I.

TUJUAN PRAKTIKUM

Untuk memisahkan atau menyingkirkan pengotor atau zat zat yang tidak diinginkan selain analit sehingga mendapatkan hasil yang valid. II. DASAR TEORI

A. PLASMA DARAHPlasma darah adalah komponen darah berbentuk cairan berwarna kuning yang menjadi medium sel-sel darah, dimana sel darah ditutup. 55% dari jumlah/volume darah merupakan plasma darah. Volume plasma darah terdiri dari 90% berupa air dan 10% berupa larutan protein, glukosa, faktor koagulasi, ion mineral, hormon dan karbon dioksida. Plasma darah juga merupakan medium pada proses ekskresi. Plasma darah dapat dipisahkan di dalam sebuah tuba berisi darah segar yang telah dibubuhi zat anti-koagulan yang kemudian diputar sentrifugal sampai sel darah merah jatuh ke dasar tuba, sel darah putih akan berada di atasnya dan membentuk lapisan buffy coat, plasma darah berada di atas lapisan tersebut dengan kepadatan sekitar 1025 kg/m3, or 1.025 kg/l. Serum darah adalah plasma tanpa fibrinogen, sel dan faktor koagulasi lainnya. Fibrinogen menempati 4% alokasi protein dalam plasma dan merupakan faktor penting dalam proses pembekuan darah.Plasmapheresis adalah jenis terapi medis yang menyuling (en:extraction) plasma darah keluar dari kumpulan partikelnya untuk diolah lebih lanjut dan memasukkan kembali plasma darah tersebut pada akhir terapi.

B. SERUMDi dalam darah, serum (bahasa Inggris: blood serum) adalah komponen yang bukan berupa sel darah, juga bukan faktor koagulasi; serum adalah plasma darah tanpa fibrinogen, (bahasa Latin: serum) berarti bagian tetap cair dari susu yang membeku pada proses pembuatan keju. Serum terdiri dari semua protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairan elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansi exogenous. Rumusan umum yaitu: serum = plasma fibrinogen - protein faktor koagulasi. Studi yang mempelajari serum disebut 1

serologi. Serum digunakan dalam berbagai uji diagnostik termasuk untuk menentukan golongan darah.

C. ERITROSITEritrosit tidak mempunyai nukleus sel ataupun organela, dan tidak dianggap sebagai sel dari segi biologi. Eritrosit mengandung hemoglobin dan mengedarkan oksigen. Sel darah merah juga berperan dalam penentuan golongan darah. Orang yang kekurangan eritrosit menderita penyakit anemia.

D. WHOLE BLOODWhole blood adalah darah tanpa perlakuan. Istilah ini digunakan dalam transfusi obat.. Darah biasanya dikombinasikan dengan antikoagulan selama proses pengumpulan, tetapi pada umumnya dinyatakan belum diolah. Di AS, mengkapitalisasi "Darah Keseluruhan" berarti produk standar tertentu untuk transfusi atau diproses lebih lanjut, dimana "seluruh darah" adalah setiap darah yang dikumpulkan tidak dimodifikasi. Seluruh darah biasanya disimpan di bawah kondisi yang sama Darah Merah Sel dan dapat disimpan sampai 35 hari jika dikumpulkan dengan CPDA-1 solusi penyimpanan atau 21 hari dengan lain solusi penyimpanan umum seperti CPD. Jika darah tersebut akan digunakan untuk membuat trombosit, itu disimpan pada suhu kamar sampai proses selesai. Hal ini harus dilakukan dengan cepat untuk meminimalkan penyimpanan sel darah merah hangat di unit.

E. PENGENDAPAN PROTEIN PLASMAProtein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan

2

muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap. Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifa lain yang berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Percobaan ini dilakukan untuk mengedapkan protein pada sampel. Hal ini dilakukan ketika akan melakukan uji farmakokinetik berikutnya. Perlakuan ini harus dilakukan karena adanya protein dalam sampel akan mengganggu uji farmakokinetik yang dilakukan. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel. Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum digunakan adalah dengan penambahan precipitating agen t. Dalam praktikum ini precipitating agent yang digunakan adalah TCA 10 %, larutan jenuh (NH4)2SO4, ZnSO4 NaOH, Acetonitril, dan Metanol.

