EFEKTIVITAS KLOROFIL A Spirulina platensis YANG DIPRODUKSI

DALAM MEDIA KULTUR DARI LIMBAH AMPAS KECAP

SEBAGAI ANTIOKSIDAN

Tesis

Oleh:

LUTHFIANA APRILIANITA SARI

KARANGANYAR - JAWA TENGAH

S-2 BIOTEKNOLOGI PERIKANAN DAN KELAUTAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA

2012

72

EFEKTIVITAS KLOROFIL A Spirulina platensis YANG DIPRODUKSI

DALAM MEDIA KULTUR DARI LIMBAH AMPAS KECAP

SEBAGAI ANTIOKSIDAN

Tesis sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar

Magister Sain pada Fakultas Perikanan dan Kelautan

Universitas Airlangga

Oleh :

LUTHFIANA APRILIANITA SARI

NIM. 140941001

Menyetujui,

Komisi Pembimbing

Pembimbing Pertama

Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP.

NIP. 19690912 199702 2 001

Pembimbing Kedua

Moch. Amin Alamsjah, Ir., M.Si., Ph.D.

NIP. 19700116 199503 1 002

Mengetahui,

Ketua Program Studi S2

Bioteknologi Perikanan dan Kelautan

Dr. Ir. Gunanti Mahasri, M.Si.

NIP. 19600912 198603 2 001

73

Setelah mempelajari dan menguji,kami berpendapat bahwa tesis ini, baik ruang

lingkup maupun kualitasnya dapat diajukan sebagai Salah Satu Syarat untuk

Memperoleh Gelar Magister Sain.

Tanggal Ujian : 23 Februari 2012

Menyetujui,

Ketua Penguji

Prof. Dr, Noor Erma Sugiyanto, Apt. MS.

NIP. 195211281980022001

Sekretaris

Prof. Dr. Hj. Sri Subekti, drh., DEA.

NIP. 19520517 197803 2 001

Anggota

A. Shofy Mubarak, S.Pi., M.Si.

NIP. 19731101 200112 1 002

Anggota

Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP.

NIP. 19690912 199702 2 001

Anggota

Moch. Amin Alamsjah, Ir., M.Si., Ph.D.

NIP. 19700116 199503 1 002

Surabaya, 23 Februari 2012

Fakultas Perikanan dan Kelautan

Universitas Airlangga

Dekan,

Prof. Dr. Drh. Hj. Sri Subekti B. S., DEA

NIP. 19520517 197803 2 001

74

Yang bertanda tangan di bawah ini :

N A M A : Luthfiana Aprilianita Sari

N I M : 140941001

Tempat, tanggal lahir : Ujung Pandang, 14 April 1987

Alamat : Pokoh, RT 007 RW 008, Ngijo, Tasikmadu, Karanganyar,

Surakarta

Judul Tesis : Efektivitas Klorofil A Spirulina platensis yang Diproduksi

dalam Media Kultur dari Limbah Ampas Kecap sebagai

Antioksidan

Pembimbing : 1. Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP.

2. Moch. Amin Alamsjah, Ir., M.Si., Ph.D.

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa hasil tulisan laporan Tesis yang saya buat

adalah murni hasil karya saya sendiri (bukan plagiat) yang berasal dari Dana

Penelitian : Mandiri / Proyek Dosen / Hibah / PKM (coret yang tidak perlu).

Di dalam Tesis / karya tulis ini tidak terdapat keseluruhan atau sebagian tulisan

atau gagasan orang lain yang saya ambil dengan cara menyalin atau meniru dalam

bentuk rangkaian kalimat atau simbol yang saya aku seolah-olah sebagai tulisan

saya sendiri tanpa memberikan pengakuan pada penulis aslinya, serta kami

bersedia :

1. Dipublikasikan dalam Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga;

2. Memberikan ijin untuk mengganti susunan penulis pada hasil tulisan Tesis / karya tulis saya ini sesuai dengan peranan pembimbing Tesis;

3. Diberikan sanksi akademik yang berlaku di Universitas Airlangga, termasuk pencabutan gelar kesarjanaan yang telah saya peroleh (sebagaimana diatur

di dalam Pedoman Pendidikan Unair 2010/2011 Bab. XI pasal 38 42), apabila dikemudian hari terbukti bahwa saya ternyata melakukan tindakan

menyalin atau meniru tulisan orang lain yang seolah-olah hasil pemikiran

saya sendiri

Demikian surat pernyataan yang saya buat ini tanpa ada unsur paksaan dari

siapapun dan dipergunakan sebagaimana mestinya.

Surabaya, 16 Februari 2012

Yang membuat pernyataan,

Luthfiana Aprilianita Sari

NIM. 140941001

75

RINGKASAN

LUTHFIANA APRILIANITA SARI. Efektivitas Klorofil a

Spirulina platensis yang Diproduksi dalam Media Kultur dari Limbah

Ampas Kecap sebagai Antioksidan. Dosen Pembimbing I Dr. Endang Dewi

Masithah, Ir., MP. dan Dosen Pembimbing II Moch. Amin Alamsjah, Ir.,

M.Si., Ph.D.

S. platensis merupakan salah satu suplemen kesehatan yang bermanfaat

sebagai antioksidan bersumber dari klorofil a S. platensis. Kestabilan produksi

klorofil a S. platensis dapat ditunjang dengan kelimpahan nutrien. Salah satu

alternatif media kultur S. platensis adalah dengan memanfaatkan limbah ampas

kecap sebagai pupuk. Limbah ampas kecap mengandung magnesium yang

merupakan prekursor sintesis klorofil a dan dapat memperkuat aktifitas

antioksidan yang dimiliki oleh klorofil. Klorofil a sebagai antioksidan merupakan

senyawa yang dapat memperlambat atau mencegah proses oksidasi. Antioksidan

dapat menghambat laju oksidasi bila bereaksi dengan radikal bebas. Hasil produk

oksidasi malondialdehid (MDA) secara in vivo dapat digunakan sebagai ukuran aktivitas

suatu bahan antioksidan. Proses oksidasi di dalam tubuh hewan coba (mencit) dipacu dengan

menggunakan timbal untuk mengaktifkan radikal bebas didalam tubuh hewan coba.

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh dan dosis terbaik pemberian

limbah ampas kecap sebagai pupuk organik terhadap kepadatan dan klorofil a S.

platensis. Kemudian untuk mengetahui aktifitas antioksidan (klorofil a) S.

platensis yang dikultur pada media asal limbah ampas kecap dibandingkan dengan

S. platensis komersil. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pendidikan Perikanan,

Fakultas Perikanan dan Kelautan, Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran

dan di Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga

dan di Laboratorium Budidaya Perikanan, Fakultas Teknik dan Ilmu Kelautan,

Universitas Hang Tuah.

Penelitian terdiri dari tiga tahap yaitu pengujian untuk memperoleh dosis

terbaik limbah ampas kecap, eksplorasi waktu produksi untuk memperoleh kadar

klorofil a S. platensis tertinggi dan pengaruh pemberian limbah ampas kecap

sebagai antioksidan (klorofil a) S. pletensis dengan malondialdehid (MDA) serta

76

uji histopatologi. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak

Lengkap (RAL). Analisis yang digunakan penelitian tahap I menggunakan

ANAVA. Data yang dihasilkan bila terdapat perbedaan dapat dilakukan uji

lanjutan yaitu Uji Jarak Berganda Duncan (Duncans Multiple Range Test).

Penelitian tahap III dianalisis secara statistik dengan menggunakan Uji t

Independent. Hasil penelitian uji histopatologi hati mencit dilakukan skoring yang

dianalisis menggunakan uji Kruskal Wallis.

Tahap penelitian I terdiri dari enam perlakuan dengan empat ulangan. Pada

penelitian tahap II (eksplorasi waktu produksi) terdiri dari empat ulangan. Pada

penelitian tahap III terdiri dari dua perlakuan dengan delapan ulangan. Parameter

utama adalah pengukuran kepadatan, klorofil a S. platensis dan kadar

malondialdehyde (MDA) serta uji histopatologi.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa limbah ampas kecap dapat digunakan

sebagai pupuk organik dengan dosis sebesar 1,8 mL/L pada media kultur S.

platensis yang menghasilkan klorofil a sebesar 0,0361 mg/L. Aktifitas antioksidan

(klorofil a) S. platensis hasil kultur pada media asal limbah ampas kecap yang

diberikan secara oral pada mencit kemudian diuji dengan metode MDA memiliki

kadar malondialdehid sebesar 5,07 nmol/L. Hasil uji histopatologi menujukkan

klorofil a hasil kultur pada media asal limbah ampas kecap mampu menghambat

kerusakan jaringan hati mencit akibat timbal. Parameter kualitas air selama

penelitian masih berada dalam batas toleransi untuk pertumbuhan S. platensis,

yaitu suhu air media kultur berkisar antara 28,6 - 30,5 oC, pH 8 - 9, suhu ruangan

berkisar antara 28 - 32 oC dan salinitas berkisar antara 32 - 34 ppt.

77

SUMMARY

LUTHFIANA APRILIANITA SARI. The Effectivety of Chlorophyll A

Spirulina platensis which is Produced in Culture Media from Ketchup Waste

as an antioxidant. Academic Advisor I Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP.

And Academic Advisor II. Moch. Amin Alamsjah, Ir., M.Sc., Ph.D.

S. platensis is a health supplement as an antioxidant, sourced from

chlorophyll a of S. platensis. The stability of S. platensis chlorophyll a production

can be supported with an abundance of nutrients. One alternative could be used

for the culture media of S. platensis is ketchup waste as fertilizer. Ketchup waste

contains magnesium acts as precursors for the synthesis of chlorophyll a and

sustains the antioxidant activity which is owned by the chlorophyll. Chlorophyll a

as an antioxidant is a compound that may slow or prevent the oxidation process.

Antioxidants can inhibit the rate of oxidation when reacting with free radicals.

The results of oxidation product malondialdehyde (MDA) in vivo represent the

antioxidants activity. Oxidation processes in the body of experimental animals

(Mus musculus) stimulated with the use of lead to activate the body's free radicals

experimental animals.

The purpose of this study was to determine the effects and the best dose of

ketchup waste as organic fertilizer for the density and chlorophyll a of S.

platensis. Also, to determine antioxidant activity (chlorophyll a) of S. platensis

which is produced in culture media from ketchup waste compared to S. platensis

commercial. The study was conducted in the Fisheries Education Laboratory,

Fisheries and Marine Faculty, Laboratory Biochemistry Faculty of Medicine and

Laboratory Pathology Faculty of Veterinary Medicine, Airlangga University and

Aquaculture Laboratory, Engineering and Marine Sciences Faculty, Hang Tuah

University.

The study consisted of three phases examination to obtain the best dose of

ketchup waste, exploration of production time in order to obtain the highest value

of chlorophyll a of S. pletensis and the effect of ketchup waste as an antioxidant

(chlorophyll a) of S. pletensis by malondialdehyde method (MDA). The design of

this study is a Completely Randomized Design. ANAVA is used in the first step.

