BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak

berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Pada kebanyakan analisis

meliputi pengambilan cuplikan,pemisahan senyawa penganggu isolasi senyawa

yang dimaksudkan,pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan

pengukuran. Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan

teknik paling banyak digunakan. Kebanyakan pemisahan kromatografi rutin

dari suatu campuran dikerjakan dalam beberapa menit dengan peralatan yang

relative sederhana.

Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai

digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).

Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an,

kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC)

diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian

diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958.Hasil karya yang baik sekali dari Martin

dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak

hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum

langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas.Pada

tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai

kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960-an kromatografi

gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas

berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer.Waktu analisis lama

dan segala prosedur biasanya sangat membosankan.Pada akhir tahun 1960-an,

semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair

1

sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High

Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi

dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan

dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya

sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat

instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat

ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu

keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

1.2 Pembatasan Masalah

1. metode dan teknik yang digunakan dalam proses pemisahan

2. pengklasifikasian kromatografi

3. prinsip kerja dari setiap pengklasifikasian

2

BAB II

ISI

2.1 Tinjauan Pustaka

Kromatografi Kertas (KKt) dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah cara

yang serupa dalam hal fase diamnya berupa lapisan tipis dan fase geraknya

mengalir karena kerja kapiler. Perbedannya dalam sifat dan fungsi fase diam.

( Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991.)

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi

serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti

kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia

tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga

hal inilah yang menyebabkan pemisahan (K. Hostettmann, M. Hostettmann, A.

Marston.1995)

Kromatografi Gas Cair (KGC)

Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa

dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan

fase diam. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50-350°C)

bertujuan untuk menjamin bahwo solute akan menguap dan karenanya akan

cepat terelusi.

(Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008.)

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih

banyak digunakan.Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-

senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan

adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan

Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam:

Cara kering

Cara basah

3

(Conners.A.K. ”Pharmaceutical Analysis” Solvent Extraction. Kisman .Dr.

Sastro, ddk .1994.)

2.2 PEMBAHASAN

2.2.1 Pengklasifikasian Kromatografi Berdasarkan Macam Fasa Gerak

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan

fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik

kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.

Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya ,yaitu

mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

mudah melaksanakannya

kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

Resolusi yang baik

dapat digunakan bermacam-macam detektor

Kolom dapat digunakan kembali

mudah melakukan "sample recovery"

Komponen-komponen penting dari KCKT

Fasa gerak

4

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah

salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang

sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat

umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang

karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal

biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang

sangat penting. Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama

untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump)

sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi.

Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang

besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the

data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila

menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom

berikatan dengan NH2).

Keuntungan KCKT

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan

kromatografi cair klasik, antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat

diselesaikan sekitar 15-30 menit.Untuk analisis yang tidak rumit

(uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.

5

Resolusi : Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;

pemisahan terutama dicapai hanya dengan fasa diam. Kemampuan zat padat

berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada KCKT

memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam

KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari

bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat

mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti

Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan

dalam KCKT

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi

klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis

yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang

diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan

Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa

dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk

menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal

sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT

tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang

diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah

sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan

menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur

khusus.

2. Kromatografi Gas

Sistem kromatografi gas memerlukan sistem tertutup sempurna kecuali

pada tempat keluarnya gas. penyusun utama kromatograf. Gas pembawa dari

6

tangki bertekanan, mengalir melalui pengatur tekanan yang mengatur kecepatan

aliran gas dalam alat itu. Cuplikan dimasukkan ke dalam suatu kamar pemanas

melalui sekat karet silicon dengan syringe jika cuplikan berupa cairan atau jika

cuplikan berupa gas digunakan katup khusus untuk cuplikan itu. Dari sini gas

pembawa membawa cuplikan melalui kolom dimana mereka dipisahkan dan

kemudian melalui detektor yang mengirim isyarat ke pencatat. Kolom perlu

dipanasi pada suhu tertentu, demekian juga tempat injeksi dan detektor.

Pemasukan cuplikan. Seperti kromatografi lainnya, hal yang penting

adalah memasukkan cuplikan itu dalam waktu sesingkat mungkin dan volume

sekecil mungkin. Kamar cuplikan dipanasi untuk sekitar 20m2/g, tetapi mudah

pecah dan penuh pengotor. Dalam salah satu cara pembuatannya, tanah diatome

dicampur dengan tanah liat dan dipanasi pada 9000C. kemudian digiling dan

dipisahkan sesuai ukurannya. Bahan ini menjadi mempunyai luas permukaan

sekitar 4m2/g. Permukaannya aktif tehadap senyawa polar berwarna kemerah-

merahan, karena itu dinamakan Chromosorb-P. pada cara pembuatan lain,

bahan mentah dicampur dengan kalium karbonat sebelum dipanasi. Bahan jadi

ini lebih mudah pecah, secara kimiawi kurang aktif, luas permukaaan sekitar

0,5-1 m2/g dan berwarna putih, sehingga dinamakan Chromosorb-W.