F. ORGANOLEPTIS URIN

III.

ALAT dan BAHAN A. ALAT 1. 2. 3. 4. 5. Tabung reaksi Rak tabung Tabung reaksi untuk centrifuge Centrifuge Neraca analitik 3

6. 7. 8. 9. 10. 11. B.

Kertas perkamen Tabung eppendorf Pipet ukur Push ball Spuit Beaker glass

BAHAN

1. Darah segar 2. EDTA 3. Aquades 4. Urine 5. pH indikator IV. PROSEDUR KERJA

A. PREPARASI SAMPEL DARAH1. PLASMA DARAH a. reaksi b. Dicentrifuge dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit hingga terbentuk dua fase yaitu fase cair bagian atas dan fase padatan bagian bawah, fase cairan yang diperoleh disebut plasma c. d. 2. SERUM a. Dimasukkan 5 ml darah ke alam tabung reaksi. b. Dibiarkan 15 menit tanpa antikoagulan c. Lalu diambil fase bening yang disebut serum dan disimpan di tabung reaksi. d. Kemudian, serum disimpan pada suhu 2-80 C. Diambil fase cair dengan pipet ukur dan dipindahkan ke dalam Lalu, plasma disimpan pada suhu 2-80 C. tabung reaksi. Dipipet darah sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung

4

3. SEL DARAH MERAH a. darah). b. c. rata. d. e. Lalu, disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Terbentuk 3 lapisan, yaitu: lapisan atas adalah plasma, lapisan Dimasukkan EDTA ke dalam tabung sentrifuge. Kemudian ditambahkan 5 ml darah, dan dikocok agar tercampur Ditimbang antikoagulan EDTA sebanyak 10 mg (2 mg per ml

tengah adalah platelet, dan lapisan bawah adalah eritrosit. Setelah itu diambil plasmanya dan disimpan pada tabung reaksi yang berisi plasma sebelumnya. f. Lalu, eritosit yang terbentuk disimpan pada suhu 2-8 0 C.

4. WHOLE BLOOD a. darah). b. c. rata. d. Lalu, ditutup dan dimasukkan ke suhu -200C. Dimasukkan EDTA ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 5 ml darah, dan dikocok agar tercampur Ditimbang antikoagulan EDTA sebanyak 10 mg (2 mg per ml

5. PENGENDAPAN PROTEIN PLASMA a. b. c. d. e. f. Dipipet 1 ml plasma darah (hasil dari sentrifugasi eritosit). Ditambahkan 2 ml metanol per volume plasma. Disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan atas adalah fraksi bebas Lalu, fraksi bebas protein di simpan pada tabung yang berbeda. Kemudian, disimpan pada suhu 2-80C.

protein dan lapisan bawah adalah protein.

B. PREPARASI SAMPEL URIN1. ORGANOLEPTIS a. Warna 5

(dilihat warna urin yang diterima) b. pH (diukur dengan mencelupkan pH strip, dibandingkan perubahan warna yang terjadi dengan gambar yang tertera pada box) c. Volume (diukur dengan pipet volume) V. SKEMA KERJA A. PLASMA DARAH DI SENTRIFUGE 1500 rpm/15 menit PLASMA

B.

SERUM DARAHDidiamkan Selama 15 menit

SERUM

C.

SEL DARAH MERAH DARAH + EDTA DI SENTRIFUGE 3000 rpm/10 menit ERITROSIT

D.

WHOLE BLOOD DARAH + EDTA Dimasukkan pada suhu -200C WHOLE BLOOD

E.

PENGENDAPAN PROTEIN PLASMA PLASMA DI SENTRIFUGE 6 1500 rpm/15 menit Fraksi Bebas PROTEIN

VI.