Duncans Multiple-Range-Test then applied when the resulting data showed the

78

differences. Third step were statistically analyzed using Independent t Test. For

histopathology analysis of mice liver, scoring data was analized by Kruskal Wallis

Test.

The first step in this research consisted of six treatments with four

replications. The second step (exploration production time) consisted of four

replications. The third phase consisted of two treatments with eight replications.

The main parameters are the measurement of the density of S. platensis,

chlorophyll a of S. platensisand malondialdehyde content(MDA).

The results showed that the ketchup waste can be used as organic fertilizer

with 1.8 mL/L in dose, respectively, placed in the culture media of S. platensis

which produces 0.0361 mg/L in chlorophyll a. Antioxidant activity (chlorophyll a)

of S. platensis cultured in the waste residue of ketchup waste media which is

administered orally in mice and then tested by MDA method shows 5.07 nmol/L

in malondialdehyde content. Histopathologic test results showed chlorophyll a in

the culture ketchup waste media can inhibit murine liver tissue damage caused by

lead. Water quality parameters during the study is within tolerance for the growth

of S. platensis, the culture media ranged from 28.6 to 30.5 C in water

temperature, 8-9 in pH, 28-32 C in room temperature ranged and 32-34 ppt in

salinity.

79

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada :

1. Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga yang telah memberi

saya kesempatan untuk menempuh pendidikan S2 Bioteknologi Perikanan

dan Kelautan.

2. Prof. Dr. Drh. Hj. Sri Subekti B. S., DEA selaku Dekan Fakultas Perikanan

dan Kelautan Universitas Airlangga Surabaya.

3. Dr. Ir. Endang Dewi Mashitah, MP. selaku dosen pembimbing pertama

4. Moch. Amin Alamsjah, Ir., M.Si., Ph.D. selaku dosen pembembing kedua.

5. Prof. Dr, Noor Erma Sugiyanto, Apt. MS. selaku ketua penguji.

6. Prof. Dr. Hj. Sri Subekti, drh., DEA. selaku sekretaris penguji.

7. A. Shofy Mubarak, S.Pi., M.Si. selaku anggota penguji.

8. Kedua orang tua Ir. Sumijarto, MP. dan Dra. Siti Khumaidah serta adekku

Tomi Ahmad Farobi yang telah memberikan bantuan, motivasi serta doa.

9. Keluarga besar Surabaya Simbah Indun, Simbah Karimin, Tante Jili, Om

Wahib, Tante Alfiah, Om Sumali, Yuma Bella Saiful Islam AlFarobi, Yuma

Darulloh Saiful Islam, Immamatunnisa dan Ayuma Qubaila Putri Madinah.

10. Keluarga Karanganyar Bude, Pakde, Bulek, Om, Mbak-mbak, Mas-mas,

Adek-adek serta Ponakan-ponakanku yang telah memotivasi.

11. Fahruddin Rosyadi yang selalu mensuport dan mendampingi dalam

kelangsungan proses tesis ini.

12. Bapak / Ibu dosen Bioteknologi Perikanan dan Kelautan Universitas

Airlangga yang telah memberikan ilmu kepada penulis.

13. Bapak Kustiawan Tri Pursetyo dan Bapak Budi (Karantina Perak)yang telah

membantu saya dalam menunjang tesis ini.

14. Teman dan sahabat yang selalu mensuport Irene Rahmawati, Nenli Prabowo

Putri Desi Wulansari dan Fitria Dwi Ratna Mahesti

15. Adek adek kelas yang turut membantu.

16. Semua pihak yang telah mendukung hingga selesainya Tesis ini.

80

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT, atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya,

sehingga penulis dapat menyelesaikan Tesis tentang Efektivitas Klorofil A

Spirulina platensis yang Diproduksi dalam Media Kultur dari Limbah

Ampas Kecap sebagai Antioksidan. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Magister Perikanan pada Fakultas Perikanan dan

Kelautan Universitas Airlangga Surabaya.

Penulis menyadari bahwa Tesis ini masih sangat jauh dari kesempurnaan,

sehingga kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi

perbaikan dan kesempurnaan Tesis ini. Akhirnya penulis berharap semoga Tesis

ini dapat memberikan manfaat dan informasi bagi semua pihak, khususnya bagi

mahasiswa Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Surabaya

demi kemajuan dan perkembangan teknologi dalam bidang perikanan.

Surabaya, Februari 2012

Penulis

.

81

DAFTAR ISI

Halaman

RINGKASAN ............................................................................................. iv

SUMMARY ................................................................................................ vi

KATA PENGANTAR ................................................................................ viii

UCAPAN TERIMA KASIH ....................................................................... ix

DAFTAR TABEL ....................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiv

I PENDAHULUAN ............................................................................. 1

1.1 Latar belakang ........................................................................... 1

1.2 Perumusan masalah ................................................................... 3

1.3 Tujuan ....................................................................................... 4

1.4 Manfaat ..................................................................................... 4

II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 5

2.1 Biologi S. platensis.................................................................... 5 2.1.1 Klasifikasi dan morfologi S. platensis .......................... 5 2.1.2 Habitat S. platensis ........................................................ 6 2.1.3 Reproduksi S. platensis ................................................. 6 2.1.4 Pertumbuhan S. platensis .............................................. 7 2.1.5 Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi

pertumbuhan S. platensis .............................................. 8

2.2 Kebutuhan Nutrien S. platensis ................................................. 9 2.2.1 Nitrogen ......................................................................... 10 2.2.2 Magnesium .................................................................... 11 2.2.3 Besi (Fe) ........................................................................ 11

2.3 Kandungan gizi dan manfaat S. platensis ................................. 12

2.4 Limbah ampas kecap ................................................................. 13

2.5 Proses fotosintesis ..................................................................... 14

2.6 Klorofil a ................................................................................... 15

2.7 Klorofil sebagai antioksidan ..................................................... 18

82

2.8 Pengujian antioksidan Metode Malondialdehid (MDA) ........... 21

2.9 Timbal ....................................................................................... 22

III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN ... 24

3.1 Kerangka Konseptual Penelitian ............................................... 24

3.2 Hipotesis Penelitian ................................................................... 28

IV MATERI DAN METODE PENELITIAN ......................................... 29

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................... 29

4.2 Materi Penelitian ....................................................................... 29

4.3 Metode Penelitian...................................................................... 30 4.3.1 Rancangan Penelitian .................................................... 30 4.3.2 Prosedur Kerja Penelitian .............................................. 32

A. Sterilisasi peralatan dan media kultur ..................... 32 B. Persiapan limbah ampas kecap................................ 33 C. Penebarab bibit ........................................................ 34 D. Kultur ...................................................................... 34 E. Kepadatan S. platensis ............................................ 35 F. Klorofil A ................................................................ 36 G. Ekstraksi S. platensis komersil dan S. platensis hasil kultur dengan limbah

ampas kecap ............................................................ 36

H. Pemeliharaan mencit ............................................... 38 I. Pemberian S. platensis komersil dan S. platensi hasil kultur dengan limbah ampas kecap yang telah

diberi timbal (Pb) pada mencit ................................ 38

J. Metode malandialdehyde (MDA) ........................... 39 K. Perhitungan pertumbuhan populasi S. platensis ..... 40 L. Pengujian histopatologi hati mencit ........................ 40 M. Pengukuran kualitas air ........................................... 41

4.3.3 Parameter pengamatan .................................................. 41

A. Parameter utama ...................................................... 41 B. Parameter pendukung .............................................. 42

4.3.4 Analisis data .................................................................. 42

V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ................................. 46

5.1 Hasil Penelitian ......................................................................... 46

5.1.1 Kepadatan S. platensis .................................................. 46 5.1.2 Klorofil S. platensis ....................................................... 49 5.1.3 Metode Malondialdehyde (MDA) ................................. 47 5.1.4 Histopatologi hati mencit .............................................. 49 5.1.5 Kualitas Air ...................................................................... 54

5.2 Pembahasan ............................................................................... 54

83

VI SIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 61

6.1 Simpulan.... ............................................................................... 61 6.2 Saran......... ................................................................................. 62

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 63

LAMPIRAN ................................................................................................ 71

84

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Data kepadatan Spirulina platensis (x 104 unit/ml) setelah yang

dikultur pada media limbah ampas kecap hari pertama hingga hari

kedelapan............................................................................................... 43

2. Data Klorofil S. platensis setelah yang dikultur pada media limbah

ampas kecap hari pertama hingga hari ketujuh ..................................... 46

3. Data kadar malondialdehyde (MDA) pada darah mencit yang sudah

diberi klorofil a S. platensis hasil kultur limbah ampas kecap dan

klorofil a S. platensis komersil .............................................................. 48

4. Skoring kerusakan jaringan hati mencit ................................................ 49

5. Kompisisi pupuk Walne dari BBPAP Jepara ........................................ 72

6. Kadar MDA pada darah mencit yang sudah diberi klorofil a S.

platensis hasil kultur limbah ampas kecap .......................................... 83

7. Kadar MDA pada darah mencit yang sudah diberi klorofil a S. platensis komersil ................................................................................. 83

8. Skoring kerusakan jaringan hati mencit ................................................ 84

9. Standart klorofil a ................................................................................ 96

10. Standart MDA ...................................................................................... 98

11. Data Suhu Ruang (C) S. platensis ..................................................... 99

12. Data pH pagi hari media kultur S. platensis........................................ 100

13. Data pH siang hari media kultur S. platensis ....................................... 100

14. Data pH sore hari media kultur S. platensis ......................................... 100

15. Data salinitas pagi hari media kultur S. platensis ................................ 101

16. Data salinitas siang hari media kultur S. platensis ............................... 101

17. Data salinitas sore hari media kultur S. platensis ................................. 101

18. Data Suhu air C pagi hari media kultur S. platensis ........................... 102

85

19. Data Suhu air C siang hari media kultur S. platensis ......................... 102

20. Data Suhu air C sore hari media kultur S. platensis ........................... 102

86

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. S. platensis ............................................................................................ 5

2. Siklus hidup S. platensis ................................................................. 7

3. Pembentukan glutamat ................................................................. 16

4. Mekanisme sintesis klorofil ............................................................... 17

5. Klorofil a ................................................................. 18

6. Bagan rancangan penelitian .................................................................. 26

7. Desain penelitian ................................................................. 30

8. Bagan rancangan penelitian tahap I ...................................................... 40

9. Bagan rancangan penelitian tahap II ..................................................... 41

10. Bagan rancangan penelitian tahap III (Metode MDA) ......................... 42

11. Grafik kepadatan S. platensis (x 104 unit/ml) setelah yang dikultur

pada media limbah ampas kecap hari pertama hingga hari kedelapan . 44

12. Grafik klorofil a S. platensis (mg/mL) setelah yang dikultur pada

media limbah ampas kecap hari pertama hingga hari keenam .............. 47

13. Histopatologi hati mencit normal .......................................................... 50

14. Histopatologi hati mencit diberi timbal dan klorofil a S. platensis

komersil ................................................................. 51

15. Histopatologi hati mencit yang diberi timbal dan klorofil a S.

platensis hasil kultur limbah ampas kecap ............................................ 52

