PEMERIKSAAN WIDAL

TUJUAN

- Untuk dapat mengetahui adanya antibodi spesifik dalam serum pasien

terhadap antigen Salmonella sp.

- Untuk membantu menegakkan diagnosa demam typhosa.

METODE

Metode yang dipakai pada pemeriksaan ini adalah slide aglutinasi dan tabung

aglutinasi.

PRINSIP

Prinsip uji Widal adalah reaksi aglutinasi antara antibodi aglutinin dalam

serum penderita yang telah mengalami pengenceran berbeda-beda terhadap

antigen somatik (O) dan flagela (H) dari bakteri Salmonella sp. dalam reagen yang

ditambahkan dalam jumlah yang sama. Pengenceran tertinggi yang masih

menimbulkan aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam serum.

DASAR TEORI

Demam typhoid (Typhoid Fever) merupakan suatu penyakit infeksi

sistemik yang disebabkan oleh Salmonella typhi maupun Salmonella paratyphi

A,B dan C yang masih dijumpai secara luas di negara berkembang yang terutama

terletak di daerah tropis dan subtropics (Musyaffa, 2010).

Petanda Serologi Demam Typhoid

Tubuh yang kemasukan Salmonella akan terangsang untuk membentuk

antibodi yang bersifat spesifik terhadap antigen yang merangsang

pembentukannya. Antibodi yang dibentuk merupakan petanda demam typhoid,

yang dapat dikategorikan sebagai berikut (Musyaffa, 2010):

1. Aglutinin O (Somatik)

Titer aglutinin O akan naik lebih dulu dan lebih cepat hilang daripada

aglutinin H atau Vi, karena pembentukannya T independent sehingga dapat

merangsang limfosit B untuk mengekskresikan antibodi tanpa melalui

limfosit T. Titer aglutinin O ini lebih bermanfaat dalam diagnosa

dibandingkan titer aglutinin H. Bila bereaksi dengan antigen spesifik akan

terbentuk endapan seperti pasir. Titer aglutinin O 1/160 dinyatakan positif

demam typhoid dengan catatan 8 bulan terakhir tidak mendapat vaksinasi

atau sembuh dari demam typhoid dan untuk yang tidak pernah terkena 1/80

merupakan positif.

2. Aglutinin H (flageller)

Titer aglutinin ini lebih lambat naik karena dalam pembentukan

memerlukan rangsangan limfosit T. Titer aglutinin 1/80 keatas mempunyai

nilai diagnostik yang baik dalam menentukan demam typhoid. Kenaikan

titer aglutinin empat kali dalam jangka 5-7 hari berguna untuk menentukan

demam typhoid. Bila bereaksi dengan antigen spesifik akan terbentuk

endapan seperti kapas atau awan.

3. Aglutinin Vi (Envelop)

Antigen Vi tidak digunakan untuk menunjang diagnosis demam

thypoid. Aglutinin Vi digunakan untuk mendeteksi adanya carrier. Antigen

ini menghalangi reaksi aglutinasi anti-O antibodi dengan antigen somatik.

Selain itu antigen Vi dapat untuk menentukan atau menemukan penderita

yang terinfeksi oleh Salmonella typhi atau kuman-kuman yang identik

antigennya.

Salah satu pemeriksaan yang bertujuan untuk menegakan diagnosa demam

typhoid adalah pemeriksaan widal. Widal atau uji widal adalah prosedur uji

serologi untuk mendeteksi bakteri Salmonella enterica yang mengakibatkan

penyakit t h y poid . Pemeriksaan widal ditujukan untuk mendeteksi adanya antibodi

(di dalam darah) terhadap antigen kuman Samonella typhi / paratyphi (reagen). Uji

ini merupakan test kuno yang masih amat popular dan paling sering diminati

terutama di negara dimana penyakit ini endemis seperti di Indonesia. Sebagai uji

cepat (rapid test) hasilnya dapat segera diketahui. Hasil positif dinyatakan dengan

adanya aglutinasi. Karena itu antibodi jenis ini dikenal sebagai Febrile agglutinin.

