang tipis juga sulit

diperoleh.

Metode yang selanjutnya digunakan adalah metode paraffin. Walaupun menurut

suntoro metode ini kurang baik dalam pembuatan preparat jaringan organ hewan. Namun,

metode tersebut masih dapat digunakan dalam pembuatan preparat jaringan organ hewan

(Soetjipto, 1968:8). Alasan lain menggunakan metode paraffin adalah sebagai

pembanding dalam melihat keadaan gambaran histology organ yang diteliti. Pembuatan

preparat organ hewan dengan menggunakan metode ini dilakukan dalam beberapa tahap,

yakni : narcose, sectio, labeling, fixasi, washing, dehidrasi, clearing, impregnasi,

embedding, affixing, dan staining (Soetjipta, 1968:8-17)

Setelah dilakukan proseses irisan, selanjutnya dilakukan pewarnaan irisan dengan

menggunakan metode Schultz-smith. Alas an menggunakan metode ini karena gambaran

histology organ yang akan diteliti lebih diarahkan ke keadaan kolesterol pada organ

tersebut (Suntoro, 1983: 179). Irisan organ yang siap diwarnai terlebih dahulu dicelupkan

dalam reagen A (hydrogen peroksida 3%) selama tiga menit, kemudian dicuci dengan

aquades dan setelah itu diletakan diatas kaca objek hingga aga mongering. Selanjutnya

irisan tersebut ditetesi dengan reagen B (asam asetat glacial), kemudian ditutup dengan

kaca objek kemudian diamati. Hasil pewarnaan dengan menggunakan metode Schultz-

Smith ini ialah kolesterol dan esternya akan bewarna hijau untuk beberapa saat,

kemudian bewarna coklat setelah 30 menit (Suntoro,1983: 179).

Sedangkan untuk proses pewarnaan dengan metode Haematoxylin Ehrlich-eosin

atau biasa dikenal dengan metode HE dilakukan dengan beberapa tahapan, seperti (1)

dilakukan deparafinisasi dengan xylol selama 30 menit ; (2) tahapan hidrasi dengan

menggunakan alcohol bertingkat (96%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%) selama

± 10 detik; (3) setelah itu dicuci dengan aquades; (4) dicelupkan ke dalam larutan HE, (5)

kemudian dicuci kembali dengan air kran selama 10 menit; (6) dicelupkan dalam

aquades; (7) diferensiasi dengan cara preparat dicelupkan ke dalam larutan asam 1%

selama tiga detik; (8) dicuci kembali dengan air keran selama lima menit; (9) dicelupkan

kembali kedalam akuades; (10) dicelupkan ke dalam alcohol bertingkat (30%, 40%, 50%,

60%, 70%) selama kurang lebih 10 detik; (11) dicelupkan kedalam larutan eosin 1%

selama tiga menit; (12) dicuci kembali dengan air kran; (13) dibilas dengan akuades; (14)

dicelupkan kedalam alcohol bertingkat kembali (30%, 40%, 50%, 60%, 70&, 80%, 90%,

100%) selama kurang lebih 10 detik; (15) difilter dengan menggunakan kertas saring

isap; (16) di-muonting dengan menggunakan entelan. Hasil dari pewarnaan metode HE

ini adalah biru kehitaman adalah inti (sel hepatica) dan sitoplasma agak kemerah-

merahan (Disbrey et al. 1970).

3.10. Tekhnik Pengolahan Data

Data dalam penelitian ini dianalisis secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan

dengan cara melihat, membandingkan dan mendeskrifkan gambaran histology organ hati dari

setiap dosis dengan kontrol.

3.11. Alur Penelitian

Persiapan alat dan bahan

Aklimatisasi dan pemeliharaan mencit

Pemberian diet tinggi kolesterol

Perlakuan (gavage) sari buah jambu biji

Kadar kolesterol darah dan gambaran

Histologi organ hati

Pengolahan data dan Penyusunan skripsi