Ligasi dan Transformasi

Nadira Putri Pinasthika1306370814

Deskripsi DNA LigaseEnzim yang dibutuhkan untuk memperbaiki, replikasi, dan rekombinasi DNA

Digunakan untuk mengkatalisis formasi ikatan fosfodiester pada ikatan tunggal yang berasal dari pecahan ikatan ganda

Memiliki sekuens asam amino, ukuran molekul dan sifat yang berbeda-beda tiap jenisnya.

Ada 2 jenis DNA ligase berdasarkan spesifisitas kofaktornya, DNA ligase yang membutuhkan NAD+ dan DNA ligase yang membutuhkan ATP

Kebutuhan Proses LigasiApa yang dibutuhkan untuk proses ligasi?

1. Dua atau lebih fragmen DNA yang memiliki ujung blunt ataupun ujung ‘sticky’

2. Larutan buffer yang mengandung ATP. Larutan buffer biasa disiapkan pada konsentrasi tertentu hingga konsentrasi ATP mencapai 0,25 sampai 1 mM.

3. DNA ligase T4. Reaksi pemasukkan fragment ke dalam plasmid (subkloning) akan membutuhkan sekitar 0,01(untuk ujung ‘sticky’) hingga 1 unit (ujung ‘blunt’) ligase.

Mekanisme DNA Ligase

Mekanisme secara umum:1. Aktivasi ligase dengan

membentuk sebuah protein kovalen (AMP intermediet)

2. Bagian AMP ditransfer dari ligase ke grup fosfat ujung 5’ pada pecahan untai tunggal

3. DNA ligase mengkatalisis proses ligasi tersebut dengan menghilangkan AMP bebas

Tahapan Ligasi Endo-1,4-beta-D-glukanase

Vektor didefosfori

lasi mengguna

kan 10 unit

alkalin fosfatase

Reaksi tersebut diinkubasi pada 37°C selama 1 jam dan enzim

akan denaturasi pada 65°C

selama 1 jam

DNA yang telah

didefosforilasi dipurifikasi dengan DNA purification

kit (MBI Fermentas)

Memasukkan vektor dengan

perbandingan 3:1

Reaksi tersebut diinkubasi dalam larutan buffer DNA ligase (50 mM Tris-HCl pada pH 7,6; 10 mM MgCl2; 1 mM

ATP dan 1 mM DTT) selama 24 jam pada suhu 28°C

Transformasi DNAEkspresi materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel.

Diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982, berdasarkan penelitian bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNA nya ke dalam suatu medium ‐yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteriyang lain dalam kultur tersebut.

Bakteri diubah menjadi kompeten (istilah untuk bakteri yang siap bertransformasi), misalnya dengan mendinginkannya pada larutan yang mengandung kation divalen seperti Ca2+ untukmembuat dinding sel menjadi permeable dan dapat dilalui oleh DNA plasmid.

Proses TransformasiMolekul DNA rantai ganda berikatan pada reseptor yang terdapat dipermukaan sel. Perikatan ini bersifat reversible.

Pengambilan DNA donor yang bersifatirreversible. Pada saat ini DNA donor menjadi resisten terhadap enzim DNAase di dalammedium.

Konversi molekul DNA donor yang berupa rantaiganda menjadi molekul rantai tunggal melalui degradasi nukleotida terhadap salah satu rantai.

Integrasi (insersi kovalen) seluruh atau sebagian unting tunggal DNA donor tersebut kedalam kromosom resipien.

Segregasi danekspresi fenotipik gen donor yang telah terintegrasi

Teknik Heat-Shock

Teknik Elektroporasi

ReferensiSajidan. 2011. Transformasi Ekspresi Gen Asing dalam Sel Bakteri.

[http://sajidan.staff.fkip.uns.ac.id/2011/02/28/transformasi-ekspresi-gen-asing-dalam-sel-bakteri/] diakses pada Sabtu, 3 Oktober 2015 pukul 21.29

Sitorus, Dame Hartini Afrian. 2014. TRANSFORMASI BAKTERI DENGAN DNA DAN EKSPRESINYA. Bogor. [https://www.academia.edu/9702710/TRANSFORMASI_BAKTERI_DENGAN_DNA_DAN_EKSPRESINYA] diakses pada Sabtu, 3 Oktober 2015 pukul 21.00

Ahmed, Sibtain dkk. 2003. Cloning of Endoglucanase Genefrom Trichoderma harzianum in E.coli. Pakistan: Pakistan Journal of Life Science. [http://www.pjlss.edu.pk/pdf_files/2003_2/122-126.pdf] diakses pada Jumat, 2 Oktober 2015 pukul 22.00

Doherty, Aidan J. dkk. 2000. Structural and Mechanistic Conservation in DNA Ligation. Amerika: Oxford University Press [http://nar.oxfordjournals.org/content/28/21/4051.full.pdf+html] diakses pada Jumat, 2 Oktober 2015 pukul 21.48

Anonim. 1999. DNA Ligation. [http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.html] diakses pada Jumat, 2 Oktober 2015 pukul 22.17