Untuk menentukan seseorang menderita demam typhoid atau bukan, tetap harus

didasarkan atas gejala-gejala yang sesuai dengan penyakit tifus. Uji widal hanya

dapat dikatakan sebagai penunjang diagnose jika seseorang tanpa gejala dengan uji

widal positif, tidak dapat dikatakan menderita tifus (Wiki,Tt).

Teknik pemeriksaan uji widal dapat dilakukan dengan dua metode yaitu uji

hapusan/ peluncuran (slide test) dan uji tabung (tube test). Perbedaannya, uji

tabung membutuhkan waktu inkubasi semalam karena membutuhkan teknik yang

lebih rumit dan uji widal slide hanya membutuhkan waktu inkubasi 1 menit saja

yang biasanya digunakan dalam prosedur penapisan (srenning). Umumnya

sekarang lebih banyak digunakan uji widal slide. Sensitivitas dan spesifitas tes ini

amat dipengaruhi oleh jenis antigen yang digunakan (Risnawati,2012).

Teknik slide test biasanya hanya digunakan untuk skrining (deteksi dini) dan

dapat digunakan untuk menentukan kehadiran dari antibodi homolog, jika antibodi

muncul di serum kemudian test tabung digunakan untuk menentukan titer antibodi

tersebut (Kit alat).

Antigen yang digunakan dalam reagen pada tes widal ini berasal dari suspense

Salmonella yang sudah dimatikan dan diolah dalam laboratorium. Dengan jalan

mengencerkan serum, maka kadar anti dapat ditentukan. Pengenceran tertinggi

yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam

serum. (Wiki,Tt)

Pada pemeriksaan uji widal dikenal beberapa antigen yang dipakai sebagai

parameter penilaian hasil uji widal. Berikut ini penjelasan macam antigen

tersebut (Risnawati,2012):

Antigen O

Antigen O merupakan somatik yang terletak di lapisan luar tubuh kuman.

Struktur kimianya terdiri dari lipopolisakarida. Antigen ini tahan terhadap

pemanasan 100°C selama 2–5 jam, alkohol dan asam yang encer. Antigen O atau

antigen somatik akan membentuk aglutinasi dengan serum yang mengandung

antibodi yang ditunjukan dengan adanya gumpalan berpasir, antigen yang terdapat

antigen O terutama IgM.

Antigen H

Antigen H merupakan antigen yang terletak di flagela, fimbriae atau fili S.

typhi dan berstruktur kimia protein. Antigen ini tidak aktif pada pemanasan di atas

suhu 60°C dan pada pemberian alkohol atau asam. Antigen ini mengandung

beberapa unsur imunologik, dalam satu spesies Salmonella antigen flagel dapat

ditemukan dalam fase 1 dan 2, ini dinamakan variasi fase antibodi terdapat antigen

H terutama Ig C.

Antigen Vi

Antigen Vi terletak di lapisan terluar S. typhi (kapsul) yang melindungi kuman

dari fagositosis dengan struktur kimia glikolipid, akan rusak bila dipanaskan

selama 1 jam pada suhu 60°C, dengan pemberian asam dan fenol. Antigen ini

digunakan untuk mengetahui adanya karier.

Outer Membrane Protein (OMP)

Antigen OMP S typhi merupakan bagian dinding sel yang terletak di luar

membran sitoplasma dan lapisan peptidoglikan yang membatasi sel terhadap

lingkungan sekitarnya. OMP ini terdiri dari 2 bagian yaitu protein porin dan

protein nonporin. Porin merupakan komponen utama OMP, terdiri atas protein

OMP C, OMP D, OMP F dan merupakan saluran hidrofilik yang berfungsi untuk

difusi solut dengan BM < 6000. Sifatnya resisten terhadap proteolisis dan

denaturasi pada suhu 85–100°C. Protein nonporin terdiri atas protein OMP A,

protein a dan lipoprotein, bersifat sensitif terhadap protease, tetapi fungsinya

masih belum diketahui dengan jelas. Beberapa peneliti menemukan antigen OMP

S typhi yang sangat spesifik yaitu antigen protein 50 kDa/52 kDa.