Gugus OH bersifat asam dan agak polar, dan cenderung bereaksi dengan

senyawa polar, terutama dengan gugus fungsi basa. Aktifitas permukaan dapat

dikurangi dan beberapa pengotor dihilangkan dengan dicuci dengan asam atau

basa. Untuk pemisahan amina, lebih disenangi melapisi dengan lapisan natrium

hidroksida pada permukaan. Perlakuan efektif dengan silanisasi permukaan

dengan heksametil disizalan (HMDS):

OH OH Me

Si O Si + (Me3Si2)NH Me Si Me

7

O

Si O Si

O

Me Si Me

Me

Dalam hal ini gugus OH yang polar diganti dengan gugus trimetisilil

yang relative inert. Mempercepat penguapan cuplikan cair dan dibuat

sedemikian rupa sehingga gas pembawa membawa cuplikan langsung ke dalam

kolom. Jika hal ini terjadi, cuplikan tidak menyebar sebelum proses pemisahan.

Pada beberapa kromatograf, cuplikan diinjeksikan langsung kedalam kolom

pada masukan. Cara ini lebih cocok untuk cuplikan yang mudah menguap.

Gambar 2.2 Bagian utama kromotograf

Jumlah yang dimasukkan ditentukan oleh beberapa factor,yaitu jumlah

cuplikan yang diperoleh, kapasitas kolom dan kepekaan detektor

Pada umunya untuk cuplikan cair diperlukan 0,1 sampai 10 ul dan untuk

cuplikan gas antara 1 sampai 10 ml. kolom kapiler memerlukan cuplikan lebih

kecil 10-3 sampai 10-2 ul.

- Fasa Diam

8

a. Padatan pendukung

Padatan pendukung yang ideal untuk kromatografi gas belum diperoleh.

Padatan pendukung itu idealnya mempunyai luas pemukaan tinggi (1 m2-/g) dan

inert, tetapi dapat dibasahi oleh fasa cair yang dapat melapisi sebagai lapisan

tipis yang seragam. Padatan pendukung itu juga harus tahan panas, cukup kuat

dan mempunyai ukuran sama, hampir bulat.Sebagai padatan pendukung yang

lebih banyak digunakan adalah turunan tanah diatome. Bahan mentah ini

mempunyai luas permukaan.Teflon serbuk digunakan sebagai padatan

pendukung untuk senyawa terlarut yang sangat polar, tetapi bahan ini

mempunyai luas pemukaan rendah. Karena sangat inert sehingga sukar

melapisinya. Padatan pendukung lainnya adalah butiran gelas mikro dan

karbon.

b. Fasa cair

Penggunaan yang luas dari kromatografi gas cair disebabkan oleh

adanya banyak macam fasa cair yang dapat digunakan sebagai fasa diam.Fasa

cair yang baik adalah :

1. Tidak mudah menguap (tekanan uap kurang dari 0,1 torr) pada suhu pemisahan.

2. Tahan panas

3. Mempunyuai harga K yang sesuai dengan senyawa yang dipisahkan tidak

terlalu kecil dan tidak terlalu besar

4. Dapat digunakan ulang

5. Inert tehadap senyawa yang dipisahkan atau jika bereaksi harus cepat dan

bolak-balik

Beberapa fasa cair yang biasa digunakan diberikan dalam Tabel berikut

Fasa cair Jenis cuplikan Polaritas Suhu

maks

9

(0C)

Squalane

Apiezon L

Metil silicon

Dionil ptalat

Minyak

silicon

Dietilenglikol

suksinat

Carbowax

20M

Resina

poliamid,

-Oksidipro-

pionitril

AgNO3 da-

lam propilena

glikol

Hidrokarbon

Hidrokarbon

titik didih tinggi,

ester,eter

Steroida, pestisida,

Alkaloida,ester

Semua jenis

Semua jenis

Ester

Alkohol, amina,

Aromatic, keton

Senyawa amino

Olefina, alcohol

Olefina,

hidrokarbon lingkar

N

N

N

I

I

P

P

P

P

P

125

300

300

175

275

200

250

300

100

50

N = nonpolar, I = agak polar, P= polar

Fasa Gerak

Sesuai dengan namanya kromatografi gas, sebagai fasa gerak digunakan

gas. Gas pembawa yang biasa digunakan adalah helium, nitrogen, hydrogen,

dan argon. Gas pembawa ini relative inert, tidak mahal, dan tidak beracun.

10

Hydrogen mudah terbakar, karenanya perlu perhatian keselamatan kerja yang

memadai. Karena gas itu inert, maka interaksi antara molekul cuplikan dan

molekul gas dapat diabaikan, kecuali pada tekanan tinggi. Koefisien distribusi

suatu senyawa ditentukan oleh kemudahan menguap fasa diam. Pemilihan gas

pembawa biasanya didasarkan pada kemurniannya atau kecocokannya dengan

detektor. Misalnya detektor penghantar panas paling cocock dengan hydrogen

atau helium. Untuk kebanyakan hal helium merupakan pilihan pertama.

Kemurnian gas pembawa sangat penting karena pengotoran sedikit saja dalam

gas itu dapat menimbulkan kebisingan pada isyarat detektor. Karenanya gas

pembawa sebelumnya perlu dialirkan melalui penyaring molekul untuk

menghilangkanuap air yang biasanya terdapat dalam gas pembawa.

Aliran dalam kolom disebabkan oleh perbedaan tekanan antara masukan

dan keluaran. Tekanan masukan , Pi, 10-15 psig (pound per inchi pesegi).

