LAPORAN PRAKTIKUM RESMI MIKROTEKNIKMETODE SQUASH

Disusun Oleh :Dian Fajarwati S(K4313027)Kelas AKelompok 3

PENDIDIKAN BIOLOGI FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN UNIVERSITAS SEBELAS MARETSURAKARTA2015

LAPORAN PRAKTIKUM RESMI MIKROTEK

1. JUDUL Metode Squash1. TUJUAN Membuat preparat pembelahan mitosis sel-sel akar bawang merah dengan metode squash1. ALAT & BAHANAlatJumlahBahanJumlah

Botol Flakon2 buah Ujung akar bawang merah (pengambilan jam 08.00- 14.00 wib)5 buah

Silet (berkarat)1 buah Aceto orcein Secukupnya

Gelas bekker4 buah Kristal violet dyes Secukupnya

Kaca arloji 1 buah Fiksatif : Larutan farmer (Asam Asetat) Gliserin jelly Aquades HCl 1N

Secukupnya

Refrigator1 buah

Bunsen + kaki tiga + kasa1 buah

Termometer 1 buah

Objeck glass 4 buah

Cover glass 4 buah

Penghapus karet 1 buah

Pipet tetes 4 buah

Kapas Secukupnya

Nampan 1 buah

Cutter 1 buah

Kaca1 buah

1. PRINSIP KERJA Dalam praktikum metode squash langkah pertama yang harus dilakukan adalah menyiapkan umbi bawang merah. Memilih umbi bawang merah yang masih segar dengan ukuran yang cukup besar. Kemudian membersihkan umbi bawang merah yang akan ditanam, memotong sisa akar kering pada bagian cakram. Selanjutnya, menanam umbi bawang merah dalam nampan menggunakan kapas yang telah dibasahi dengan air dan mendiamkannya tumbuh selama 1 minggu hingga muncul akar baru carannya dengan mengatur posisi pada bagian cakram menyentuh kapas yang telah dibasahi air dengan jarak tertentu. Selanjutnya memberisihkan akar umbi bawang merah dan memilih akar yang keluar dari umbi bawang merah dengan ketentuan akar yang dipilih adalah akar yang paling pendek atau adaerah 1 cm dari ujung akar yang lainnya dengan tujuan supaya lebih mudah dalam pengamatan karena akar yang paling pendek diasumsikan merupakan zona meristematis. Kemudian memotong ujung akar umbi bawang merah menggunakan cutter. Selanjutnya hasil potongan dicuci menggunakan air bersih pada kaca arloji dan memasukannya ke dalam botol flakon yang telah diisi dengan dengan asam asetat 45% dengan volume setengah dari total volume botol flakon, asam asetat 45% berperan dalam proses fiksasi sel-sel akar umbi akar bawang merah selama 2 x 24 jam memasukan botol flakon dalam refrigator dalam suhu dingin 4 C. Setelah itu, kemudian mencuci akar yang telah difiksasi dengan aquades sebanyak 2-3 kali pencucian supaya zat pemfiksasi yaitu asam asetat tidak tertinggal di dalam sel-sel akar dan mengganggu proses pembuatan preparat berikutnya carannya dengan mengambil larutan asam asetat 45% dalam botol flakon sampai habis menggunakan pipet, kemudian melakukan pencucian dengan air sebanyak 3 kali selama 1-3 menit, kemudian membuang airnya sampai habis. Selanjutnya melakukan proses hidrolisa pada akar bawang dengan menggunakan HCl 1 N untuk menghentikan proses reaksi kimia di dalam sel yang terjadi secara cepat selama 5 menit carannya dengan memasukan larutan HCl 1 % ke dalam botol flakon sampai akar bawang merah terendam seluruhnya. Kemudian memanaskan air dalam gelas beker sampai 60C dan meletakan botol flakon yang berisi larutan HCl 1N dan akar bawang merah selama 5 menit. Kemudian mengambil larutan HCl 1N sampai habis dengan menggunakan pipet.setelah itu mencuci dengan air sebanyak 2-3 kali. Lalu, membuang airnya sampai habis dengan menggunakan pipet, sehingga yang tertinggal hanya potongan akar bawang merah. Tahap berikutnya adalah pemberian warna/ Colouring untuh memudahkan pengamatan terhadap proses pembelahan mitosis akar bawang merah, carannya dengan membagi akar bawang merah yang telah di hidrolisa ke dalam dua flakon, flakon satu ditambahkan aceto orcein, dan flakon dua diberi warna Kristal violet. Pewarnaan preparat dilakukan selama 3 menit. Tahap terakhir yairu squashing, carannya denga menutup object glass dengan cover glass dan tekan perlahan dengan karet penghapus penekanan dimaksudkan suapaya isi di dalam sel dapat diamati dan terlihat secara jelas.