Beberapa keterbatasan uji Widal ini adalah (Rudy, 2009):

1) Negatif Palsu

Pemberian antibiotika yang dilakukan sebelumnya (ini kejadian paling

sering di negara kita, demam –> kasih antibiotika –> nggak sembuh dalam 5

hari –> tes Widal) menghalangi respon antibodi. Padahal sebenarnya bisa

positif jika dilakukan kultur darah.

2) Positif Palsu

Beberapa jenis serotipe Salmonella lainnya (misalnya S. paratyphi A, B, C)

memiliki antigen O dan H juga, sehingga menimbulkan reaksi silang

dengan jenis bakteri lainnya (Enterobacteriaceae sp), dan bisa

menimbulkan hasil positif palsu (false positive). Padahal sebenarnya yang

positif kuman non S. typhi (bukan typhoid).

Beberapa penyakit lainnya : malaria, tetanus, sirosis, dll.

Pernah mendapatkan vaksinasi, reaksi anamnestik (pernah sakit), dan

adanya faktor rheumatoid (RF).

ALAT DAN BAHANa. ALAT

Test Slide Aglutinasi

1. Objek glass/ slide berwarna putih

2. Stik pengaduk

3. Mikropipet

4. Yellow tip

5. Pensil lilin

6. Rotator

Test Tabung Aglutinasi

1. Tabung reaksi

2. Pipet volume 1 mL

3. Pipet ukur

4. Rak tabung reaksi

5. Mikropipet 100 mikron

6. Waterbath

7. Label

b. BAHAN

1. Sampel Serum

2. Reagen Febrile-Antigen

Salmonella “O” Group A

Salmonella “O” Group B

Salmonella “O” Group C

Salmonella “O” Group D (Typhoid O)

Salmonella “H” a

Salmonella “H” b

Salmonella “H” c

Salmonella “H” d (Typhoid H)

3. Kontrol serum positif dan negatif

4. Larutan NaCl 0,9%

CARA KERJA

A. Slide test/ testlide aglutinasi

1. Objek glass yang bersih disiapkan dan dibagi menjadi 1,5 inch dengan

pensil lilin. Atau dapat digunakan slide khusus berwarna putih.

2. Serum ditambahkan dengan mikropipet secara berurutan dari kiri ke kanan

sebanyak : 0,08 ml, 0,04ml, 0,02ml, 0,01ml, 0,005ml. Serum harus bersih

dan tidak panas. Prosedur ini diulangi dengan control sera positif dan

negatif.

3. Reagen (suspensi antigen) dihomogenkan perlahan.

4. Suspense antigen diteteskan sebanyak 1 tetes di atas masing - masing

serum tersebut.

5. Serum dan antigen dicampurkan dengan baik menggunakan stik pengaduk.

Stik yang digunakan boleh terpisah untuk masing-masing serum atau dapat

digunakan stik yang sama dan diproses dari kanan ke kiri. Area masing –

masing campuran dibentuk kurang lebih ½ sampai 1 inch.

6. Slide diputar dengan menggunakan tangan atau dengan menggunakan

mesin dengan kecepatan 150 rpm selama 2-3 menit.

7. Aglutinasi yang terjadi diamati di tempat yang terang dengan latar

belakang gelap.

8. Hasil positif akan diketahui titernya, sedangkan hasil negative digunakan

sebagai kontrol.

INTERPRETASI HASIL

Tingkatan aglutinasi

4+ 100% terbentuk aglutinasi

3+ 75 % terbentuk aglutinasi

2+ 50% terbentuk aglutinasi

1+ 25% terbentuk aglutinasi

+ > 25 % terbentuk aglutinasi

- Tidak ada aglutinasi yang terbentuk

Walaupun test slide tidak direkomendasikan untuk menentukan titer, namun

jumlah serum yang memberikan hasil 60% aglutinasi kira-kira dapat digunakan

untuk menentukan titer dari serum. Penurunan jumlah serum pada slide test kira-

kira sebanding dengan pengenceran pada test tabung, seperti dibawah ini :

Volume serum Pengenceran pada test tabung

0,08 mL 1:20

0,04 mL 1:40

0,02 mL 1:80

0,01 mL 1:160

0,005 mL 1:320

B. Tube test/ tes tabung aglutinasi1. 10 tabung yang berukuran 12 x 75 mm ditempatkan pada rak yang sesuai.

2. 1,9 ml larutan NaCl 0,9 % ditambahkan ke dalam tabung pertama.