Tekanan keluaran, P0, adalah tekanan atmosfer normal. Pada banyak alat

pengatur aliran mengatur Pi pada kecepatan alir tetap, tetapi pada kebanyakan

alat, Pi dianggap tetap.

Detektor

Hasil pemisahan di dalam kolom harus dilihat dan dicatat. Semua

senyawa terdapat dalam keadaan sangat encer dalam gas pembawa. Kemudian

kurang dari satu detik suatu puncak melalui detektor, sedangkan puncak terakhir

dapat muncul setelah satu jam pemisahan dan akan muncul sebagai suatu pita

lebar di atas garis dasar. Karena itu detektor harus tidak memberikan tanggapan

terhadap cuplikan yang terdapat dalam jumlah kecil.

Detektor universal belum ditemukan. Persyaratan detektor, yaitu :

1. batas deteksi rendah

2. tanggapan linier pada rentang kadar lebar

11

3. tanggapan seragam terhadap semua senyawa

4. kalibrasi sederhana

5. waktu tanggapan pendek

6. volume dalam kecil

7. bisingan rendah

8. stabil dan detektor itu harus sederhana

9. murah dan aman

Macam-macam Detektor.

Detektor dapat dikelompokkan sebagai detektor diferensial mengukur

kadar senyawa seketika itu juga atau kecepatan alir seketika itu juga. Detektor

integral menambahkan isyarat seketika itu juga dan memberikan jumlah total

dan biasanya digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan isyarat detektor

diferensial untuk analisis kuantitatif.

Gambar 2.3 Respon diferensial dan integral dari kromotograf yang sama

Detektor dapat dikelompokkan sebagai detektor merusak dan tidak

merusak tergantung apakah senyawa cuplikan itu berubah atau tidak.

Detektor diferensial paling banyak digunakan pada Gas

Chromatography dan termasuk berikut :

12

1. Flame Ionization Detector (F.I.D.)

2. Thermal Conductivity Detector (T.C.D.)

3. Electron Capture Detector (E.C.D.)

4. Thermionic Spesific Detector N, P spesific (T.S.D.)

A. Thermal Conductivity Detector (T.C.D.)

Thermal conductivity detector didasarkan pada prinsip bahwa suatu

badan yang panas akan melepaskan panas pada suatu tingkat yang tergantung

pada komposisi dari lingkungan sekitarnya. Kebanyakan thermal conductivity

detector berisi kawat logam yang dipanaskan secara elektrik dan menjulang

pada aliran gas. Ketika suatu unsur yang asing diperkenalkan ke dalam ,

temperatur dari kawat dan karenanya maka resistan kawat akan berubah.

Masing-masing unsur mempunyai konduktivitas termal berbeda yang

mengijinkan pendeteksian nya di aliran gas. Resistan elektrik adalah secara

normal diukur oleh Wheatstone brigde circuit.

Sensitivitas Thermal Conductivity Detector dinyatakan dalam

persamaan berikut dengan parameter berikut :

Dimana :

S= sensitivitas

K= konstanta cell bergantung pada geometri

I= arus filemen

13

R= resistan filamen

?c= konduktivitas termal gas pembawa

?s= konduktivitas termal gas sampel

Tf = temperatur filamen

Tb = temperatur blok detektor

Untuk meningkatkan sensitivitas detektor T.C.

1. Meningkatkan arus filamen

2. Menurunkan temperatur blok

3. Memilih gas pembawa yang memiliki konduktivitas termal tinggi

4. Mengurangi laju aliran (harus konstan)

1. Sensitivitas (Minimum Detectable Quantity)

Batas lebih rendah yang layak ialah 10-7 hingga 10-8 g. Hal ini

mengasumsikan laju aliran kecil, dan puncak lebih awal dan tajam. Ini

sensitivitas menengah karena ionization detectors akan jauh lebih sensitif.

Bahkan dengan ukuran sampel besar, 10 hingga 25 μl kita biasa membicarakan”

paling baik pada MDQ 50-100 ppm “.

2. Kisaran Linier

Detektor TCD memiliki linear range sekitar 10-4. Ini merupakan range terbatas,

tetapi sangat berguna pada konsentrasi yang jauh lebih tinggi dibandingkan

FID.

3. Selektivitas

14

Detektor TCD adalah universal, memberi respon terhadap semua

senyawa kecuali gas pembawa itu sendiri. Digunakan secara luas untuk gas-gas

ringan dan yang telah ditetapkan. Karena detektor FID tidak menghasilkan

sinyal dengan sampel-sampel tersebut, maka juga digunakan untuk analisa air

dan senyawa anorganik.

4. Persyaratan

Detektor TCD memerlukan pengatur temperatur yang baik, pengatur

aliran yang baik, gas pembawa murni dan power supply yang teratur.

Detektor Ionisasi

Sejumlah besar detektor dalam kromatografi gas diklasifikasikan

sebagai Ionization Detectors. Dalam ionization detectors, konduktivitas elektrik

dari gas diukur pada kehadiran komponen analit. Konduktivitas elektrik dapat

meningkat sebagi hasil dari analit yang terionisasi dalam aliran gas atau

menurun sebagai hasil dari analit yang menyerap elektron dari gas yang

terionisasi.