16. Histopatologi hati mencit yang hanya diberi timbal ............................. 53

17. Standart skoring .................................................................................... 85

18. Grafik standart kurva baku klorofil a .................................................... 97

87

19. Grafik standart kurva baku malondialdehid (MDA) ............................. 98

88

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Laporan hasil uji limbah ampas kecap ................................................ 71

2. Kompisisi pupuk Walne dari BBPAP Jepara ...................................... 72

3. Konversi perhitungan nitrogen ............................................................ 73

4. Teknik Pemeriksaan Histopatologi dengan Pewarnaan

Hematoxylin-Eosin ............................................................................. 74

5. Proses fotosintesis ............................................................................... 75

6. Data kepadatan S. platensis ................................................................. 78

7. Data klorofil a ..................................................................................... 82

8. Kadar MDA pada darah mencit yang telah diberi

klorofil a S. platensis hasil kultur limbah ampas kecap

dan klorofil a S. platensis komersil .................................................... 83

9. Skoring histopatologi kerusakan hati mencit yang telah diberi

klorofil a S. platensis hasil kultur limbah ampas kecap dan

klorofil a S. platensis komersil serta diberi timbal

sebagai pemicu radikal bebas ............................................................. 84

10. Gambar standart skoring kerusakan hati mencit .................................

11. Analisis statistik kepadatan S. platensis ............................................. 86

12. Analisis statistik metode MDA ........................................................... 94

13. Analisis statistik skoring histopatologi hati mencit ............................ 95

14. Standart klorofil a ................................................................................ 97

15. Standart malondialdehid (MDA)......................................................... 98

16. Data Suhu Ruang (C) S. platensis..................................................... 99

89

17. Data alkalinitas (pH) media kultur S. platensis .................................. 100

18. Data salinitas (ppt) media kultur S. platensis ..................................... 101

19. Data Suhu air (C) media kultur S. platensis ..................................... 102

20. Laporan Hasil Uji Kadar Nitrogen Pupuk Walne dan

Limbah Ampas Kecap ........................................................................ 103

21. Sertifikat Kelaikan Etik ....................................................................... 104

I PENDAHULUAN

90

1.1 Latar Belakang

Pertambahan populasi manusia diiringi perkembangan pembangunan di

segala macam bidang menciptakan suatu dampak negatif bagi manusia itu sendiri.

Manusia beraktivitas tanpa mengenal waktu, sehingga pola makan dan kesehatan

tubuh mudah terganggu. Aktivitas manusia juga menciptakan suatu manipulasi

lingkungan sehingga muncul berbagai pencemaran yang berakibat pada kesehatan

tubuh manusia (Supyan, 2008). Permasalahan yang muncul menyebabkan muncul

berbagai penelitian untuk menciptakan suatu suplemen yang bermanfaat sebagai

sumber protein, peningkat daya imun tubuh dan antioksidan. Salah satu suplemen

alami yang mudah untuk dibudidayakan adalah S. platensis (Susanna et al., 2007).

S. platensis merupakan salah satu jenis alga yang memiliki kandungan gizi

seperti protein berkisar antara 70 78 persen, karbohidrat berkisar antara 15 25

persen, lemak berkisar antara 4 7 persen, serat berkisar antara 8 10 persen dan

mineral berkisar antara 6 13 persen (Bhowmik et al., 2009). Selain itu juga

mengandung S. platensis 1,6% klorofil a, 18% fikosianin, 17 % -Carotene

(Promya et al., 2008). Klorofil a (Kusmita and Limantara, 2009) bermanfaat

sebagai antioksidan. Pernyataan bahwa Klorofil a bermanfaat sebagai antioksidan

dinyatakan pula oleh beberapa peneliti bahwa klorofil a juga bermanfaat sebagai

senyawa anti kanker dan antioksidan (Harttig and Bailey, 1998).

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menunda atau menghambat

reaksi oksidasi (Pokorny et al., 2001). Reaksi oksidasi berkaitan dengan stres

oksidatif, melalui pembentukan molekul reactive oxygen species akibat pengaruh

buruk radikal bebas. Radikal bebas diketahui dapat menginduksi penyakit kanker,

arteriosklerosis dan penuaan, disebabkan oleh kerusakan jaringan karena oksidasi

91

(Kikuzaki and Nakatani, 1993). Radikal bebas dapat berasal dari pemaparan

ultraviolet, polusi udara, senyawa berbahaya (insektisida), logam berat dan stress

secara berlebihan. Manfaat dari antioksidan membuat produsen berupaya

menghasilkan antioksidan sintetis. Antioksidan sintetis memiliki efektifitas yang

tinggi namun kurang aman bagi kesehatan sehingga pengunaannya diawasi secara

ketat (Pujimulyani, 2003).

Tingginya kandungan nutrien dan manfaat yang didapat dari S. platensis

memacu terjadinya peningkatan produksi spirulina untuk memenuhi kebutuhan

manusia. Hal yang dapat mendorong peningkatan produksi Spirulina adalah

peningkatkan pertumbuhan, yaitu meningkatkan jumlah sel (Isnansetyo and

Kurniastuti, 1995). Harrison and Berges (2005) menyatakan bahwa salah satu cara

untuk meningkatkan pertumbuhan fitoplankton adalah mengontrol kandungan

nutrien baik makro maupun mikro pada media kultur.

Salah satu alternatif untuk membuat media S. platensis dari bahan alami

dengan biaya murah serta memiliki unsur makro dan mikro yang optimal adalah

dengan memanfaatkan limbah ampas kecap. Ampas kecap berasal dari sisa hasil

penyaringan kedelai yang telah difermentasi oleh Aspergillus oryzae.

Pemanfaatan limbah ampas kecap sebagai pupuk akan mengurangi penggunaan

pupuk kimia. Las (2006) menyatakan bahwa pupuk kimia telah mencemari

sebagian sumber daya lahan, air, dan lingkungan. Penggunaan pupuk kimia

meningkat enam kali lipat setiap tahun.

Hasil pengujian PT. Lombok Gandaria (2009) pada limbah ampas kecap

hasil buangan produksi menyebutkan bahwa ampas kecap tersebut mengandung

nitrogen 1,98%, fosfor 0,28%, kalium 0,59%, kalsium 0,16%, magnesium 0,06%,

92

besi 0,01%, natrium 2%, mangan 11,26 ppm, seng 26,71 ppm, belerang 7,15ppm,

klor 8,12% dan karbon organik 38%. Habib and Parvin (2008) menyatakan bahwa

unsur hara yang dibutuhkan S. platensis terdiri dari unsur hara N, P, K, S, Mg, Ca,

Na, Cl, Fe, Zn, Cu, Ni, Co dan Mo.

Salah satu unsur yang penting dalam sintesis klorofil dan meningkatkan

aktifitas antioksidan dari klorofil a (C55H72O5N4Mg) adalah magnesium.

Magnesium merupakan komponen unsur logam utama sebagai atom pusat dari

klorofil a dan defisiensi magnesium akan menghambat pembentukan klorofil a

(Riyono, 2007). Hasil penelitian Granick (1948) pada sel Chlorella diketahui

bahwa proses pembentukan klorofil terjadi setelah sintesis protoporfirin kemudian

disisipkan magnesium. Hasil penelitian Endo et al., (1984) diketahui bahwa

magnesium juga berfungsi dalam memperkuat aktifitas antioksidan yang dimiliki

oleh klorofil. Berdasarkan hal inilah perlu dilakukan penelitian tentang pengaruh

limbah ampas kecap sebagai pupuk terhadap pertumbuhan S. platensis.

1.2 Perumusan Masalah

a. Apakah pemberian limbah ampas kecap sebagai pupuk organik dapat

mempengaruhi kepadatan dan klorofil a dari S. platensis?

b. Apakah aktifitas antioksidan (klorofil a) S. platensis yang dikultur pada

media asal limbah ampas kecap berbeda dengan S. platensis komersil?

c. Apakah histopatologi hati mencit yang telah diberi secara oral S. platensis

(klorofil a) hasil kultur pada media asal limbah ampas kecap berbeda

dengan S. platensis komersil?

1.3 Tujuan

93

a. Mengetahui pengaruh pemberian limbah ampas kecap sebagai pupuk

organik terhadap kepadatan dan klorofil a dari S. platensis.

b. Mengetahui aktifitas antioksidan (klorofil a) S. platensis yang dikultur pada

media asal limbah ampas kecap dibandingkan dengan S. platensis komersil.

c. Mengetahui histopatologi hati mencit yang telah diberi secara oral S.

platensis (klorofil a) hasil kultur pada media asal limbah ampas kecap

dibandingkan dengan S. platensis komersil.

1.4 Manfaat

Manfaat penelitian ini adalah untuk memberikan informasi ilmiah tentang

pengaruh pemberian limbah ampas kecap sebagai pupuk organik dapat

mempengaruhi kepadatan dan klorofil a dari S. platensis.. Hal tersebut disebabkan

karena limbah ampas kecap memiliki nutrien kebutuhan yang dibutuhkan S.

platensis . Selain itu manfaat dari penelitian ini adalah untuk mengetahui dosis

terbaik dari pupuk yang berasal dari limbah ampas kecap untuk mendapatkan

kepadatan dan klorofil a dari S. platensis tertinggi. Hasil S. platensis dari

penelitian tersebut digunakan untuk diuji kadar antioksidan. Diharapkan

antioksidan yang dikultur pada media kultur asal limbah ampas kecap lebih baik

dibandingkan dengan S. platensis komersil.

II TINJAUAN PUSTAKA

94

2.1 Biologi Spirulina platensis

2.1.1 Klasifikasi dan Morfologi S. platensis

Geitler (1925) menyatakan, klasifikasi S. platensis adalah:

Empire : Prokaryota

Kingdom : Bacteria

Subkingdom : Negibacteria

Phylum : Cyanobacteria

Class : Cyanophyceae

Subclass : Synechococcophycideae

Order : Pseudanabaenales

Family : Pseudanabaenaceae

Subfamily : Spirulinoideae

Genus : Spirulina

Spesies : Spirulina platensis (Gambar 1.)

1 2

a b c

Gambar 1. S. platensis a. S. platensis perbesaran 400x. b. S. platensis diamati

mikroskop elektron (Tomaselli, 1997). c. S. platensis perbesaran 1000x

Keterangan:

1. Filamen 2. Sel A. Unit

Habib and Parvin (2008) menyatakan bahwa S. platensis merupakan

cyanobacteria yang memiliki dinding sel yang mirip dengan bakteri gram negatif

yaitu mengandung peptidoglikan. S. platensis berbentuk filamen (Pelizer et al.,

2002) berupa rangkaian trichome yang tersusun atas banyak sel berbentuk silidris

(Richmond, 1986). Snchez et al. (2002) mengemukakan, panjang trichome 500

m dengan lebar antara 6 - 12 m. Sel S. platensis yang berukuran kecil

95

berdiameter berkisar antara 1 - 3 m dan yang berukuran besar berdiameter antara

3 - 12 m (Isnansetyo and Kurniastuty, 1995). Strohmeyer (2008) menyebutkan,

Spirulina mempunyai pigmen fikosianin (biru), klorofil a (hijau) dan karotenoid

(kuning kemerahan).

