MEDIA, ISOLASI, STERILISASI, PEREMAJAAN DAN PENYIMPANAN MIKROBAOleh:

Fajriyati Mas’ud

MEDIA

Untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba, diperlukan substrat yang disebut media.

Media sebelum dipergunakan harus dalam keadaan steril, artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti kecambah kacang hijau/tauge, kentang, daging, telur, wortel dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia baik organik ataupun anorganik) yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba, disebut “media”.

AGAR MIKROBA DAPAT TUMBUH DAN BERKEMBANG DENGAN BAIK DI DALAM MEDIA, DIPERLUKAN PERSYARATAN TERTENTU, YAITU: Di dalam media harus terkandung semua

unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba.

Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba.

Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami mikroba yang dimaksud, tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

Bentuk Media

Media padat Media semi padat atau semi cair

Media cair

Susunan Media

Kandungan air Kandungan nitrogen, baik berasal dan

protein, asam amino dan senyawa lain yang mengandung nitrogen

Kandungan sumber energi/unsur C, baik yang berasal dan karbohidrat, lemak, protein senyawa-senyawa lain

Ion-ion baik sebagai unsur makro ataupun unsur mikro

Faktor pertumbuhan, umumnya vitamin dan asam amino

ISOLASI

Isolasi mikroba bertujuan untuk memperoleh mikroba tertentu sehingga akan diperoleh biakan murni.

Umumnya isolasi dilakukan dengan agar miring.

Beberapa Cara Mendapatkan Biakan Murni

Untuk menegakkan diagnosis bakteriologis sebaiknya biakan bakteri berada dalam keadaan murni atau tidak tercampur dengan bakteri-bakteri lain.

Biakan murni diperlukan untuk mempelajari ciri-ciri koloni, sifat-sifat biokimia, morfologi, reaksi pengecatan, reaksi imunologi, dan kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri

Pada umunya biakan murni dapat diperoleh dengan cara-cara sebagai berikut:

Cara Penggarisan Cara penggarisan dilakukan pada medium

pembiakan pada bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik cara ini adalah yang paling praktis. Setiap laboratorium memiliki cara atau metode pengerjaan yang berbeda-beda, tetapi tujuannya sama, yaitu untuk membuat garis sebanyak mungkin pada permukaan lempeng medium pembiakan dengan ose atau jarum, bahan pemeriksaan yang terlepas pada garis-garis tersebut semakin lama semakin sedikit. Sehingga pada garis-garis terakhir koloni-koloni bakteri yang berbentuk akan terpisah agak jauh.

Sebelum dilakukan penanaman harus diperhatikan agar permukaan lempeng medium pembiakan itu kering, bila masih terdapat tetes embun perlu dikeringkan dahulu dengan cara menyandarkan pinggan petri terbalik pada tepi tutupnya.

Cara Tuang

Isolasi bakteri dengan cara tuang ini umumnya dilakukan untuk menentukan perkiraan jumlah bakteri hidup dalam suatu cairan, misalnya air, susu, atau kemih.

Hasilnya dinyatakan dalam jumlah koloni, yang berarti jumlah bakteri hidup dalam tiap mililiter cairan yang diperiksa.

Cara pengerjaannya adalah sebagai berikut:

Dari suspensi bahan pemeriksaan dibuat pengenceran.

Dari tiap pengenceran diambil satu mililiter dan diletakkan ke dalam pinggan petri steril.

Ke dalam tiap pinggan petri tersebut dituang medium pembiakan yang telah dicairkan dan didinginkan sampai suhu kira-kira 40 – 45oC.

Dengan perlahan-lahan pinggan petri itu digoyang dengan gerakan memutar tanpa diangkat dari permukaan meja, sehingga bahan pemeriksaan tercampur rata dalam medium pembiakan kemudian didiamkan sampai beku.

Inkubasi dilakukan pada suhu yang sesuai selama 18 - 20 jam, kemudian koloni-koloni dihitung.

Ketelitian dalam hal menghitung bakteri terdapat pada lempeng-lempeng yang mengandung jumlah antara 30 - 300 koloni.

Bila telah diperoleh koloni-koloni yang terpisah dapat dibuat biakan murni dengan cara memindahkan koloni itu ke dalam medium pembiakan miring (slant) untuk diperbanyak atau disimpan untuk keperluan lain.