B. Flame Ionization Detector (F.I.D.)

Pada F.I.D, sumber ionisasi adalah pembakaran biasanya berasal dari

hidrogen dan udara atau oksigen. Untuk sensitivitas maksimum kondisi

pembakaran memerlukan optimisasi. Untuk menentukan volume gas yang tidak

tertahan (waktu gas yang tertahan mis: puncak udara) digunakan methane

selama detektor tidak sensitif terhadap udara. FID ini sempurna dan mungkin

merupakan detektor yang paling banyak digunakan. Bersifat sensitif dan

digunakan secara ekstensif dengan kolom kapiler.

15

1.Sensitivitas (Minimum Detectable Quantity)

Beberapa perusahaan pembuat menunjukkan kromatogram dari 10-10,

bahkan 10-11 g untuk hidrokarbon sederhana. Ini merupakan detektor yang

sangat sensitif untuk senyawa organik, tetapi quantitas minimal yang dapat

terdeteksi dari beberapa sampel sebenarnya pada temperatur tinggi mungkin

mendekati 10-9 g.

2. Kisaran Linier

Dalam beberapa kasus parameter detektor yang dioptimalkan

sensitivitasnya (laju aliran hidrogen, laju aliran udara, diameter jet, dll) tidaklah

optimal untuk sampel berukuran besar. Linear range akan bergantung pada

sampel; kita jarang menemukan linear range lebih besar dari10-4 untuk steroids

atau beberapa obat-obatan. Ini merupakan fungsi dari zat pencemar sampel,

adsorpsi kolom seperti halnya karakteristik detektor.

Gambar 2.5. Detektor FID

16

3. Selektivitas

FID akan memberi respon hanya terhadap senyawa organik, tidak pada

udara atau air atau gas ringan yang telah ditetapkan. Pada senyawa-senyawa

organik, selektivitas sangat kecil.

4. Persyaratan Operasional

FID memerlukan tiga persediaan gas bersih, hidrogen, udara dan gas

pembawa. Harus ada elektrometer untuk menguatkan sinyal yang sangat kecil

yang dihasilkan dari pembakaran. Harus dipanaskan untuk menghindari

kondensasi air atau fase cair dari kolom

C. Electron Capture Detector (E.C.D.)

Electron Capture Detector (E.C.D.) beroperasi pada prinsip electrons

attachments oleh molekul analit. Nitrogen sebagai gas pembawa mengalir

melalui detektor dan terionisasi oleh sumber elektron biasanya tritum yang

teradsorbsi pada Titanium atau Scandium (TiH3, ScH3) atau Nickel 63 (Ni63).

Nitrogen terionisasi akan membentuk arus antar elektroda-elektroda.

Analit tertentu masuk ke detektor akan bereaksi dengan elektron-

elektron untuk membentuk ion negatif.

R- X + e  →  R- X –

17

Pada saat ini terjadi, arus akan berkurang sebagai respon negatif.

Detektor akan sangat sensitif terhadap molekul yang mengandung atom-atom

elektronegatif. ( N. O, S, F, Cl)

Gambar 2.6 Detektor ECD

Detektor dapat dioperasikan dalam D.C. maupun mode pulsa dengan 1

us 50v. Mode pulsa terjadi pengumpulan elektron-elektron yang bergerak bukan

ion negatif yang lebih lambat dan lebih berat, untuk menghasilkan sensitifitas

yang lebih besar.

Electron capture detector sangat sensitif terhadap molekul tertentu,

yaitu : Alkil halide,Conjugated carboxyl,Nitrit,Nitrat dan Organometals. Tetapi

tidak sensitif terhadap : Hydrocarbons,Alcohols dan Ketones

Sebagai akibat dari sensitivitasnya terhadap alkil halida, ECD ini telah

digunakan secara ekstensif dalam analisa pestisida dan obat-obatan dimana alkil

halida telah diderivatisasi. Pestisida tertentu telah terdeteksi pada sub picogram

level. Karena tingginya sensitivitas, ECD ini telah digunakan secara ekstensif

pada kolom kapiler.

18

1. Sensitivitas

Bergantung pada jumlah, jenis dan posisi kehadiran atom elektronegatif,

ECD dapat mendeteksi 10-9 hingga 10-12 g. Untuk beberapa pestisida ini

merupakan detector yang sangat sensitif. ECD memiliki linear range 102 hingga

103. Hal ini memerlukan penggunaan kurva kalibrasi, sering dibersihkan dan

teknik analisa yang baik jika mengharapkan hasil kuantitaif.

2. Selektivitas

ECD sangat selektif. Hampir semua senyawa organik tidak merespon,

dan responnya yang tinggi terhadap senyawa terpilih (pestisida) membuat ECD

menjadi detektor sempurna untuk trace analysis.

3. Persyaratan

Sumber-sumber radioaktif digunakan (kecuali Beckman) untuk

mengawali respon ionisasi. Hal ini memerlukan ijin AEC di USA dan tindakan

pencegahan khusus pada saat membersihkan atau mengganti detektor. Gas

pembawa yang sangat bersih sangat dibutuhkan dan dalam model plat paralel

gas pembawa khusus dan pulsed power supply sangat dianjurkan. Kalibrasi

yang ekstensif dan kontinyu (terus-menerus) perlu dilakukan untuk

mendapatkan hasil kuantitatif

D. Thermionic Spesific Detector untuk Nitrogen dan

Phosphorus

Dengan mengoperasikan flame ionization detector pada temperatur lebih

rendah dan memasukkan atom-atom logam alkali ke dalam resulting plasma,

maka detektor dapat dibuat selektif terhadap nitrogen dan phosphorus.