2.1.2 Habitat S. platensis

Spirulina merupakan fitoplankton yang dapat ditemukan di lingkungan yang

berbeda, yaitu tanah, rawa, air tawar, air payau, air laut hingga danau garam

(Habib and Parvain, 2008). Richmond (1986) menyatakan bahwa spirulina dapat

bertahan hidup pada kadar garam berkisar antara 20 70 ppt. Lingkungan yang

baik untuk pertumbuhan Spirulina adalah lingkungan yang kaya sinar matahari,

curah hujan sedang, alkalinitas tinggi dan pH berkisar antara 7,2 - 9,5 (Isnansetyo

and Kurniastuti, 1995). Akan tetapi, S. platensis dapat ditemukan di Danau

Aranguadi Ethiopia dengan pH mencapai 10,3 (Richmond, 1986).

2.1.3 Reproduksi S. platensis

S. platensis berkembangbiak secara aseksual, yaitu membelah diri (Snchez

et al., 2002). Ciferri (1983) menyatakan bahwa siklus reproduksi S. platensis

berlangsung melalui pembentukan hormogonium. Pembentukan homogonium

dimulai ketika salah satu atau beberapa sel yang terdapat ditengah trichoma

mengalami kematian dan membentuk badan yang disebut cakram pemisah

berbentuk bikonkaf. Sel-sel mati yang disebut nikridia tersebut akan putus.

Trichoma kemudian terfragmentasi menjadi koloni sel yang terdiri atas 2 - 4 sel

yang disebut hormogonium dan memisahkan diri dari filamen induk untuk

menjadi trichoma baru. Hormogonium memperbanyak sel dengan pembelahan

96

pada sel terminal. Pada tahap akhir proses pendewasaan sel yang ditandai

terbentuknya granula pada sitoplasma dan perubahan warna sel menjadi hijau

kebiruan. Siklus hidup S. platensis dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Siklus hidup S. platensis (Richmond, 1986)

2.1.4 Pertumbuhan S. platensis

S. platensis merupakan salah satu golongan fitoplankton yang dalam

pertumbuhannya dapat ditandai dengan bertambah banyaknya jumlah sel yang

secara langsung akan berpengaruh terhadap kepadatan fitoplankton (Habib and

Parvin, 2008). Edhy et al. (2003) menjelaskan bahwa pertumbuhan fitoplankton

terdiri atas empat fase, yaitu istirahat, eksponensial, stasioner dan kematian. Fase

istirahat merupakan masa adaptasi setelah penambahan inokulum ke dalam media

kultur. Pada fase istirahat ini terjadi peningkatan ukuran sel, tetapi populasi tidak

mengalami perubahan karena belum terjadi pembelahan sel.

Fase eksponensial diawali oleh pembelahan sel dengan laju pertumbuhan

terus meningkat kemudian setelah itu, laju pertumbuhan menurun, namun jumlah

populasi masih yang terus meningkat. Pada fase stasioner, jumlah populasi tidak

97

mengalami perubahan dibandingkan dengan puncak fase eksponensial. Laju

pertumbuhan sama atau seimbang dengan laju kematian, sehingga kepadatan

fitoplankton tetap. Fase kematian merupakan fase dimana terjadi penurunan

kepadatan fitoplankton karena laju kematian lebih cepat daripada laju

pertumbuhan (Isnansetyo and Kurniastuty, 1995).

2.1.5 Faktor-Faktor yang Dapat Mempengaruhi Pertumbuhan S. platensis

Pertumbuhan S. platensis sangat tergantung kondisi lingkungan, untuk

mendapatkan jumlah pertumbuhan populasi dan berat biomassa yang tinggi,

dibutuhkan kondisi lingkungan yang mendukung. Faktor lingkungan yang

berpengaruh terhadap pertumbuhan fitoplankton antara lain cahaya, suhu, pH, dan

salinitas (McVey, 1983). Cahaya mutlak diperlukan sebagai sumber energi. Pada

budidaya fitoplankton di laboratorium, cahaya matahari dapat digantikan dengan

sinar lampu TL. Spirulina membutuhkan cahaya 1900 lux (lampu TL 40 W)

selama 12 jam (Costa et al., 2002).

Suhu optimum S. platensis untuk dapat tumbuh dengan baik, yaitu berkisar

antara 25 - 35oC (Isnansetyo and Kurniastuty, 1995). Suriawiria (1985)

menjelaskan, suhu sangat berpengaruh terhadap reaksi kimia. Jika reaksi kimia

mengalami kenaikan suhu maka, kecepatan reaksi akan naik. Setiap kenaikan suhu

10C dapat mempercepat reaksi 2 - 3 kali lipat, karena di dalam proses

metabolisme terjadi suatu rangkaian reaksi kimia, maka kenaikan suhu sampai pada

batas nilai tertentu dapat mempercepat proses metabolisme. Suhu tinggi yang

melebihi suhu maksimum akan menyebabkan denaturasi protein dan enzim serta

akan menyebabkan terhentinya proses metabolisme dalam sel.

98

Derajat keasaman merupakan titik sensitif pada mikroalga yang diukur pada

skala satuan pH. Pada pH tertentu suatu enzim mengubah substrat menjadi hasil

akhir, maka perubahan pH dapat membalik aktifitas enzim dengan mengubah hasil

akhir kembali menjadi substrat (Dwidjoseputro, 1986). Isnansetyo and Kurniastuty

(1995) menyatakan, pH optimum untuk S. platensis agar dapat tumbuh dengan baik,

yaitu berkisar antara 7,2 9,5.

Darley (1982) menyatakan, salinitas sangat berpengaruh terhadap

pertumbuhan dan distribusi fitoplakton. Hal ini bisa diketahui dari aktifitas

osmosis sel dalam penyerapan cairan. Sel akan menyerap segala macam cairan

yang ada di luar membran sel yang memiliki kadar lebih rendah dibandingkan di

dalam sel. Sebaliknya, sel akan mengeluarkan cairan jika kadar cairan di dalam

sel lebih rendah dibandingkan di luar sel. Hasil penelitian Kebede (1997)

menyatakan, salinitas yang optimal untuk pertumbuhan Spirulina adalah berkisar

antara 30 40 ppt.

2.2 Kebutuhan Nutrien S. platensis

Pertumbuhan S. platensis memerlukan berbagai nutrien yang diabsorbsi dari

lingkungannya. Secara umum, nutrien yang diperlukan fitoplankton untuk tumbuh

digolongkan menjadi dua, yaitu makro dan mikro nutrien (Edhy et al., 2003).

Makro dan mikro nutrien tersebut berperan dalam sintesa klorofil, unsur tersebut

adalah nitrogen, magnesium, besi. Defisiensi unsur tersebut akan mencegah

terjadinya sintesa klorofil yang disebut chlorosis (Riyono, 2007). Pada budidaya

fitoplankton, media kultur digunakan sebagai tempat untuk tumbuh dan

berkembang biak, sehingga ketersediaan unsur nutrien, baik makro maupun mikro

99

nutrien mutlak diperlukan dalam media kultur (Isnansetyo and Kurniastuty,

1995).

2.2.1 Nitrogen.

Nitrogen merupakan salah satu molekul pembentuk klorofil, maka tidak

mengherankan bila defisiensi unsur ini akan menghambat pembentukan klorofil

(Riyono, 2007). Hasil penelitian Chaudhari et al., (1980) diketahui bahwa

kebutuhan nitrogen yang dibutuhkan S. platensis untuk memperoleh pertumbuhan

optimal adalah 2 g/L dari sampah segar yang ada di Environmental Engineering

Research Institute India.

Kaplan et al. (1986) menyatakan bahwa sumber nitrogen yang mudah

diserap oleh S. platensis adalah dalam bentuk ammonium (NH4+), sedangkan

Nybakken (1988) menyatakan bahwa nutrien anorganik utama yang paling

dibutuhkan fitoplankton untuk tumbuh dan berkembangbiak ialah nitrogen dalam

bentuk nitrat. Ammonium dapat mudah diserap oleh cyanobacteria sebab

memiliki bilangan oksidasi nitrogen -3.. Proses reduksi nitrat tersebut terjadi saat

nitrat dengan bilangan oksidasi +5 tereduksi menjadi nitrit yang memiliki

bilangan oksidasi nitrogen +3 kemudian nitrit tereduksi menjadi ammonium yang

memiliki bilangan oksidasi nitrogen -3 (Kaplan et al., 1986).

Nitrogen juga salah satu unsur dalam pembentukan klorofil, sehingga

dengan peningkatan jumlah nitrogen maka akan meningkatkan jumlah klorofil

(Nishio et al., 1985) sebab salah satu unsur pembentuk klorofil adalah nitrogen.

Klorofil yang terdapat pada S. platensis adalah klorofil a dengan rumus kimia

C55H72O5N4Mg. Peningkatan jumlah klorofil maka akan meningkatkan laju proses

fotosintesis (Weissner, 1962). Lawlor (1993) menyatakan bahwa proses

100

fotosntesis mempengaruhi pertumbuhan organisme yang melakukan proses

fotosintasis. Pada kondisi perairan yang kaya nitrogen, alga mensintesis protein

yang berhubungan dengan struktur fungsional sel, sementara apabila kekurangan

nitrogen sel-sel alga akan mengalihkan produk hasil fotosintesisnya menjadi

senyawa-senyawa yang tidak mengandung nitrogen, seperti karbohidrat dan

lemak (Klau, 2003).

2.2.2 Magnesium

Magnesium memegang peranan amat penting dalam proses kehidupan

hewan dan tumbuhan. Magnesium (Mg) adalah satu-satunya unsur logam yang

merupakan komponen utama, karena merupakan atom pusat dari klorofil dan

defisiensinya akan menghambat (Riyono, 2007). Magnesium terdapat di dalam

klorifil, yaitu yang digunakan oleh tumbuhan hijau untuk fotosintesis. Hasil

penelitian Chaudhari et al., (1980) diketahui bahwa kebutuhan magnesium yang

dibutuhkan S. platensis untuk memperoleh pertumbuhan optimal adalah 0,1 g/L

dari sampah segar (daun dan sampah organik lainnya) di Environmental

Engineering Research Institute India. Magnesium terdapat di klorofil dan juga

bergabung dengan ATP (menjadikan ATP berfungsi dalam berbagai reaksi),

mengaktifkan enzim yang diperlukan dalam fotosintesis mempercepat reaksi

kimia, respirasi dan pembentukan DNA serta RNA (Salisbury and Ross, 1995).

2.2.3 Besi (Fe)

Besi merupakan nutrien yang penting di laut, selain itu juga merupakan

komponen zat kimia penting yang sulit diukur dan dikontrol di media kultur

(Harrison and Berges, 2005). Sandmann and Malkin (1983) menyatakan, besi

101

mempengaruhi pertumbuhan alga hijau biru. Hasil penelitian Hardie et al. (1982)

diketahui bahwa terjadi penurunan pertumbuhan cyanobacteria Agmenellum

quadruplicatum saat kadar besi di dalam media kultur menurun.