PRINSIP KERJA

1. DATA PENGAMATAN Aceto orcein Cacah Akar Bawang Merah 20 XAceto orcein Pencet Akar Bawang Merah 40 X

Kristal Violet Cacah Akar Bawang Merah 20 XKristal Violet Pencet Akar Bawang Merah 40 X

1. PEMBAHASAN Preparat Cacah Dan Pencet Akar Bawang Merah dengan Pewarnaan Kristal VioletGambar Praktikum Akar Bawang Merah 20 X dengan pewarnaan Kistal Violet Cacah Gambar Referensi Akar Bawang Merah dengan pewarnaan Kistal Violet

(Oktaviana, 2014)

Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 40 X dengan pewarnaan Kistal Violet Pencet Gambar Referensi Akar Bawang Merah dengan pewarnaan Kistal Violet

www.biologi-community.blogspot.com

Keterangan:1. Inti sel 2. Sitoplasma 3. Dinding sel4. Kerusakan preparat (noda hitam)

Keterangan:1) Tahap metaphase 2) Tahap awal anaphase 3) Tahap awal telophase4) Dua sel anakan identik

Preparat Cacah Dan Pencet Akar Bawang Merah dengan Pewarnaan Aceto orceinGambar Praktikum Akar Bawang Merah 20 X dengan pewarnaan Aceto orcein Cacah (Praktikan)Gambar Referensi Akar Bawang Merah dengan pewarnaan Aceto orcein (Browsing)

(Rudyatmi, Ely, 2014)

Keterangan : 1. Nukleus 2. Sitoplasma 3. Dinding sel Keterangan : 1. Sitoplasma2. Inti sel(kromosom)3. Dinding sel4. Sel interfase

Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 40 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Praktikan)Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 20 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Asisten)

Keterangan : 1. Telofase 2. Inti sel 3. Dinding sel Keterangan :1. Sitoplasma 2. Nukleus3. Dinding sel

Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 100 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Asisten)Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 40 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Asisten)

Keterangan:1. Anafase 1. Inti sel 1. Tahap akhir anaphase 1. Dinding sel1. Sitoplasma 1. Dinding selKeterangan:1) Metaphase 2) Tahap awal telophase 3) Anaphase 4) Inti sel 5) Sitoplasma