19

Gambar 2.7 Detektor TSD

Versi modern dari detektor, Thermionic Spesific Detector untuk

Nitrogen dan fosfor menggunakan ujung keramik yang dipanaskan secara

elektrik yang terdiri dari logam alkali-Rubidium yang dioperasikan dalam

lingkungan hidrogen-udara. Sebuah potensial dipasang pada sistem dan

menghasilkan arus yang sebanding dengan konsentrasi nitrogen atau fosfor

yang ada. Mekanisme yang pasti pada operasional ini masih belum jelas.

Thermionic Spesific Detector digunakan secara ekstensif dalam analisa obat-

obatan dan pestisida.

Linear Range

20

6. Pengaruh Suhu

Ada tiga tempat dalam kromotograf di mana suhu harus dikontrol.

Pertama, suhu tempat injeksi menentukan kecepatan cuplikan diuapkan. Tempat

injeksi diatur pada suhu agak tinggi, untuk cuplikan yang tidak terurai kena

panas, biasanya sekitar 500C di atas titik didihnya. Hal ini diperlukan supaya

semakin cepat cuplikan masuk ke dalam kolom dalam volume sanagt kecil.

Kedua, detektor harus cukup panas sehingga penyusun cuplikan tidak

mengembun di situ. Tetapi kepekaan detektor penghantar panas menurun sesuai

dengan penurunan suhu, sehingga suhu optimum dipilih sedikit di atas suhu

kolom.

Akhirnya suhu kolom itu sendiri merupakan faktor penting yang

menentukan resolusi dan retensi. Pada suhu tinggi, senyawa-senyawa yang

dipisahkan akan cenderung ke fasa gas karena penurunan kelarutan. Senyawa-

senyawa itu akan keluar cepat dan berhimpitan-resolusi jelek. Pada suhu

rendah, senyawa-senyawa itu cenderung lebih senang ke fasa cair, akan

teresolusi lambat dan biasanya resolusi menjadi lebih baik

2.2.2 Pengklasifikasian Berdasarkan Pasangan Fasa Gerak dan Fasa Diam

1. Kromatografi Cairan Padat

Metode kromatografi ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan

organik. Teknik pelaksanaanya dilakukan dengan kolom kaca,dimana fasa diam dapat

dipilih silica gel atau alumina

2. Kromatografi Cairan-Cairan

Kromatogafi cairan-cairan (KCC) adalah kromatografi dengan fasa

gerak berupa cairan dan fasa diam juga berupa cairan yang merupakan lapisan

tipis pada padatan pendukung. KCC lebih efisien daripada penyarian berulang

kali. Hal ini disebabkan oleh permukaan luas antara fasa gerak dan fasa

diam,dengan cepat dicapai distribusikeseimbangan senyawa terlarut antara dua

21

fasa tersebut. KCC dapat digunakan terhadap jenis cuplikan yang luas,polar

dan non polar. Dasar dari penggunaan yang luas ini adalah variasi yang luas dari

fasa gerak dan fasa diam yang digunakan. Keuntungan utama dari KCC adalah

kemampuan membuat kolom yang dapat reprodusibel. Cuplikan jarang berubah

selama pemisahan karena padatan pendukung relative inert dan pada umumnya

pemisahan dilakukan pada suhu kamar.

Ada 2 macam penggunaan KCC. Pertama padatan pendukung dipenuhi dengan

fasa diam polar dan sebagai fasa gerak digunakan pelarut relative nonpolar.

System ini digunakan pemisahan senyawa polar karena senyawa itu lebih

tertahan oleh fasa diam polar. Untuk senyawa non polar digunakan fasa diam

yang kurang polar,sistem ini dinamakan kromatografi cairan-cairan fasa

terbalik.Dalam KCC digunakan padatan pendukung yang relative inert. Bahan

itu mempunyai luas permukaan rendah dan mengandung pori-pori relative besar

yang akan mengurangi penyerapan pendukung.Walaupun KCC dengan fasa

diam cair memberikan mekanisme pemisahan yang unik dan reprodusibel,suatu

yang sukar adalah menjaga supaya kondisi tetap dalam waktu yang lama. Waktu

yang hidup yang pendek dan harga kolom dapat merupakan kendala dari system

KCC. Kolom dapat digunakan untuk pemisahan berkali-kali jika beberapa

kesulitan pokok dapat diantisipasi dan dikontrol.Kolom dengan fasa terikat

dapat digunakan terus menerus selama beberapa bulan tanpa terjadi perubahan

pada karakternya. Bahan fas terikat ini digunakan dengan beberapa macam

gugus fungsi dan digunakan untuk pemisahan berbagai macam senyawa. Fasa

diam dengan polimer silicon terikat secara kimia dapat digunakan dengan

perubahan besar pada fase gerak tanpa takut terurai.