Besi berperan dalam mempercepat proses reduksi nitrat (Kosakowska et al.,

2006). Hasil penelitian Hardie et al. (1982) menyebutkan bahwa terjadi proses

reduksi nitrat (NO3-) akan menghasilkan nitrit (NO2

-) dan Kaplan et al. (1986)

mengemukakan, reduksi nitrit (NO2-) akan menghasilkan ammonium (NH4

+).

Proses reduksi adalah hasil kerjasama antara besi sebagai kofaktor dengan enzim

nitrat reduktase yang terjadi di membran thylakoid.

2.3 Kandungan Gizi dan Manfaat S. platensis

Dangeard (1940) dalam Snchez et al. (2003) melaporkan bahwa di daerah

Afrika para penduduk mengkonsumsi sejenis alga. Leonard (1966) melaporkan

bahwa alga yang dikonsumsi di daerah tersebut adalah spirulina. Sanchez et al.

(2008) menyatakan bahwa pada tahun 1967 The International Association of

Applied Microbiology menyatakan bahwa spirulina merupakan sumber makanan

bagi masa depan. S. platensis telah dianalisa secara kimia memiliki kandungan

nutrien yang sangat tinggi. Peng et al. (2005) mengemukakan bahwa kandungan

dari Spirulina berupa protein berkisar antara 55 - 70 persen, karbohidrat berkisar

antara 15 25 persen, asam lemak esensial 18 persen, vitamin dan mineral dua

persen.

Hasil penelitian Endo et al. (1985) diketahui bahwa klorofil menunjukkan

aktifitas antiokasidan pada metil linoleat. Hasil penelitian Handoko (2005)

menyatakan bahwa terjadi penurunan nilai Serum Glutamic Oxaloacetic

Transaminase (SGOT) dan Serum Glutamic Piruvic Transaminase (SGPT) dari

102

hati tikus wistar jantan yang telah dipapar karbon tetraklorida sebagai pemacu

radikal bebas setelah diberi ekstrak daun Apium graviolens yang mengandung

klorofil. Hasil penelitian Prangdimurti et al. (2006) menyatakan bahwa terjadi

aktifitas antioksidan yang ditandai dengan penurunan kadar MDA serta

peningkatan aktivitas enzim katalase dan superoksida dismutase (SOD) pada hati

tikus Sprague Dawley jantan setelah diberi daun suji yang mengandung klorofil.

2.4 Limbah Ampas Kecap

Limbah ampas kecap merupakan sisa hasil buangan proses produksi kecap

yang berbentuk padat. Kecap merupakan salah satu jenis bumbu khas Indonesia,

baik di perdesaan maupun di perkotaan sehingga produsen terus mengembangkan

usahanya (Nugroho et al., 1998). Peningkatan tersebut menyebabkan peningkatan

pula pada limbah hasil sisa produksi (ampas kecap). Proses pembuatan kecap

diawali dengan memfermentasi kedelai yang telah dicuci bersih kemudian diberi

Aspergillus oryzae. Setelah proses fermentasi selesai dilakukan pemasakan

kemudian setelah matang disaring. Hasil saringan padat merupakan limbah ampas

kecap, sedangkan yang cair diolah lagi menjadi kecap dengan dengan

penambahan gula dan bumbu. Pembuatan kecap secara fermentasi pada

prinsipnya yaitu pemecahan protein, lemak dan karbohidrat menjadi senyawa

yang lebih sederhana sehingga diperoleh pula ampas kecap yang memiliki

senyawa sederhana (Ernawati, 2010). Limbah ini terus meningkat seiring dengan

peningkatan kebutuhan manusia terhadap kecap sebagai bahan tambahan dalam

mengolah masakan.

Hasil uji PT. Lombok Gandaria (2009) terhadap limbah ampas kecap hasil

produksinya (Lampiran 1), disebutkan bahwa limbah ampas kecap tersebut

103

mengandung nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg),

besi (Fe), natrium (Na), mangan (Mn), seng (Zn), belerang (Zn), klor (Cl) dan

karbon organic (C). Kandungan nutrien tersebut dapat dimanfaatkan sebagai

pupuk alternatif pengganti pupuk kimia yang saat ini digalakan untuk dikurangi

penggunaannya. Las (2006) menyatakan bahwa pupuk kimia telah mencemari

sebagian sumber daya lahan, air dan lingkungan. Penggunaan pupuk kimia

meningkat enam kali lipat setiap tahun.

Limbah ampas kecap mengandung magnesium sebesar 0,06 %. Aminot and

Rey (2000) menyatakan bahwa magnesium merupakan prekursor dalam

pembentukan klorofil a dalam proses fotosintesis. Pernyataan tersebut telah

dibuktikan dari hasil penelitian Granick (1948) pada isolasi magnesium

protoporphyrin dari Chlorella diketahui bahwa sintesis klorofil diawali dengan

sintesis protoporphyrin, tahap selanjutnya adalah penyisipan magnesium.

Klorofil berfungsi sebagai antioksidan (Kamat et al., 2000). Hasil penelitian

Endo et al., (1984) diketahui bahwa magnesium berfungsi dalam memperkuat

aktifitas antioksidan yang dimiliki oleh klorofil.

2.5 Proses fotosintesis

Fotosintesis merupakan suatu proses pembentukan glukosa dari senyawa

anorganik dengan bantuan energi cahaya. Pembentukan molekul glukosa

memerlukan bahan anorganik (H2O dan CO2) dan energi sekitar 2000 kkal per

mol glukosa. Selain bahan anorganik (CO2 dan H2O) diperlukan alat (antena)

yang digunakan untuk menangkap energi cahaya disebut pigmen. Strickland

(1960) menyatakan bahwa pigmen S. platensis berupa klorofil yang merupakan

pusat penyerap energi cahaya. Lips and Avissar (1986) juga menyatakan bahwa

104

fikosianin dan karotenoid yang membantu penyerapan energi cahaya tersebut.

Klorofil a yang dengan kuat mengabsorbsi cahaya biru dan merah dengan panjang

gelombang (670 nm). Karotenoid yang mengabsorbsi cahaya hijau dan biru

dengan panjang gelombang antara 400 - 540 nm dan fikosianin yang

mengabsorbsi cahaya hijau dengan panjang gelombang antara 545 650 nm (Lips

and Avissar, 1986).

Proses fotosintesis terjadi pada kloroplas yang memiliki tumpukan kantung

tipis disebut grana. Setiap kantung tipis pada satu grana disebut tilakoid. Tilakoid

dikelilingi oleh membran yang merupakan tempat untuk menyimpan klorofil.

Didalam kloroplas terdapat pula matriks seperti gel yang disebut stroma. Grana

dan stroma yang berperan dalam proses fotosintesis. Fotosintesis terdiri dari dua

reaksi yaitu reaksi terang dan reaksi gelap. Reaksi terang merupakan reaksi yang

mengubah energi cahaya menjadi energi kimia. Reaksi terang ini terjadi di grana

menghasilkan ATP dan NADPH. Reaksi gelap merupakan reaksi yang

berlangsung pada stroma, memerlukan ATP, NADPH dan menghasilkan

karbohidrat. Proses fotosintesis terdapat pada Lampiran 5.

2.6 Klorofil a

Struktur klorofil terdiri atas cincin porfirin dan rantai fitol. Elektron pada cincin berada dalam sistem

terkonjugasi, sehingga dapat bergerak bebas. Akibatnya, cincin berpotensi menangkap atau melepaskan

elektron, dan memberikannya pada molekul lain (Kurniasih, 2001)

Kandungan klorofil alga berkisar 0,5-1,5 % bobot keringnya. Klorofil merupakan pigmen utama bagi

alga dan merupakan pusat reaksi fotosintesis. Spirulina hanya memiliki klorofil a dari lima jenis klorofil

yang ada pada tumbuhan; yaitu klorofil a, b, c, d, dan e. Keberadaan jenis klorofil lain selain klorofil a pada

kultur Spirulina menunjukkan adanya kontmninasi oleh alga lain (Becker, 1994).

Proses sintesis klorofil a diawali dengan proses pembentukan glutamat yang

105

terbetuk dari bahan cadangan karbohidrat bersama dengan NH4+. Proses

pembentukan tersebut dapat pada Gambar 2. Proses ini terjadi di plastid (stroma

kloroplas). Glutamat diaktifkan ke dalam bentuk Glu-tRNAGlu. Glutamat

direduksi oleh Gluta-reduktase myl-tRNA (Glu-R) membentuk asam glutamat 1-

semialdehid (GSA) yang kemudian dibentuk menjadi d-aminolevulinic acid

(ALA) dengan bantuan enzim GSA amino trasferase.

Gambar 3. Pembentukan glutamat (Kaplan et al., 1986)

Dua molekul d-aminolevulinic acid (ALA) digunakan untuk membentuk

por-phobilinogen (PBG). Empat molekul PBG membentuk menjadi tetrapyrrole

linear, biasa disebut dengan hydroxymethylbilane, kemudian dibentuk menjadi

uroporphyrinogen (uro) III. Uroporphyrinogen (uro) III direduksi menjadi

kelompok metil, menghasilkan coproporphyrinogen (Copro) III dengan bantuan

Uro III decarboxylase. Lalu, coproporphyrinogen (Copro) III direduksi

membentuk protoporphyrinogen (Protogen) IX, yang kemudian dioksidasi

menjadi protoporfirin (Proto) IX. Kemudian terjadi penyisipan sebuah Ion Mg2

di pusat Proto-IX menjadi Mg-Proto-IX. Mg-Proto-IX merupakan alkohol untuk

menghasilkan monomethyl ester Mg-Proto-IX (Mg-Proto-IX-Mme).

COOH COOH

CH2 + NH3 + NADPH + H+

CH2 + NADP+ + NH2 + H2O

CH2 CH2

CO CHNH2

COOH COOH

106

Gambar 4. Mekanisme sintesis klorofil (Schoefs and Bertrand, 2004)

Setelah monomethyl ester Mg-Proto-IX terbentuk proses selanjutnya terjadi

di membrane kloroplas. Langkah berikutnya adalah terbentuk cincin isocyclic

sehingga menjadi protochlorophyl- LiDE (Pchlide) sintesis. Pchlide direduksi

menjadi kloro-phyllide (Chlide), yang baik esterifikasi membentuk klorofil a

(CHL) atau dioksidasi menjadi Chlide b (klorofil b). Mekanisme sintesis klorofil

dapat diliahat pada Gambar 3 dan struktur kimia klorofil a dapat dilihat pada

gambar 4.

107

Gambar 5. Klorofil a (Barr and Crane, 2005)

2.7 Klorofil Sebagai Antioksidan

Antioksidan adalah bahan untuk menangkal radikal bebas. Radikal bebas

merupakan molekul yang mempunyai elektron pada orbit luarnya yang tidak

berpasangan sehingga cenderung menarik elektron (Southorn and Powis. 1988).