Caranya sebagai berikut:Dari satu koloni yang terpisah diambil seperempat bagian

untuk dibuat preparat pengecatan. Hal ini perlu untuk mengetahui morfologi dan reaksi pengecatan, dan kemurnian koloni.

Bila preparat menunjukkan bahwa koloni itu murni terdiri dari satu jenis dan sesuai dengan yang diperlukan, maka dari sisa koloni diambil lagi sebagian untuk persediaan atau untuk kelanjutkan pemeriksaan.

Sisa selanjutnya dipakai untuk periksaan sifat-sifat biokimia, seperti penamaan dalam deretan gula, gerak dan sebagainya. Bila dalam hal ini diperoleh hasil yang meragukan, pemeriksaan ini dapat diulang dengan menggunakan biakan murni dari pertumbuhan dalam medium miring.

Sterilisasi Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan

tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun.

Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat (in situ) oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehide, etilen oksida atau betarioplakton oleh bermacam-macam larutan kimia, oleh sinar ultra violet atau sinar gamma.

Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi.

Tujuan utama mematikan atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme adalah :

Untuk mencegah infeksi pada manusia, hewan, dan tumbuhan

Untuk mencegah kerusakan pangan dan komoditas lainnya

Untuk mencegah kontaminasi terhadap mikroorganisme yang digunakan dalam industri, hasilnya tergantung pada kemurnian penggunaan biakan murni

Untuk mencegah kontaminasi bahan-bahan yang dipakai dalam pengerjaan biakan murni dilaboratorium (diagnosis, penelitian, industri), sehingga pengamatan tentang pertumbuhan satu organisme pada medium pembiakan khusus atau pada hewan percobaan membingungkan karena adanya organisme lain yang tumbuh

Cara yang digunakan untuk mematikan dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme adalah

Destruksi oleh : (a) panas (alat pendidih, tanur), (b) zat-zat kimia (disinfektan), (c) radiasi (sinar-x, ultraviiolet), (d) cara mekanis (bantingan oleh vibrasi ultrasonik)

Penyingkiran oleh : (a) penyaringan, dan (b) sentrifugasi kecepatan tinggi

3. Penghambatan oleh : (a) suhu rendah (pendinginan, es kering), (b) pengeringan, (c) kombinasi (a) dan (b) (misalnya liofilisasi), (d) tekanan osmosis (sirop, asinan), dan (e) bahan kimia yang terdiri dari bebearapa bahan kimia seperti eosin dan metilenbiru, kristal violet, serta obat khemoterapeutik seperti sulfonamida dan antibiotik

CARA STERILISASI YANG UMUM DILAKUKAN ADALAH:

Sterilisasi secara fisik, misalnya dengan pemanasan, penggunaan sinar bergelombang pendek seperti sinar X, sinar gamma, sinar ultra violet dan sebagainya.

Sterilisasi secara kimia, misalnya dengan penggunaan desinfektan, larutan alkohol, larutan formalin, laruta AMC (campuran asam khlorida dengan garam Hg) dan sebagainya.

Sterilisasi secara mekanik, misalnya dengan cara penggunaan saringan/filter.

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur tinggi atau tekanan tinggi.

Bahan ataupun peralatan yang dipergunakan di dalam bidang mikrobiologi, harus dalam keadaan steril. Artinya pada bahan atau peralatan tersebut tidak didapatkan mikroba lain yang tidak diharapkan, baik yang akan mengganggu/merusak media ataupun mengganggu kehidupan dan proses yang sedang berlangsung.

Dengan udara panas diperlukan alat yang dinamakan “bejana/ruang panas” (oven) dengan temperatur antara 170-180C. Waktu yang dipergunakan adalah 2 jam. Cara ini umum dipergunakan untuk mensterilkan peralatan gelas (tabung, labu, botol dan sebagainya).

Beberapa larutan garam seperti NaCl (9%), KCI (11%) dan KNO (10%) dapat dipergunakan untuk membunuh mikroba karena tekanan osmotiknya, yaitu dengan dehidrasi protein pada substrat. Sedangkan asam kuat atau basa kuat dapat pula dipergunakan karena bersifat menghidrolisis sel.

Larutan KMnO4 (1%) dan HCL (1,1%) ternyata merupakan senyawa yang kuat karena dapat mengoksidasi substrat. Sedangkan yang paling banyak digunakan adalah larutan HgCl2 (0,1%). Hanya sayangnya senyawa ini sangat beracun dan bersifat korosif serta dapat merusak jaringan inang dan mengendapkan protein. Juga larutan garam Cu (dari CuSO4) merupakan senyawa yang paling banyak dipergunakan sebagai algisida (pembasmi alge).