Ada 4 teknik untuk melapisi cairan pada padatan pendukung KCC dan masing-

masing mempunyai keuntungan untuk penggunaan tertentu. Kebanyakan teknik

untuk fasa diam terikat secara mekanik pada pendukung adalah cara penguapan

pelarut. Pada teknik ini fasa diam yang tidak mudah menguap dilapiskan pada

pendukung dengan bantuan pelarut yang mudah menguap. Kolom KCC yangb

22

efisien dapat juga dibuat dengan cara pelapisan in situ. Pelapisan pendukung in

situ dapat dilakukan dengan suatu teknik,misalnya jika fasa dia mempunyai

kekentalan cukup rendah dapat dilapiskan langsung pada struktur berpori dari

pendukung yang telah dimasukkan dalam kolom. Teknik ini efektif pada

pembuatan kolom dengan system tiga cairan terdiri dari etanol dan 2,2,4-

trimetilpentana. Dua cara yang telah digunakan untuk melapiskan cairan fasa

diampada pendukung. Pada cara pertama,fasa gerak dijenuhi dengan fasa diam

yang dipompakan melalui kolom yang baru saja dibuat untuk menghilangkan

udara. Diikuti fasa diam diinjeksikan ke dalam kolom,maka struktur berpori dari

pendukung diisi dengan fasa diam. Pada cara kedua,fasa diam dipompakan

melalui kolom kering. Kolom itu kemudian dialiri fasa gerak yang setara

denagn fasa diam, yamg kan menghilangkan kelebihan cairan fasa diam pada

celah antar partikel. Dua teknis ini efektif untuk cairan fasa diam yang tidak

kental.

Untuk cairan fasa diam yang kental,fasa diam dilarutkan dalam pelarut yang

cocok kemudian dipompakan ke dalam kolom yang baru saja dibuat. Dengan

fasa diam kental,kadang-kadang perlu mengalirkan fasa gerak melalui kolom

yang dilapisi secara in situ selam beberapa jam untuk menghilangkan kelebihan

fasa diam yang terdapat diantara partikel pendukung. Menaikkan kekentalan

fasa gerak akan membantu proses ini. Keuntungan praktis yang nyata dari

system pelapisan in situbahwa kolom dapat dilapisi ulang beberapa kali sebelum

diganti.suatu kolom yang sudah tidak dapat digunakan,fasa diamnya dapat

dihilangkan dari pendukung dengan mengalirkan pelarut yang cocok misalnya

diklorometana,dan kemudian pendukung dilapisi lagi dengan fasa diam secara

in situ.

Ada beberapa hal dari fasa gerak yang harus dipertimbangkan jika menyusun

system KCC. Pertama,fasa gerak harus tidak bercampur dengan fasa diam.

Terutama fase gerak sebaiknya mempunyai kekentalan serendah mungkin untuk

mendapatkan efisiensi kolom yang tinggi. Detector dapat juga membatasi fasa

23

gerak yang digunakan. Misalnya pelarut yang mnyerap kuat dalam ultraviolet

sebaiknya dihindari jika digunakan detector fotometri ultraviolet.

Harga,toksisitas,kemurnian dan stabilitas dari suatu pelarut dapat juga sebagai

bahan pertimbangan. Yang paling penting adlah selektivitas system cairan-

cairan untuk cuplikan tertentu.

3. Kromatografi Gas Padat

Digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Pada waktu dulu teknik

ini tidak berkembang karena keterbatasannya yang sama seperti halnya

kromatografi cairan-padat,tetapi penelitian lebih lanjut dengan macam fasa

padat baru memperluas penggunaan teknik ini.

4. Kromatografi Gas Cair

Merupakan metode pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Teknik ini

telah menyebabkan revolusi dalam kimia organic,sejak dikenalkan pertama kali

oleh James dan Martin pada 1052. Hambatan yang paling utama adalah bahan

cuplikan harus mempunyai tekanan uap paling tidak beberapa torr pada suhu

kolom. System ini sangat baik sehingga dapat dikatakan sebagai metode pilihan

dalam kromatografi karena dapat memisahkan dengan cepat dan peka.

2.2.3 Pengklasifikasian Berdasarkan Mekanisme Pemisahan

1. Kromatografi Adsorpsi

Adsorpsi adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh

daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak

sama.Menggunakan fasa diam berupa zat padat dan fasa gerak berupa zat cair

atau gas.Dalam cara ini zat terlarut diadsorpsi pada permukaan partikel padat.

Contoh kromatografi adsorpsi ini yaitu berupa kromatografi lapis tipis(KLT).

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran

senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang

menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan

bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan

24

untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida –

lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT

juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis

fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara

kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk

pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan

lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan

pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat.

Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis

silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau

plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam

untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana

dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut

atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan

warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan

dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning. Pelaksanaan

kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang merupakan

sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.

Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran,

pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-

senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh

oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan

dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis,

sebelum mengalami proses penguapan.

Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

25

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rf= jarak yang ditempuh oleh komponen

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm

dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk

komponen berwarna merah menjadi:nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap

warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna merah selalu

adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan

sebagainya), nilai tersebut akan berubah.

c. Mengidentifikasi senyawa-senyawa

1. Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis

a. Fase diam-jel silica

Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon

dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun,

pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada

26

permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini

menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat

membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya,

sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam

lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom

aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan

tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.

b. Fasa gerak

Pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan jel silica, alumina

dan fasa diamnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom

serapan. Sistem tak berair paling banyak digunakan dan contoh pelarut organic

dalam seri pelarut miksotrop diberikan dalam table yang meliputi (sifat hidrofob

menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asestat, eter, klorofrom (perlu

diperhatikan pada klorofrom yang distabilkan dengan etanol) benzene,

silokheksana, an eter petroleum. Kelompom seri pertama untuk pemisahan

senyawa hidrofil, sedangkan kelompok pelarut seri kedua untuk pemisahan

senyawa lipofil.