Molekul ini mempunyai reaktifitas tinggi dan cenderung membentuk radikal baru,

sehingga terjadi reaksi rantai (chain reaction). Radikal bebas ini tidak stabil,

kadar rendah, dan waktu paruh pendek sehingga sulit dideteksi. Radikal bebas

secara normal terbentuk dalam jumlah kecil pada metabolisme normal karena

untuk melawan mikroorganisme patogen. Pada keadaan tertentu misalnya

terpapar sinar ultraviolet, menyebabkan konsentrasi radikal bebas meningkat

sampai 300 kali. Keadaan ini dapat merusak membran sel, mengubah bentuk

DNA, serta mengganggu proses metabolisme di dalam tubuh (Halliwell and

Gutteridge, 1999). Efek radikal bebas dalam tubuh akan dinetralisir oleh

antioksidan (electron donor) yang dibentuk oleh tubuh sendiri dan suplemen dari

luar melalui makanan, minuman atau obat-obatan, seperti klorofil (Kamat et al., 2000).

108

Mekanisme antioksidan dalam menghambat proses oksidasi atau

menghentikan reaksi berantai pada radikal bebas dikelompokkan menjadi dua

yaitu antioksidan primer dan antioksidan sekunder. Antioksidan primer

merupakan antioksidan yang mengikuti mekanisme pemutusan rantai reaksi

radikal dengan mendonorkan atom hidrogen secara cepat pada suatu lipid radikal.

Antioksidan sekunder merupakan antioksidan yang dapat menghilangkan

penginisiasi oksigen maupun radikal atau bereaksi dengan komponen atau enzim

yang menginisiasi reaksi radikal antara lain dengan menghambat enzim

pengoksidasi dan menginisiasi enzim pereduksi atau mereduksi oksigen tanpa

membentuk spesies radikal yang reaktif.

Klorofil a sebagai antioksidan berperan sebagai pemecahan rantai radikal

bebas dengan mendonorkan hidrogen. Radikal bebas Reaksi klorofil sebagai

sebagai antioksidan (Endo et al., 1984) adalah:

Tahap awal mekanisme antioksidan yaitu klorofil bertemu dengan radikal

peroksi yang dihasilkan dari proses oksidasi minyak diubah kedalam bentuk

kation radikal klorofil. Kation radikal klorofil berikatan dengan (-) radikal peroksi

negatif membentuk ikatan kompleks radikal. Selanjutnya, ikatan kompleks

bereaksi dengan radikal peroksi lain menghasilkan produk yang inaktif. Rantai

reaksi yang melibatkan radikal bebas berhenti dengan reaksi ini.

ROO + Klorofil ROO (-)

+ Klorofil (+)

ROO (-)

+ Klorofil (+)

+ ROO Inaktif produk

109

2.8 Pengujian Antioksidan

Metode Malondialdehid (MDA)

Malondialdehid (MDA) kadang disebut malonaldehid, merupakan salah satu

golongan aldehid yang dihasilkan akibat peroksidasi asam lemak poli tak jenuh

yang mempunyai ikatan rangkap lebih. Peningkatan kadar MDA dalam suspensi

lazim digunakan sebagai salah satu indikator untuk peroksidasi lipid membran

(Halliwell and Gutteridge, 1999). Asam lemak tak jenuh ganda yang mengandung

dua atau lebih ikatan rangkap sangat rentan terhadap oksidasi oleh radikal bebas

atau molekul-molekul reaktif lainnya. Molekul reaktif seperti radikal hidroksil

menarik atom hidrogen dari ikatan rangkap asam lemak tak jenuh dan membentuk

radikal peroksil lipid. Radikal ini kemudian bereaksi dengan asam lemak tak

jenuh lainnya membentuk hidroperoksida lipid dan radikal peroksil lipid yang

baru, yang kemudian meneruskan reaksi oksidasi terhadap lipid lainnya, biasa

disebut dengan auto-oksidasi lipid atau peroksidasi lipid. Proses tersebut juga

akan membentuk endoperoksida siklik yang akan terurai menjadi malondialdehida

(Kl et al., 2003).

Malondialdehid (MDA) mempunyai berat molekul rendah merupakan satu

dari beberapa molekul hasil penguraian endoperoksida lipid yang terbentuk

selama proses peroksidasi lipid. MDA menjadi alat ukur yang paling banyak

digunakan sebagai indikator peroksidasi lipid. Pengukuran kadar MDA dilakukan

dengan dasar reaksi MDA dengan asam tiobarbiturat yang membentuk senyawa

berwarna dan mengabsorbsi sinar dengan panjang gelombang 532 nm (Mardiani,

2008). Senyawa berwarna tersebut dapat diukur konsentrasinya berdasarkan

absorbansi warna yang terbentuk, dengan membandingkannya pada absorbansi

110

warna larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya menggunakan

spektrofotometer.

2.9 Timbal (Pb)

Timbal (Pb) merupakan senyawa yang berasal dari pembakaran bahan bakar

kendaraan bermotor, emisi industri, penggunaan cat bangunan dan lain-lain yang

banyak ditemui di lingkungan sekitar dalam bentuk gas dan partikel. Sifat

toksikologi timbal saat ini banyak diteliti terutama efek karsinogeniknya. Telah

diketahui bahwa timbal dapat menyebabkan stres oksidatif dengan meningkatkan

pembentukan radikal bebas dan menurunkan sistem antioksidan dijaringan. Stres

oksidatif ini dapat menyebabkan kerusakan molekul-molekul dalam sel.

Molekul lipid yang mengalami stres oksidatif akan mengalami autooksidasi atau

yang lebih dikenal dengan peroksidasi lipid. Protein yang mengalami oksidasi

menjadi tidak berfungsi dan DNA yang teroksidasi menjadi mutagen, karsinogen

atau menyebabkan kematian sel (Ercal et al., 2001).

Sel darah merah memiliki affinitas yang tinggi terhadap timbal (Pb). Setelah

diresorbsi dari saluran pencernaan, timbal (Pb) masuk ke sirkulasi darah dan lebih

dari 99% akan berikatan dengan eritrosit. Pada eritrosit 80% timbal (Pb) terdapat

di sitoplasma sel dan 20% sisanya terdapat pada membran (Zhao et al., 2004).

Beberapa faktor seperti konsentrasi oksigen tinggi, autooksidasi Hb dan kepekaan

komponen membran terhadap peroksidasi lipid menyebabkan eritrosit peka

terhadap stres oksidatif oleh karena timbal (Pb) (Gurer-Orhan et al., 2003).

Kepekaan komponen membran disebabkan adanya asam lemak tak jenuh

peroksidasi lipid yang ada pada membran tersebut.

111

Peroksidasi lipid adalah suatu reaksi rantai radikal bebas yang diawali

dengan terbebasnya hidrogen dari suatu asam lemak tak jenuh ganda oleh radikal

bebas. Radikal lipid yang terbentuk akan bereaksi dengan oksigen membentuk

radikal peroksi-lipid dan lipid peroksida serta malondialdehyde (MDA) yang

larut dalam air dan dapat dideteksi dalam darah. Konsekuensi penting dari

peroksidasi lipid adalah meningkatnya permeabilitas membran dan menganggu

distribusi ion-ion yang mengakibatkan kerusakan fungsi sel dan organela (Devlin,

2002).

112

III KERANGKA KONSEPTUAL PENELITIAN DAN HIPOTESIS

3.1 Kerangka Konseptual Penelitian

S. platensis merupakan salah satu jenis alga yang sangat diminati sebagai

suplemen kesehatan manusia sejak akhir tahun 1970 (Vonshak, 1997). Salah satu

manfaat dari suplemen S. platensis adalah sebagai sumber antioksidan yang

berasal dari klorofil a S. platensis. Peningkatan kebutuhan S. platensis akan terus

terjadi seiring dengan peningkatan populasi manusia sehingga para produsen

berusaha semaksimal mungkin untuk meningkatkan hasil produksinya.

Usaha yang dapat mendorong peningkatan produksi Spirulina adalah

dengan meningkatkan pertumbuhan yang akan memacu peningkatan klorofil a

(Kutner and Ajdar, 1905). Harrison and Berges (2005) menyatakan bahwa salah

satu cara untuk meningkatkan pertumbuhan adalah dengan mengoptimalkan

kandungan nutrien baik makro maupun mikro pada media kultur. Salah satu

alternatif untuk membuat media kultur S. platensis dari bahan alami dengan biaya

murah serta memiliki unsur makro dan mikro yang optimal adalah dengan

memanfaatkan limbah ampas kecap.

Pemanfaatan limbah ampas kecap sebagai pupuk akan mengurangi

penggunaan pupuk kimia. Hasil pengujian PT. Lombok Gandaria (2009) pada

limbah ampas kecap hasil buangan produksi menyebutkan bahwa ampas kecap

tersebut mengandung nitrogen, fosfor, kalium, kalsium, magnesium, besi,

natrium, mangan, seng, belerang, klor dan karbon organik yang merupakan unsur

penunjang pertumbuhan. Magnesium yang dimiliki limbah ampas kecap

merupakan unsur penting dalam sintesis klorofil (Rissler et al., 2002).

113

Sntesis klorofil diawali dengan proses fotosintesis yang merupakan reaksi

Fotosintesis merupakan suatu proses oksidasi air dan reduksi CO2 untuk

membentuk karbohidrat (Salisbury and Ross, 1995). Cadangan karbohidrat dan

NH3 membentuk glutamat kemudian menjadi protoporfirin. Setelah terbentuk

protoporfirin terjadi penyisipan sebuah Ion Mg2 menjadi magnesium

protoporfirin. Langkah berikutnya adalah terbentuk cincin isocyclic sehingga

menjadi pchlide. Pchlide direduksi menjadi kloro-phyllide (Chlide), yang

diesterifikasi membentuk klorofil a (Schoefs and Bertrand, 2004).

Penyisipan magnesium dalam proses sintesis klorofil merupakan bukti

pentingnya unsur tersebut. Hasil penelitian Granick (1948) pada sel Chlorella

diketahui bahwa proses pembentukan klorofil terjadi setelah sintesis protoporfirin

kemudian disisipkan magnesium. Magnesium merupakan komponen unsur logam

utama sebagai atom pusat dari klorofil a dan defisiensi magnesium akan

menghambat pembentukan klorofil a (Riyono, 2007).

Klorofil a sebagai antioksidan merupakan senyawa yang dapat

memperlambat atau mencegah proses oksidasi (Hudson, 1990). Antioksidan dapat

menghambat laju oksidasi bila bereaksi dengan radikal bebas. Proses oksidasi

mudah terjadi pada asam lemak tidak jenuh biasa disebut dengan reaksi

peroksidasi lipid. Reaksi peroksidasi lipid dimulai dengan keluarnya atom

hidrogen dari asam lemak tidak jenuh. Radikal lipid yang terbentuk kemudian

bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksil. Akan terjadi reaksi rantai

radikal, ketika radikal peroksil ini menarik atau mengeluarkan atom hidrogen dari

molekul asam lemak yang lain. Rantai reaksi ini terus berlanjut jika radikal bebas

114

yang terbentuk bereaksi dengan molekul-molekul lain disekitarnya (Mardiani,

2008).