Khlor dan senyawa khlor lainnya banyak dipergunakan sebagai desinfektan terutama pada tempat penyimpanan air

Larutan formalin atau formaldehida merupakan senyawa yang mudah larut dalam air tetapi sangat efektif dengan kadar antara 4-20%.

Larutan alkohol dengan kadar antara 50-75% banyak juga dipergunakan karena cepat menyebabkan koagulasi (penggumpalan) protein mikroba.

Peremajan dan Penyimpanan Mikroba

Peremajaan mikroba bertujuan untuk memperoleh biakan yang baru sehingga diharapkan dapat berkembang biak dengan baik. Hasil dari peremajaan mikroba adalah mikroba yang masih muda sehingga dapat digunakan dengan baik sesuai dengan fungsinya.

Penyimpanan mikroba bertujuan untuk memperoleh biakan/kultur mikroba kapanpun kita inginkan. Mikroba yang dapat diremakan untuk tujuan penyimpanan adalah isolat/biakan mikroba yang harus mampu mempertahankan sifat yang diharapkan darinya untuk waktu yang lama.

Beberapa metode penyimpanan mikroba adalah :

1. Penyimpanan pada suhu rendah ▪ Agar miring – pendingin (4 oC), freezer (-20 oC), ▪ Spora jamur dalam air (5 oC)▪ Nitrogen cair (-150 sampai -196 oC)

2. Penyimpanan dalam bentuk kering Tanah + biakan dikeringkan. Digunakan

untuk jamur Lyophilization\freeze drying. Pembekuan

biakan diikuti dengan pengeringan menggunakan vacuum mengakibatkan pengembunan air sel

Mutu biakan yang disimpan harus terpelihara dengan baik supaya diperoleh biakan yang tetap stabil, beberapa hal yang harus diperhatikan adalah :

Setiap batch harus diuji secara rutin Metode apapun yang digunakan untuk

penyimpanan, mutu simpanan harus selalu diikuti

Pengujian dilakukan untuk meyakinkan bahwa galur yang diperbanyak memiliki sifat tumbuh, morfologi, dan kemampuan menghasilkan produk yang sama

Beberapa cara preservasi kultur

a. Penyimpanan pada agar miring Kultur ditumbuhkan pada agar miring Disimpan pada refrigerator 5oC atau freezer

- 20oC Subkultur setiap 6 bulan atau sampai dengan

1 tahun bila kultur ditutup dengan mineral oil Mudah terkontaminasi b. Penyimpanan spora di dalam air Spora jamur dalam air steril Disimpan pada suhu 5oC Sangat terbatas pemakaiannya

c. Penyimpanan dengan nitrogen cair penyimpanan pada suhu sangat rendah

(-150o sampai -196oC) dengan refrigerator nitrogen cair

Kultur ditumbuhkan hingga fase stasioner, kemudian disuspensikan pada agensia cryoprotective (misal gliserol 10%), disimpan dalam ampul tertutup, kemudian dibekukan

Hasil yang baik : proses pembekuan suspensi lambat, proses pencairan cepat

Kematian sel banyak terjadi pada proses pembekuan

d. Pengkulturan pada tanah atau pasir Kultur ditumbuhkan pada tanah atau

pasir steril lembab, kemudian dibiarkan pada suhu ruang hingga kering, kultur kemudian disimpan pada suhu ruang atau di refrigerator

Biasanya dilakukan untuk spora kultur fungi,

Pengeringan bisa dengan desikator menggunakan silika gel atau CaCl

e. Penyimpanan pada media sporulasi

kultur disporulasikan pd media / substrat seperti sekam, sereal, biji-bijian

pengeringan pada desikator penyimpanan pada suhu 5oC

Penyimpanan liofilisasi atau freeze-drying.

Merupakan metode penyimpanan kultur yang paling banyak dilakukan oleh industri, kultur dapat bertahan hingga lama sekali. Dilakukan dengan cara :

1. Kultur ditumbuhkan hingga fase stasioner, disuspensikan dengan agensia pelindung (susu, Na glutamat, medium cair, serum, whey, campuran tanah dan pasir)

2. Kultur sel vegetatif atau spora dalam ampul dibekukan, kemudian dikeringkan secara vakum

3. Penyimpanan pada refrigerator