Jika sebagai fasa gerak digunakan system pelarut campuran, pada

lapisan fasa diam susunan pelarut itu dapat mengalami perubahan sedikit demi

sedikit. Hal ini akan menghasilkan kedapat-ulangnya agak jelek. Oleh

karenanya system dua pelarut lebih disenangi. Hal yang mempengaruhi kualitas

pemisahan dan kedapat-ulangnya adalah kejenuhan bejana pengembang.

Seri pelarut miksotrop

Air

Formamida

Metanol

n- Amil

alkohol

Etil asetat

27

Asam asetat

Etanol

Isopropanol

Aseton

n-propanol

tert-butanol

Fenol

n-Butanol

Eter

n-Butil asetat

Kloroform

Benzena

Toulena

Sikloheksana

Eter

petroleum

Petroleum

Minyak

parafin

c. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan

melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis

dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan

kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada

lempengan, tergantung pada: • Kelarutan senyawa dalam pelarut. • Senyawa

melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Senyawa yang dapat membentuk

ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa

lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah.

Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang

lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi

pada permukaan. Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan

yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini

tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara

28

senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan

mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari

permukaan silika.

Penyerapan pada kromatografi lapis tipis bersifat tidak permanen,

terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada

permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas

senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut

dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu

proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti

bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke

atas lempengan.

2. Kromatografi Partisi

Partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan

pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya

sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang

berbeda-beda yang menyebabkan terjadi pemisahan.

Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang

tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan

yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair

(LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada

kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu

pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak

dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi

cair cair (LLC). Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat

lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan

secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut

kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan

29

cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi

partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari

fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase

diam.Didasarkan pada partisi zat terlarut antara dua pelarut yang tidak

bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dan fasa gerak berupa zat

cair atau gas. Contoh kromatografi partisi yaitu berupa kromatografi kertas

(KKt).

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode untuk identifikasi

komponen kimia dari suatu campuran zat dengan bantuan perbedaan sifat fisik

masing-masing komponen. Kromatografi digunakan untuk memisahkan

campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh

bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama. Seluruh bentuk

kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan) dan fase gerak

(cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa

komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen

yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda.

Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap. Fase gerak

adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Adsorben (penyerap) dalam

kromatografi kertas adalah kertas saring yaitu selulosa. Cairan fase bergerak

yang biasanya berupa campuran dari pelarut organik dan air, akan mengalir

membawa noda cuplikan yang ditotolkan pada kertas dengan kecepatan

berbeda. Fase gerak (pelarut) dapat beragam, misal: air, etanol, asam asetat,

dll. Kromatografi kertas digunakan baik untuk analisa kualitatif maupun

kuantitatif. Senyawa-senyawa yang dipisahkan kebanyakan bersifat sangat

polar, misalnya: asam-asam amino, gula, atau pigmen-pigmen.

30

L a r u t a n cuplikan atau campuran zat yang akan dipisahkan

ditotolkan pada kertas saring di daerah yang sudah diberi tanda dimana

cuplikan tersebut akan meluas membentuk sebuah noda yang bulat. Setelah

menotolkan cuplikan maka tunggu totolan cuplikan tersebut kering. Diameter

totolan yang membentuk noda tidak lebih dari 0,4 cm. Hal ini dikarenakan

agar noda cuplikan (totolan cuplikan) pada saat dilakukan elusi, setelah

pengeringan tidak menyatu antara noda satu dengan noda yang lain, sehingga

dapat memisah. Setelah noda (totolan cuplikan) kering masukkan atau gantung

kertas dalam bejana tertutup (lemari kromatografi) yang tercelup dalam

pelarut atau eluen yang dipilih sebagai fasa bergerak. Jangan sampai noda

tercelup dalam eluen (pelarut) karena dapat mengakibatkan senyawa yang

dipisahkan akan terlarut dari kertas.

Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler dan

menggerakkan komponen (pita

kromatogram) dalam laju yang berbeda. Bila permukaan pelarut telah

bergerak dengan cukup jauh dan dengan waktu yang ditentukan, maka kertas

diambil dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi tanda lalu kertas

dikeringkan (pengeringan bisa dilakukan dengan hairdryer). Jika senyawa-

senyawa berwarna maka akan terbentuk dan terlihat noda-noda yang terpisah.

Bila senyawa tak berwarna maka harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia.

Cara yang biasa digunakan adalah dengan suatu pereaksi yang memberikan

sebuah warna dari senyawa-senyawa tersebut. Untuk mendeteksi bisa juga

dengan sinar ultra ungu atau teknik radio kimia.