Mekanisme antioksidan klorofil yaitu klorofil bertemu dengan radikal

peroksil yang dihasilkan dari proses oksidasi lemak diubah kedalam bentuk kation

radikal klorofil. Kation radikal klorofil berikatan dengan (-) radikal peroxy negatif

membentuk ikatan kompleks radikal. Selanjutnya, ikatan kompleks bereaksi

dengan radikal peroxy lain menghasilkan produk yang inaktif. Rantai reaksi yang

melibatkan radikal bebas berhenti dengan reaksi ini. Hasil penelitian Endo et al.

(1984) diketahui bahwa magnesium juga berfungsi dalam memperkuat aktifitas

antioksidan yang dimiliki oleh klorofil.

Pengujian kadar antioksidan dapat dilakukan dengan metode

malondialdehid (MDA). Metode MDA adalah metode dengan mengukur kadar

malondialdehid yang merupakan produk hasil reaksi peroksidasi lipid pada darah

sehingga akan terukur aktivitas antioksidan secara in vivo. Gil et al. (2010)

menyatakan bahwa malondialdehid (MDA) merupakan produk hasil reaksin lipid

peroksida. Mardiani (2008) menyatakan bahwa pengukuran kadar malondialdehid

diawali dengan memacu kadar radikal bebas yang ada didalam tubuh hewan coba,

salah satunya dengan logam berat (timbal). Uji histopatologi digunakan untuk

melihat kerusakan jaringan akibat radikal bebas. Hasil pengujian tersebut

diharapkan S. platensis sebagai antioksidan dapat menghambat proses radikal

sehingga dapat menurunkan kadar lipid perosida (malondialdehid).

115

Mg2

Bahan antioksidan alami

Menstabilkan elektron

tunggal akibat radikal

bebas (Pb)

Diuji dengan metode

Malondialdehid

Kadar lipid peroksida

Klorofil

a

Kebutuhan bahan alami untuk meningkatkan antioksidan tubuh manusia

Bahan alami (S. platensis)

Protoporfirin (Proto)

Kultur S. platensis

Nutrien (memanfaatan limbah ampas kecap sebagai

pupuk organik untuk proses fotosintesis)

Hasil fotosintesis (karbohdirat) dan NH3

Glutamat

Bereaksi dengan komponen atau enzim yang

menginisiasi reaksi radikal

1. Inisiasi, 2. Propagasi, 3. Terminasi

Diperkuat

dengan uji

Histopatologi

Mg2

116

Gambar 6. Bagan kerangka konseptual penelitian

3.2 Hipotesis Penelitian (H1)

a. Terdapat pengaruh pemberian limbah ampas kecap sebagai pupuk organik

terhadap kepadatan dan klorofil a dari S. platensis.

b. Terdapat perbedaan aktifitas antioksidan (klorofil a) S. platensis yang

dikultur pada media asal limbah ampas kecap dibandingkan S. platensis

komersil.

c. Terdapat perbedaan histopatologi hati mencit yang telah diberi secara oral S.

platensis (klorofil a) hasil kultur pada media asal limbah ampas kecap

dibandingkan dengan S. platensis komersil.

117

IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat

Pelaksanaan penelitian ini dilakukan pada tanggal 01 Agustus sampai

dengan 30 Desember 2011 di Laboratorium Pendidikan Perikanan Fakultas

Perikanan dan Kelautan, Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran,

Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga,

Laboratorium Budidaya Perikanan, Universitas Hang Tuah dan Balai Karantina

Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas 1 Surabaya 1.

4.2 Materi Penelitian

Materi penelitian yang digunakan terdiri atas bahan dan alat penelitian.

Bahan penelitian yang digunakan adalah S. platensis, limbah ampas kecap (PT.

Lombok Gandaria Karanganyar), pupuk Walne (BBPAP Jepara) komposisi pada

Lampiran 2, air laut (situbondo dan pasar ikan Gunung sari), aquades (Brataco),

khlorin (Brataco), Na Thiosulfat (Brataco), alkohol (Brataco), klorofil a standart

(nacalai-Japan), metanol absolut (Cat), etanol (1.06009.2500 dietil eter), buffer

fosfat (Lab. Kimia, LPPMHP Surabaya), metanol KOH (Cat), Thiobabituric acid

(Lab. Biokimia FK), larutan PBS (Lab. Biokimia FK) dan HCl (Sigma).

Peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah steroform, toples kaca

volume 800 mL, aerator set, selang aerator, gabus, gelas ukur, erlenmeyer, pipet

tetes, pipet volume, mikroskop, homogenezer, handtally counter, autoclave

American 25X, haemacytometer, spectrophotometer 788B, sentrifuge Hettich

EBA-20, stirer hot plate, refraktometer, pH paper, termometer, timbangan digital

Ohaus PA 2102, timbangan digital OHAUS Analytical Balance PA413, lampu TL

40 watt, kapas, corong air, kasa, aluminium foil, waterbath dan kertas saring.

118

4.3 Metode Penelitian

4.3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Penelitian tahap pertama bertujuan

untuk mendapatkan dosis pupuk limbah ampas kecap terbaik untuk menunjang

pertumbuhan S. platensis. Penentuan dosis perlakuan pada penelitian tahap I,

berdasarkan kesetaraan konsentrasi nitrogen dalam media antara media dari

limbah ampas kecap dengan media Walne (Lampiran 3). Penetilian tahap kedua

bertujuan untuk mengetahui waktu hari diproduksi klorofil a S. platensis tertinggi

(Hari ke berapa). Dosis pupuk yang digunakan pada penelitian tahap II,

berdasarkan hasil penelitian tahap I.

Penelitian tahap III betujuan untuk mengetahui efek pemberian S. platensis

hasil kultur dengan menggunakan pupuk limbah ampas kecap dibandingkan

dengan S. platensis komersil terhadap pengaruh radikal bebas yang dinyatakan

dalam (parameter metode MDA). Dosis pupuk limbah kecap yang digunakan

untuk produksi S. platensis pada penelitian tahap III, berdasar pada hasil

penelitian tahap I. Umur kultur S. platensis yang diberikan pada mencit,

berdasarkan hasil penelitian tahap II, yang menghasilkan ketiga pigmen klorofil a

paling tinggi.

Penelitian tahap III pada metode malondialdehid (MDA), pengujian aktifitas

antioksidan S. platensis menggunakan hewan coba mencit secara oral yang

sebelumnya telah diberi timbal (Pb) secara oral. Fauzi (2008) menyatakan, timbal

(Pb) mampu sebagai pemacu peningkat kadar radikal bebas di dalam tubuh mencit

yang diukur dengan metode malondialdehid (MDA). Desain penelitian

ditampilkan pada Gambar 7.

119

Kultur S. platensis

D A E B D C

B F A E C A

F B E C E F

D C F D A B

(PenelitianTahap I)

Eksplorasi waktu produksi klorofil a

Hari ke-1 Hari ke-2 Hari ke-3 Hari ke-4 Hari ke-5 Hari ke-6 Hari ke-7 Hari ke-8

(Penelitian Tahap II)

Perlakuan pada Mencit (Mus musculus)

b a b b a b a b

a a b a b a b a

(Penelitian Tahap III)

Gambar 7. Desain penelitian

Keterangan :

A : Dosis pemberian pupuk yang berasal dari limbah ampas kecap 0 mL/L

B : Dosis pemberian pupuk yang berasal dari limbah ampas kecap 0,9 mL/L

C : Dosis pemberian pupuk yang berasal dari limbah ampas kecap 1,8 mL/L

D : Dosis pemberian pupuk yang berasal dari limbah ampas kecap 2,7 mL/L

E : Dosis pemberian pupuk yang berasal dari limbah ampas kecap 3,6 mL/L

F : Dosis pemberian pupuk Walne

aa : Mencit yang diberi S. platensis komersil

bb : Mencit yang diberi S. platensis hasil kultur dari limbah ampas kecap

Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap

(RAL), sebab dalam penelitian ini semua dikondisikan sama kecuali perlakuan

(Kusriningrum, 2008). Pada penelitian tahap I terdiri dari 6 perlakuan dengan 4

ulangan. Pada penelitian tahap II (eksplorasi waktu produksi) terdiri dari 4

ulangan. Pada penelitian tahap III terdiri dari 2 perlakuan dengan 8 ulangan.

Dosis yang digunakan dalam penelitian tahap I berdasarkan kesetaraan

konsentrasi nitrogen dalam media antara media dari limbah ampas kecap dengan

media Walne (Lampiran 3). Hasil pengukuran nitrogen di Laboratorium Kimia,

Laboratorium Pembinaan dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP)

Provinsi Jawa Timur bahwa 100 g/L pupuk limbah ampas kecap mengandung

nitrogen 1,3172 % dan pupuk Walne mengandung nitrogen 2,3835 %

120

(Lampiran 20). Pupuk Walne merupakan salah pupuk yang dapat memberikan

pertumbuhan terbaik dari S. pletensis. Pernyataan ini sesuai dengan hasil

penelitian Widianti (2009) bahwa pupuk Walne berpengaruh sangat nyata

terhadap pertumbuhan S. platensis dibandingkan pupuk Zarrouk dan pupuk

TMRL.

4.3.2 Prosedur Kerja

A. Sterilisasi Peralatan dan Media Kultur

Kultur skala laboratorium merupakan kultur yang murni atau monospesies

sehingga diperlukan kesterilan media kultur dan peralatan dengan proses

sterilisasi. Kawachi and Nol (2005) mengemukakan, sterilisasi merupakan suatu

proses untuk menjaga kondisi aseptik dengan cara menghilangkan atau membunuh

mikroorganisme. Air laut yang akan digunakan untuk kultur dengan salinitas 32

ppt disterilisasi menggunakan larutan khlorin. Air laut terlebih dahulu disaring

dengan kapas yang diletakkan dalam corong air, kemudian disterilkan dengan

khlorin 60 ppm selama 24 jam. Sisa-sisa khlorin dihilangkan dengan memberikan

Na Thiosulfat 20 ppm dan diaerasi sampai khlorin hilang yang ditandai dengan

bau khlorin sudah tidak ada. Air laut yang sudah steril disimpan dalam wadah

yang tidak tembus cahaya dan tertutup rapat (Ekawati, 2005).

Peralatan kultur yang akan digunakan dicuci sampai bersih kemudian

dibilas air tawar dan dikeringkan. Peralatan yang terbuat dari kaca tahan panas

harus ditutup dengan kapas dan kasa, kemudian peralatan tersebut dibungkus

dengan aluminium foil. Setelah peralatan terbungkus, disterilisasi menggunakan

autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit. Peralatan yang tidak tahan panas

121

disterilkan dengan larutan klorin 150 ppm selama 24 jam, kemudian peralatan

tersebut dibilas dengan air tawar hingga bersih dan bau khlorin hilang.

