1. Penyiapan fase gerak (Ahuja & Dong, 2005)

a. Fase gerak dibuat dengan mengukur volume komponen fase gerak secara terpisah

kemudian dicampur menjadi satu. Contoh : fase gerak dengan volume 1 liter

campuran methanol : air (50:50) maka pembuatannya yaitu siapkan 500 ml larutan

methanol dan 500 ml air pada wadah yang terpisah kemudian campur dalam satu

wadah. Pencamourannya bukan 500 ml methanol di-ad-kan 1000 ml air atau

sebaliknya. Hal ini penting karena teknik penyiapan fase gerak akan berpengaruh

pada waktu retensi dan pemisahan senyawa (resolusi) (lebih jelas ada di gambar hal

257 Ahuja & Dong, 2005).

b. Buffer sering digunakan untuk mengontrol pH dari fase gerak dimana akan

mempengaruhi retensi dari analit yang bersifat asam maupun basa. Buffer merupakan

campuran asam lemah dan garamnya atau basa lemah dan garamnya. Buffer

dilarutkan dalam air karena garam larut dalam air. Akan tetapi garam dapat

mengendap di kolom dan mengakibatkan kolom berkerak sehingga setelah selesai

pemakaian kolom harus dicuci dengan air.

Pembuatan buffer sebaiknya mengukur masing-masing volume komponennya dalam

bentuk larutan (molaritas) kemudian baru dicampur. Misal pembuatan buffer fosfat

pH 5,8 yaitu siapkan 50 ml kalium fosfat 0,2 M dan 3,6 ml NaOH 0,2 M. keduanya

dimasukkan dalam labu takar 200 ml kemudian di-adkan sampai 200 ml air (USP 32)

c. Pada HPLC pencampuran fase gerak dan buffer tergantung banyaknya pompa.

Apabila pompanya ada satu maka pencampuran buffer dengan fase gerak di luar alat

(dicampur dulu). Sedangkan apabila menggunakan 2 pompa, maka yang satu untuk

fase gerak dan satunya lagi untuk buffer.

d. Buffer akan mempengaruhi retensi analit yang bersifat asam atau basa (senyawa

netral tidak terpengaruh oleh perubahan pH). Contoh pada sistem RP-HPLC

(Reversed phased-HPLC dengan fase diam non polar) dengan kondisi sistem basa,

maka senyawa asam akan terion sehingga menjadi lebih polar dan akan lebih

berinteraksi dengan fase gerak (elusi menjadi lebih cepat karena senyawa tidak terikat

dengan fase diam). Oleh karena itu, pengaturan pH menjadi penting. Buffer akan

efektif pada rentang pH ± 1 unit dari pKa-nya. Contoh buffer fosfat dengan pKa 7,2

akan efektif untuk PH 6,2-8,2. Larutan buffer tidak boleh pekat, antara 10-20mM

jangan mencapai 50mM karena dapat mengakibatkan endapan di kolom.

e. Sebaiknya buffer digunakan 1-2 hari setelah dibuat dan maksimal 1 minggu, jangan

melebihi 10 hari karena dapat mengakibatkan tumbuhnya bakteri (di dalam buffer ada

air yang merupakan media tumbuh bakteri/mikroba) sehingga dapat merusak kolom.

f. Jangan biarkan buffer tertinggal di kolom akan ada kemungkinan mengendap

(jalankan dengan kecepatan 0,1 ml/min when idling).

g. Apabila dalam komponen fase gerak terdapat buffer, maka pencucian kolom

dilakukan dengan menggunakan air atau 10% asetonitril

h. Asam-asam kuat biasanya tidak digunakan sebagai buffer karena dapat memutuskan

ikatan bonding kolom seperti TFA /trifluoroacetic acid yang mempunyai pKa 0,3

(hati-hati). Asam-asam yang sering digunakan dalam campuran fase gerak yaitu asam

fosfat, asam formiat, asam asetat.

i. Apabila dalam fase gerak mengandung senyawa trietilamin (TEA) sebaiknya kolom

C-18 dicuci dengan campuran methanol : asam fosfat 0,05% (50:50) agar TEA (basa)

dapat terlepas dari residu silanol (tidak masking). Gugus silanol pada kolom C-18

berfungsi untuk berinteraksi dengan bagian polar dari analit. Apabila kolom masking

oleh TEA, analit bersifat polar akan terus terbawa oleh fase gerak dan tidak tertahan

oleh fase diam (waktu retensinya menjadi cepat).