31

Gambar 2.8

Teknik

Kertas dipotong memanjang sesuai ukuran bejana yang akan

digunakan. Kertas yang dipakai adalah kertas Whatmann yang secara

komersial tersedia dalam berbagai macam ukuran dan lembaran. Biasanya

dipakai kertas Whatmann no. 1 dengan kecepatan sedang. Sejumlah cuplikan

ditotolkan menggunakan mikropipet pada jarak beberapa cm dari salah satu

ujung kertas yang sudah diberi garis horisontal dengan pensil. Spot atau noda

yang terbentuk dikeringkan, lalu kertas dimasukkan dalam bejana tertutup

yang sudah dijenuhkan dengan pelarut yang sesuai untuk dikembangkan.

Terdapat tiga metode pengembangan pada kromatografi kertas, yaitu:

Metode penaikkan (ascending)

Prinsipnya: Kertas digantung sedemikian rupa sehingga bagian bawah kertas

tercelup pada pelarut yang terletak di dasar bejana. Noda harus diusahakan

tidak sampai tercelup karena dapat larut dalam pelarut. Pelarut akan naik

melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler yang menggerakkan komponen

dengan jarak yang berbeda-beda.

Metode penurunan (descending)

32

Prinsipnya: Kertas digantung dalam bejana dimana aliran mulai bergerak,

dicelupkan dalam palung kaca yang berisi pelarut. Pelarut bergerak turun

membawa komponen melalui gaya kapiler dan gaya gravitasi.

Metode mendatar (radial)

Kertas dibentuk bulat yang tengahnya diberi sumbu dari benang atau gulungan

kertas. Noda ditempatkan pada pusat kertas kemudian pelarut akan naik

melalui sumbu sehingga membasahi kertas untuk kemudian mengembang

melingkar membawa komponen yang dipisahkan. Bila permukaan pelarut

telah mengembang atau bergerak pada batas tertentu, maka kertas dikeluarkan

dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi tanda lalu kertas dikeringkan.

Jika senyawa yang dipisahkan berwarna maka akan nampak sebagai noda-

noda yang terpisah. Tetapi jika komponen zat tidak berwarna (umumnya

senyawa organik), maka dapat dideteksi dengan cara fisika atau kimia.

Pada cara fisika noda komponen disinari lampu ultraviolet dengan

panjang gelombang 254-370 nm yang akan memberikan fluorescensi. Secara

kimia noda disemprot dengan pereaksi tertentu, sehingga memberikan warna

spesifik. Biasanya untuk mendeteksi asam-asam amino digunakan pereaksi

ninhidrin 0,1 % dalam butanol. Warna akan nampak merah-ungu sekitar 4

menit setelah dipanaskan 100oC. Setelah letak noda komponen diketahui dan

diberi tanda batas harga Rf dapat diketahui.

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi campuran pelarut yang

sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah

garis pada bercak diatasnya. Alasan untuk menutup wadah adalah untuk

meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan dengan uap

pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen

yang berbeda dari campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan

campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.

33

Campuran asam amino akan memisahkan asam amino tertentu yang

terdapat dalam campuran. Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis

dasar kertas, dan dengan cara yang sama ditempatkan asam amino yang telah

diketahui ditotolkan disampingnya. Kertas lalu ditempatkan dalam pelarut

yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Posisi pelarut depan ditandai

dengan pensil dan kromatogram dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan

ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa

berwarna, utamanya coklat atau ungu. Penyemprotan ninhidrin tujuannya

adlah agar bercak noda terlihat dan terbentuk warna sehingga dapat

mengetahui keberadaan asam amino.

3. Kromatografi Penukar Ion

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak

dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari

kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah.

Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik

untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini

digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-

asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.

4. Kromatografi Gel

Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari

zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang

sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn

jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile

phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan

dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai

banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel.

Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex,

34

suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak

keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT.

Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik

ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi,

terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

35

BAB III

KESIMPULAN

Kromatografi dibagi dalam beberapa klasifikasi,yaitu :

Berdasarkan macam fasa gerak terdiri dari kromatografi cair (KCKT) dan

kromatografi gas

Berdasarkan pasangan fasa gerak dan fasa diam terdiri dari kromatografi cairan

padat,kromatografi cairan-cairan,kromatografi gas padat dan kromatografi gas

cair.

Berdasarkan mekanisme pemisahan terdiri dari kromatografi adsorpsi,

kromatografi partisi, kromatografi penukar ion, kromatografi eksklusi/gel

36

DAFTAR PUSTAKA

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi.

Penerbit ITB. Bandung.

J. B. Harbone. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern

Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB. Bandung.

K. Hostettmann, M. Hostettmann, A. Marston. 1995. Cara Kromatografi

Preparatif. Penerbit ITB. Bandung.

Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka

Pelajar. Yogyakarta.

Conners.A.K. ”Pharmaceutical Analysis” Solvent Extraction. Kisman .Dr.

Sastro, ddk .1994. Analisis Farmasi Cet. 2 , Gadjah Mada University Press,

Yogyakarta

Basset, J,  et al. 1994. Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.

Penerbit buku kedokteran EG

C. Jakarta. Day & Underwood. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi Keempat.

Erlangga.   Jakarta.

Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982;

Johnson dan Stevenson, 1978.

Drs. Sudjadi.1988.Metode Pemisahan. Penerbit Kanisius.Yogyakarta

http://wawan-junaidi.blogspot/kromatografi-kertas

http://Annisanfushie`sWeblog/KROMATOGRAFI.KERTAS

37