3. 1,0 ml larutan NaCl 0,9% ditambahkan ke dalam sisa tabung.

4. 0,1 ml serum yang akan ditest ditambahkan pada tabung pertama dan

dihomogenkan. Lalu dipindahkan 1,0 ml serum yang telah diencerkan dari

tabung pertama ke tabung kedua. Prosedur ini diulangi sampai sepuluh

tabung mengandung pengenceran serum kelipatan dua dari 1:20 sampai

1:10.240. 1,0 mL serum yang diencerkan dari tabung no 10 dibuang.

Tabung no 1 dianggap pengenceran 1:20. Prosedur ini diulangi dengan

kontrol sera positif dan negatif.

5. Satu tabung ditempatkan pada akhir dari deretan tabung pengenceran dan

ditambahkan 1,0 ml larutan NaCl 0,9% untuk mengencerkan serum.

Kemudian diberi label pada tabung untuk “saline control”

6. Suspensi antigen dihomogenkan dengan mengocok botolnya secara

perlahan. Satu tetes antigen diteteskan pada masing – masing tabung.

7. Rak dikocok untuk mencampur antigen dan serum dan ditempatkan pada

waterbath. Waktu dan suhu inkubasi yang disarankan adalah sebagai

berikut:

Antigen Suhu Waktu inkubasi

Salmonella “O” Group A450 - 500 C

18 jam

Salmonella “O” Group B 450 - 500 C 18 jam

Salmonella “O” Group C 450 - 500 C 18 jam

Salmonella “O” Group D (Typhoid O) 450 - 500 C 18 jam

Salmonella “H” a 450 - 500 C 2 jam

Salmonella “H” b 450 - 500 C 2 jam

Salmonella “H” c 450 - 500 C 2 jam

Salmonella “H” d (Typhoid H) 450 - 500 C 2 jam

Brucella abortus and Brucella

Meltonois

370 C 48 jam

Proteus OX2, OX19, OXK 450 - 500 C 18 jam

8. Setelah inkubasi , rak yang berisi tabung test dipindahkan dengan perlahan dan

diamati aglutinasinya. Untuk hasil yang optimal, pengamatan dilakukan di

tempat yang terang dengan latar belakang gelap.

9. Hasil yang diperoleh dicatat, sebagai berikut :

4+ 100% gumpalan sempurna dibagian bawah tabung, dan cairan

supernatannya bersih

3+ 75% terdapat gumpalan pada dasar tabung, cairan supermatan sedikit

keruh

2+ 50% terdapat gumpalan pada dasar tabung, cairan supermatannya

agak keruh

1+ 25% terdapat gumpalan pada dasar tabung, cairan supermatannya

keruh

- Tidak terdapat gumpalan dan campuran keruh.

10. Hasil titer dari serum yang reaktif dicatat sebagai pengenceran terakhir yang

memberikan reaksi +2.

DAFTAR PUSTAKA

Rahmat.2012. Test Widal Slide.

http://kumpulanmateridiiianaliskesehatan.blogspot.com/2012/05/test-

widal-slide.html (diakses: 11 Maret 2013)

Musyaffa, Ripani. 2010. Widal dan Typhoid Fever.

http://ripanimusyaffalab.blogspot.com/2010/02/widal-dan-typhoid-

fever.html. (diakses : 13 Maret 2013)

Risnawati.2012. Pemeriksaan Imunoserologi. http://Risnawati-

Hapilu.Blogspot.Com/2012/05/Pemeriksaan-Imunoserologi.Html.

(diakses : 13 Maret 2013)

Rudy.2009. Widal Test. http://rudy-infokesehatan.blogspot.com/2009/07/widal-

test.html . (diakses : 13 Maret 2013)

Sutrimo.2013. Uji Widal.

http://analiskesehatankendariangkatan5.blogspot.com/2013/01/uji-

widal.html(diakses: 11 Maret 2013)

Wiki. Tt. Widal. http://id.wikipedia.org/wiki/Widal (diakses: 13Maret 2013)