2. Filtrasi atau degassing (Ahuja & Dong, 2005)

a. Larutan jernih secara visual belum tentu bebas dari senyawa pengotor sehingga perlu

filtrasi. Begitu juga dengan fase gerak yang mengandung buffer dan ion pairing

agent, filtrasi harus dilakukan. Fase gerak yang menggunakan solven pro HPLC tidak

perlu difilter karena sudah difilter oleh manufakturnya.

b. Air yang digunakan pada sistem HPLC sebaiknya memiliki konduktivitas yang

rendah. Konduktivitas yang tinggi menandakan adanya pengotor logam (trace metal).

Air ini memiliki mengandung muatan sehingga dapat menghantarkan listrik yang

dapat mengakibatkan tailing (senyawa berikatan dengan logam). Sekarang ada sistem

yang dirancang untuk menghasilkan air untuk HPLC yaitu mili-Q water system for

HPLC. Sistem ini dapat meminimalkan trace logam. Selain konduktivitas air,

parameter lain yang harus diperhatikan yaitu pH dan kontaminan. TOC juga

sebaiknya memiliki angka yang kecil karena dikhawatirkan adanya senyawa organik

dapat berinteraksi dengan senyawa obat (kebanyakan obat senyawa organik) non

polar interaction.

c. Degassing yaitu menghilangkan gas di solven terutama jika pelarutnya air. Adanya

gas dalam solven / pelarut dapat mengakibatkan pump problem yaitu aliran tidak

stabil (unstable flow rate). Sebaiknya pengecekan flow rate 1 minggu sekali untuk

mengetahui adanya masalah pada pompa. Cara degassing yang efektif yaitu dengan

menggunakan in line vacuum degassing (build-in). Apabila belum ada, degassing

dapat dilakukan dengan menggunakan vacuum filtration atau sonikasi. Akan tetapi,

cara tersebut kurang efektif karena dalam beberapa saat akan terjadi re-gass ( oleh

karena sistem tidak tertutup).

3. HPLC-Pump Operating Guides (Ahuja & Dong, 2005)

1. Botol yang digunakan sebaiknya tertutup rapat karena jika tidak akan ada

resiko penguapan yang dapat mengubah komposisi fase gerak terutama yang

mengandung pelarut organik. Botol di-cover dengan parafilm untuk menghindari

evaporasi dan kontaminasi.

2. Setting pressure test yaitu 3500-4000 (set upper limit). Jangan mepet atas,

misal limit atas 4000 psi maka dipakai 3750 -3800 sehingga kolom sudah jenuh

kemudian bisa dinaikkan lagi.

3. Cuci kolom dengan methanol 100% (strong solvent) lalu dialiri dengan fase

gerak selama 5-10 menit sampai baseline dan pressure stabil.

4. Pemanasan kolom bertujuan untuk mengurangi viskositas fase gerak sehingga

alirannya lebih cepat dan menghasilkan peak yang ramping. Pemanasan kolom antara

35-40ºC, kalau melebihi 60ºC dapat melarutkan kolom.

5. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel sebaiknya sama dengan

larutan fase gerak. Apabila tidak campur, dan pelarut sampel solvent strengthnya lebih

besar dari fase gerak maka dapat mengakibatkan pecahnya peak. Oleh karena itu,

sebaiknya sampel yang diinjek sekecil mungkin sesuai minimum injeksi kolom.

6. Pada kolom RP, Fase gerak bisa dimodifikasi dengan air atau THF. Tapi THF

bisa memunculkan radikal jika disonifikasi. PEEK Tubing inkompatibel dengan

DMSO, THF, metilen klorida, dan asam anorganik, dapat menyebabkan PEEK Tubing

meleleh.

4. Maintenance kolom /HPLC-Column operating Guide (Ahuja & Dong, 2005)

a. Simpan kolom dengan mengandung air atau metanol atau campuran air dan pelarut

organik. Jangan sampai kolom mengalami drying out.

b. Kolom dapat di-backflush dengan flow rate yang kecil, tapi ada juga yang tidak. Jika

ada tanda panah berarti tidak bisa di-backflush (tergantung merk dan supplier). Jika

akan di-backflush jangan pada kolom yang sudah ada tanda panahnya atau arah flow-

nya (arrow-nya). Pada saat backflush, gunakan flow rate separuh dari yang biasa

digunakan dan sebentar saja.