B. Persiapan Limbah Ampas Kecap

Limbah ampas kecap yang akan digunakan sebagai pupuk dalam

penelitian diperoleh dari PT. Kecap Gandaria, jalan Raya Jaten Km. 7,

Karanganyar, Surakarta, Jawa Tengah. Konsentrasi media kultur limbah ampas

kecap yang akan digunakan dalam penelitian tahap I adalah 0,9 - 3,6 mL/L. Proses

pembuatan media kultur limbah ampas kecap dimulai dengan pengeringan limbah

ampas kecap menggunakan oven dengan suhu berkisar antara 60 - 70oC selama 24

jam. Limbah ampas kecap yang sudah kering kemudian digiling menjadi serbuk.

Serbuk limbah ampas kecap kemudian ditimbang sebanyak 10 g lalu

dilarutkan dalam 100 mL aquades. Larutan limbah ampas kecap kemudian

dimasukkan ke dalam erlenmeyer sambil disaring dengan kertas saring.

Erlenmeyer yang berisi larutan limbah ampas kecap kemudian ditutup dengan

gause (kapas yang balut dengan kasa) dan dibalut dengan aluminium foil lalu

disterilkan menggunakan autoclave. Pembuatan larutan limbah ampas kecap

kering untuk kultur Spirulina platensis menggunakan rumus (Rosales, 1982):

Keterangan:

Q = berat bahan yang dilarutkan (mg, gram)

V = volume pelarut/ aquadest (mL, L)

P = volume penggunaan dalam media kultur (mL/L)

K = konsentrasi pupuk yang akan digunakan (ppm, mg/L)

C. Penebaran Bibit S. Platensis

122

S. platensis murni diperoleh dari Balai Besar Budidaya Air Payau

Situbondo. Bibit S. platensis dimasukkan ke dalam toples kaca dengan kepadatan

10.000 unit/ml. Suryati (2002) mengemukakan, kepadatan optimum untuk kultur

Spirulina sp. adalah 10.000 unit/ml. Unit Spirulina sp. yaitu 1 panjang gelombang

(1 lembah 1 gunung). Jika dalam akhir penghitungan terdapat jumlah pecahan

maka dibuat patokan bahwa pecahan diatas 0,5 dibulatkan menjadi 1 dan pecahan

dibawah 0,5 tidak ikut dihitung. Penghitungan jumlah bibit (pengenceran) S.

platensis untuk kultur menggunakan rumus (Edhy et al., 2003):

Keterangan:

V1 = Volume bibit untuk penebaran awal (ml)

N1 = Kepadatan bibit/ stock S. platensis (unit/ml)

V2 = Volume media kultur yang dikehendaki (L)

N2 = Kepadatan bibit S. platensis yang dikehendaki (unit/ml)

D. Kultur

Kultur diawali dengan menghitung kepadatan stok bibit S. platensis yang

dimiliki. Setelah diketahui, dilakukan penghitungan jumlah bibit (pengenceran)

yang diinginkan, jumlah bibit yang dibutuhkan dikurangi jumlah media kultur

yang diinginkan yaitu 0,5 liter, sehingga didapatkan jumlah air laut yang

dibutuhkan. Media kultur yang digunakan dalam penelitian adalah air laut (32

ppt). Air alut yang dibutuhkan dimasukkan dalam toples kaca kemudian

ditambahkan larutan limbah ampas kecap sesuai dengan konsentrasi yang

ditentukan. Selanjutnya, media kultur diletakkan di rak kultur lalu diberi aerasi

dan siap dimasukkan bibit S. platensis dengan kepadatan yang diinginkan. Rak

kultur ditutup dengan plastik hitam, upaya suhu ruang stabil, menghindari

123

kontaminan dan mengatur photoperiode. Lingkungan kultur dapat mempengaruhi

pertumbuhan S. platensis, oleh karena itu lingkungan dikondisikan sama untuk

setiap perlakuan. Lingkungan kultur S. platensis yang diharapkan dalam

penelitian adalah suhu 28 - 32oC, salinitas 32 ppt, pH 8 - 9, intensitas cahaya 1800

- 1900 lux dan photoperiod 12 jam keadaan terang dan 12 jam keadaan gelap.

E. Perhitungan pertumbuhan populasi S. platensis

Pertumbuhan populasi dihitung dengan cara menghitung jumlah unit S.

platensis, tidak menghitung jumlah sel sebab sel S. platensis sulit diamati (ukuran

kecil dan saling bertumpuk-tumpukan). Penghitungan dilakukan dengan

menggunakan Sedgewick Raffter dan Handtally Counter untuk memudahkan

perhitungan. Pengamatan pertumbuhan S. platensis dilakukan setelah 24 jam

penebaran awal setiap hari. Weng et al. (2008) menyatakan bahwa pengamatan

pertumbuhan Dinophyceae (fitoplankton) dilakukan 24 jam setelah penebaran

awal setiap hari.

Perhitungan dilakukan dengan rumus (Ekawati, 2005):

( )

Keterangan:

N = Kepadatan S. platensis (unit/ ml)

d = Diameter bidang pandang (mm)

n = Jumlah rata-rata S. platensis per bidang pandang (unit/ ml)

F. Klorofil a

Pengukuran kadar klorofil a menggunakan metode yang berasal dari

Vonshak (1997). Sebanyak 10 mL hasil kultur S. platensis disentrifuge pada

kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Hasil supernatan sentrifuge

124

dibuang dan pellet S. platensis yang berada di dasar tube diekstraksi dengan 10

mL metanol absolut, didistrupsi dengan homogenezer dan diinkubasi pada suhu

70 oC selama 2 menit. Setelah itu campuran disentrifuge pada kecepatan 3000 rpm

selama 5 menit, filtrat yang diperoleh diukur serapannya pada panjang

gelombang 665 nm. *Koefisien absorbansi : 169. Rumus perhitungan kadar

klorofil a berasal dari Vonshak (1997) yaitu:

Klorofil (mg/L) = Koefisien Absorbansi x A665

G. Pemeliharaan Mencit

Penelitian tahap ketiga ini terdiri dari dua perlakuan yaitu pemberian S.

platensis komersil dan S. platensis hasil kultur dengan limbah ampas kecap. Setia

perlakuan terdiri dari 12 ekor mencit. Mencit yang digunakan dalam penilitian

untuk keseragaman berjenis kelamin jantan, memiliki berat berkisar antara 12 - 14

gram. Tempat pemeliharaan mencit disebuah rak yang berada pada ruang tertutup

memiliki beberapa buah jendela sebagai tempat sumber cahaya dan sirkulasi

udara. Pakan yang diberikan berupa pellet komersil dan air minum berasal dari

PDAM diberikan secara ad libitum. Sertifikat kelaikan etik sebagai tanda

kelayakan dalam pemeliharaan hewan coba dapat dilihat dalam Lampiran 21.

H. Pemberian S. platensis komersil dan S. platensis Hasil Kultur dengan Limbah Ampas Kecap yang telah Diberi Timbal (Pb) pada mencit

Pemberian S. platensis hasil kultur dengan limbah ampas kecap pada mencit

bertujuan untuk mengetahui aktifitas antioksidan dari S. platensis tersebut. S.

platensis klorofil a bermanfaat sebagai antioksidan (Kusmita and Limantara,

2009). Prangdimurti et al. (2006) menyatakan bahwa dosis klorofil pada

pengujian aktivitas antioksidan menggunakan tikus yaitu 0,2 mg klorofil/10 gram

125

berat badan. Dosis pada penelitian ini didapatkan setelah dilakukan penelitian

tahap 2 yaitu tahap pengujian kadar klorofil tertinggi dikonversikan dengan berat

S. platensis kering. Hasil penelitian diketahui bahwa empat liter S. platensis yang

diambil dari media kultur menghasilkan 1,6 gram berat S. platensis kering. S.

platensis yang diambil dari media kultur sebanyak 10 mL mengandung klorofil a

0,35 mg (pellet S. platensis dilarutkan ke dalam 10 mL metanol sehingga

didapatkan hasil 0,035 mg/mL). Klorofil a 0,2 mg dapat diperoleh pada S.

platensis sebanyak 2,2 mg S. platensis kering.

S. platensis hasil kultur dengan limbah ampas kecap serbuk diberikan pada

mencit dengan dosis 2,2 mg/10 gram berat badan. Sebagai pembanding digunakan

serbuk S. platensis komersil dengan dosis sesuai S. platensis hasil kultur dengan

limbah ampas kecap dosis 2,2 mg/10 g berat badan secara oral menggunakan

jarum oral/gavage setiap hari selama 7 hari.

Pengujian kadar antioksidan pada mencit diperlukan suatu zat yang dapat

meningkatkan kadar radikal bebas sehingga dengan penambahan S. platensis

dapat menurunkan kadar radikal bebas di dalam tubuh mencit. Bahan yang

digunakan dalam penelitian ini adalah timbal (Pb). Hasil penelitian Mardiani

(2008) bahwa pemberian timbal (Pb) dengan rentang konsentrasi terendah 0,05

gram/10 g berat badan ternyata sudah dapat meningkatkan peroksidasi lipid yang

diukur dengan kadar MDA plasma. Timbal (Pb) diberikan secara oral

menggunakan jarum oral/gavage setiap hari selama tujuh hari.

I. Metode Malondialdehid (MDA)

Pengukuran kadar malondialdehid (MDA) dilakukan di Laboratorium

Biokimia, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga. Prosedur pemeriksaan

126

malondialdehid (MDA) sebagai berikut, sampel yang berupa darah mencit

ditimbang sebanyak 1 g. Larutan PBS 9 mL dingin diambil lalu digerus kemudian

disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Setelah itu diambil

supernatannya lalu supernatan tersebut ditambahkan 1 mL larutan Thiobarbituric

Acid (TCA) 0,37% dalam HCl 0,25 N. Setelah itu bahan tersebut dipanaskan

dalam waterbath 80o C selama 15 menit lalu didinginkan pada suhu ruang selama

60 menit. Setelah dingin, bahan tersebut dicentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm

selama 15 menit. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi dengan panjang

gelombang 532 nm.

J. Pengujian Histopatologi Hati Mencit

Pemeriksaan histopatologi sampel dilakukan terhadap hati mencit yang

diberi timbal (logam berat), klorofil a S. platensis hasil kultur dengan limbah

ampas kecap ditambah timbal dan klorofil a S. platensis komersil ditambah timbal

dan tanpa diberi perlakuan (kontrol negatif). Sampel hati mencit diproses sebagai

blok parafin untuk pembuatan preparat histopatologi dan diwarnai dengan

Hematoxilin and Eosin. Selanjutnya preparat diperiksa secara mikroskopik untuk

mengetahui perubahan yang terjadi pada jaringan dari masing-masing sampel.

Cara pembuatan preparat histopatologi dapat dilihat pada Lampiran 4 (Bell and

Lightner, 1988 In Baumgartner et al. 2009). Preparat histopatologi hati mencit

normal (sehat), diberi timbal (logam berat), klorofil a S. platensis hasil kultur

dengan limbah ampas kecap plus timbal dan klorofil a S. platensis komersil plus

timbal diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x serta dilakukan

skoring untuk menentukan tingkat kerusakan pada jaringan. Penilaian kerusakan

127

jaringan hati berdasarkan Wulandari (2008) diklasifikasikan menjadi empat

kategori (Gambar terlampir pada