HASIL PENGAMATAN

A. Sample darah1. Plasma Tinggi plasma 2 ml. 2. Eritrosit Tinggi eritrosit 3, 8 ml. 3. Serum Setelah didiamkan selama 15 menit tidak terbentuk serum Ditunggu sampai 1 jam belum juga terbentuk serum.

4. Whole Blood Tidak terjadi perubahan pada sample darah setelah ditambah EDTA sebanyak 0,1 gr. 5. Pengendapan Protein pH = 6 volume = 5ml warna = bening tidak ada endapan protein sehingga tidak dilanjutkan pada centrifuge VII. PEMBAHASAN Terbentuk endapan putih keruh Fraksi bebas protein = 1,3 ml Fase protein = 1,7 ml

B. Sampel urine

A. Sampel darah 1. Plasma Plasma darah didapatkan dengan mencentrifuge darah dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Pada pemeriksaan plasma digunakan sampel darah yang mengandung EDTA untuk menghindari pembekuan. Pemeriksaan yang menggunakan darah EDTA sebaiknya harus dilakukan dengan segera bila ditunda sebaiknya harus diperhatikan batas waktu penyimpanan. Penyimpanan darah EDTA pada suhu kamar 7

yang terlalu lama dapat menyebabkan terjadinya serangkaian perubahan pada eritrosit seperti hemolisis, sehingga hemoglobin bebas ke dalam medium sekelilingnya (plasma). Cara memasukkan sampel ke dalam tabung reaksi harus secara perlahan agar tidak tejadi hemolisis apabila terjadi hemolisis maka tidak akan terjadi pemisahan dua fase yaitu fase padat dan fase cair. Fase cair adalah plasma dan fase padat adalah sel darah. 2. SERUM Serum didapatkan dengan mendiamkan darah tanpa antikoagulan (EDTA) selama 15 menit. Setelah didiamkan akan terbentuk dua fase, yaitu fase cair dan fase padat, fase cair disebut dengan serum dan fase padat disebut dengan sel darah. Untuk mendapatkan serum tidak menggunakan darah yang mengandung anti koagulan karena apabila dalam darah terdapat antikoagulan darah tidak dapat membentuk dua fase dan darah akan selalu encer. Pada praktikum, tidak ditemukan serum setelah didamkan selama 15 menit dan sample darah didiamkan selama satu jam, pada pengamatan setelah satu jam hanya terbentuk sedikit serum. Hal itu disebabkan karena diduga sample darah mengandung natrium sitrat. 3.ERITROSIT Eritrosit didapatkan dengan mensentrifuge darah dengan antikoagulan dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Setelah dilakukan sentrifuge didapatkan 3 lapisan, lapisan paling bawah yaitu eritrosit, lapisan tengah yaitu trombosit, lapisan paling atas adalah plasma. Eritrosit yang diperoleh sebanyak 1,3ml Pada praktikum jika diperlukan ditambahkan buffer saline sebagai isotonik agar plasma tidak bercampur dengan eritrosit dan penyimpanan eritrosit pada suhu 2-8 0 C 4. WHOLE BLOOD Untuk mendapatkan whole blood, darah dengan EDTA dimasukkan ke dalam eppendorf disimpan pada suhu -200 C. Whole blood merupakan darah yang tidak mengalami banyak perlakuan hanya disimpan pada suhu tertentu untuk mempertahankan kualitas darah. 5. PENGENDAPAN PROTEIN 8

Hasil dari pengendapan protein didapat dengan mencampurkan plasma darah dengan metanol sebanyak 2 kali volume plasma yang digunakan setelah itu disentrifuge dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Setelah disentrifuge didapatkan dua lapisan lapisan bawah adalah protein dan lapisan atas dalah fraksi bebas protein setelah itu ditampung dalam tabung reaksi berlainan.

VIII. IX.

KESIMPULAN DAFTAR PUSTAKA

http://id.wikipedia.org/wiki/Serum_darah http://id.wikipedia.org/wiki/Plasma_darah

9