c. Pengaturan pH disesuaikan daya kolom terhadap pH (ada di CoA kolom). Jika tidak

ada biasanya pH 2-8 (sebaiknya kolom dilabeli). Jika pH > 8 maka silika akan

melarut, tapi jika pH < 2 maka akan terjadi hidrolisis sehingga kolom rusak (ppt

MANAGEMENT KOLOM HPLC)

d. Masa berlaku kolom sebaiknya didasarkan atas jumlah injek. Injek kolom maksimal

3000 (jangan diregenerasi) dan jangan menggunakan patokan waktu.

e. Untuk pengaturan suhu disesuaikan juga dengan kemampuan kolom. Sebaiknya suhu

di bawah temperature limit kolom.

f. Performance kolom menurun signifikan ditandai dengan back pressure dan peak yang

melebar.

g. Kolom baru verifikasi performance-nya dengan senyawa yang ada di CoA saja.

Apabila theoritical plate-nya < 80 % dikembalikan saja.

h. Carry-over senyawa yang tertinggal di kolom atau di syringe, tertinggal karena

sampel terlalu pekat (Sebaiknya konsentrasi jangan pekat agar sisa sampel tidak

tertinggal di kolom)

i. Untuk sampel semi solid panaskan dengan methanol/air sampai meleleh. Ambil

lapisan bawah dan tetap lakukan penyaringan. Setelah bekerja dengan sampel semi

solid pencucian dilakukan dengan menggunakan larutan yang dapat mengelusi

sample (ppt HPLC Penting A).

5. Detector operating Guide (Ahuja & Dong, 2005)

a. Hidupkan lampu 15 menit untuk pemanasan

b. Set panjang gelombang dan waktu responnya.

c. Masa hidup lampu detector < 2000 jam.

d. Pada saat conditioning sebaiknya lampu dimatikan untuk menghemat masa hidup

lampu

6. Kuantifikasi / Quantitation Operating Guide (Ahuja & Dong, 2005)

a. Kuantifikasi dilakukan dengan menggunakan peak Area (tidak terpengaruh oleh flow

rate karena fluktuasinya hanya akan memberikan sedikit variasi). Apabila resolusi

mencapai 1,8/1,9 maka sebaiknya di-kuantifikasi menggunakan peak height saja

sehingga apabila peak area TMS sedangkan peak height MS, hasil masih dapat

digunakan. Kuantifikasi menggunakan peak height hanya terdapat di GC tetapi bisa

juga diterapkan pada HPLC apabila peak area cenderung tailing, namun tailing

faktornya masih memenuhi syarat

b. Gunakan baku eksternal untuk analisis sehari-hari (assay dan disolusi). Sedangkan

Bracketed standard digunakan untuk meningkatkan akurasi seperti pada validasi yaitu

digunakan sebagai jaminan dimana metode menghasilkan respon yang proporsional

antara kadar dan respon atau penjaminan bahwa analisis yang dilakukan dalam

rentang kadar tertentu adalah valid. Baku bracketed dilakukan pada rentang 80-120

%.

7. Performance check (Chan dkk, 2004)

8. Key success on HPLC (Ahuja & Dong, 2005)

a. Rawat dan Kalibrasi HPLC secara periodic 0,5 tahun sekali.

b. Cek sistem performance dengan senyawa yang ada di CoA

c. Selalu verifikasi bahwa baseline dan pressure normal

d. Menggunakan solven pro HPLC dan Degassing jika ada air

e. Clean up dan filter sampel. Larutkan sampel dalam fase gerak. Kalau tidak larut

gunakan volume sekecil mungkin

f. Selalu cuci kolom sebelum dan setelah digunakan

g. N theoretical plate kurang dari CoA atau setengah dari CoA (warning ganti

kolom).

h. Check dengan prosedur referens menggunakan senyawa yang ada di CoA untuk

verifikasi performance

9. Uji kesesuain system / UKS

Untuk menjamin data atau hasil yang diperoleh dari system HPLC proper/sesuai.

Chan dkk, 2004 (chapter pperformance verification HPLC)

UKS hanya menunjukkan bahwa instrument sesuai dengan analisis tertentu pada

waktu tertentu tidak bisa menunjukkan tes verifikasi performa dari instrument HPLC.

Sebagai contoh UKS untuk HPLC dengan deteksi UV tidak aan menunjukkan

adanya masalah pada akurasi panjang gelombang yang digunakan karena baik sampel

maupun standar diukur pada panjang gelombang yang sama.