Metode Squash : metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis. Preparat pejetan atau yang disebut dengan squash preparation merupakan preparat yang dibuat dengan cara memejet sebuah objek diatas gelas objek atau kaca preparat dengan menggunakan ibu jari/ alat bantu lain (karet penghapus). Preparat pejetan biasanya digunakan untuk melihat proses mitosis pada akar alium cepa (Puspita, Dewi S, 2015). Mitosis mempertahankan pasangan kromosom yang sama melalui pembelahan inti dari sel somatis secara berturut turut. Peristiwa ini terjadi bersama-sama dengan pembelahan sitoplasmadan bahan-bahan di luar inti sel dan memiliki peran penting dalam pertumbuhan dan perkembangan hampir semua organisme. (Campbell, Reece, dan Mitchell, 2002). Pada percobaan kali ini digunakan metode squash atau preparat pejetan yang terdiri atas beberapa tahapan penting dalam pembuatan preparat ujung akar Allium cepa dengan metode squash ini, yaitu penumbuhan akar Allium cepa, fiksasi akar Allium cepa, pencucian, hidolisa, pewarnaan, dan squashing. Berikut merupakan pembahasan dari masing-masing tahapan: 1. Pertumbuhan akar Allium cepaDalam tahapan pertumbuhan akar bawang merah diperlukan nampan sebagai tempat penanaman, kapas yang dibasahi air sebagai media tumbuh, pisau yang digunakan untuk menghilangkan sisa akar kering pada bagian cakram supaya akar baru dapat muncul dengan mudah. Langkah pertama yaitu dengan cara memilih bawang merah yang akan digunakan dalam pengamatan, yaitu bawang merah yang dalam keadaan dormansi sehingga secara fisiologis akar bawang merah tersebut telah siap untuk mulai bertunas apabila ditumbuhkan pada media tertentu. Penanaman dilakukan di dalam laboratorium selama 1 minggu. Pemilihan media tumbuh berupa kapas yang telah dibasahi dengan air memiliki beberapa pertimbangan tertentu berdasarkan keuntungan akhir yang akan didapatkan. Praktikan menggunakan kapas yang telah dibasahi dengan air sebagai media tumbuh karena akar yang dihasilkan akan tumbuh dengan baik pada medium kapas dengan pertimbangan kondisi keselamatan hasil penanaman pada laboratorium. Penanaman menggunakan kapas yang telah dibasahi dengan air lebih aman ketika diterapkan di dalam laboratorium. Jika, di dalam laboratorium terdapat tikus atau hewan lainnya, akan sangat riskan ketika kita menggunakan metode lainnya seperti menumbuhkan bawang merah pada media air karena hasil akhirnya bisa saja terbalik karena tersenggol oleh tikus. Walaupun bentuk akar yang dihasilkan tidak terlalu panjang, justru dengan akar yang tidak terlalu panjang akan lebih memudahkan pada saat melakukan pemotongan ujung akar bawang merah. Karena dalam pemotongan ujung akar bawang merah akan dipilih akar terpendek dengan asumsi bahwa akar terpendek memiliki zona meristematis yang lebih jelas disebabkan karena akar yang pendek pada daerah ujungnya sedangkan akar yang panjang, akan memudahkan dalam pemotongan dan pengamatan karena biasanya sel-selnya berjajar dengan rapid akan memudahkan praktikandalammengamati sel-sel yang sedang mengalami proses mitosis (Rudyatmi, 2014).2. Fiksasi akar Bawang Merah Langkah pertama untuk fiksasai adalah memilih akar yang terpendek kemudian memomotong ujung akar, jika akar yang dipotong terlalu panjang maka diukur terlebih dahulu dengan penggaris sepanjang kurang lebih 1 cm. ujung akar yang dipilih harus tepat karena daerah tersebut merupakan daerah atau zona meristematis dalam pembelahan sel yang akan memudahkan dalam pengamatan pembelahan mitosis. Kemudian dimasukkan ke dalam botol flakon yang bersi fiksatif Asam asetat 45 % dengan komposisi asam asetat glasial (AAG) 55 ml dan aquades 45 ml. Penggunaan asam asetat glasial dan jugaaquadesmerupakan langkah fiksatif untuk bisa menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah kerusakan jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologis seperti kondisi sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang lembek sehingga akan terjadi koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen di dalam protoplasma, jaringan dapat diwarnai sehingga bagian-bagian dari jaringan mudah dikenali. Dengan demikian proses mitosis yang mungkin terjadi pada waktu pemotongan dapat terperangkap/ terhenti dalam keadaan terfiksatif sehingga nanti pada saat pengamatan preparat squash di bawah mikroskop akan menunjukkan aktivitas sel-selmeristem ujung akar. Rendaman ujung akar Allium cepa dengan larutan fikastif ini kemudian ditempatkan dalam freezer dengan suhu 4oC selama 2 x 24 jam.Penempatan rendaman ujung akar ke dalam refrigerator bertujuan untuk memantapkan proses fiksasi, karena dengan perbandingan 55 : 45 masing-masing untukasam asetat glasialdan aquades belum begitu kuat untuk memfiksasi jaringan yang ada, sehingga dengan menggunakan bantuan temperatur ruang yang rendah,yakni 4oC maka dapat ikut menekan aktivitas seluler yang ada karena suhu yang relatif rendah biasanya mampu menggiring tumbuhan untuk melakukan aktivitas dormansi, dengan kata lain proses metabolisme lambat laun akan terhenti (Rudyatmi, 2014).3. Maserasi/ HidrolisaSetelah melakukan perendaman ujung akar Allium cepa dengan larutan fiksatif dikeluarkan dari dalam freezer, langkah selanjutnya adalahpencucian ujung akar terfiksatif dengan menggunakan air sebanyak 3 kali. Hal ini selain bertujuan untuk membersihkan larutan fiksatif yang ada (karena dikhawatirkan kandungan larutan fiksatif yang terlampau banyak dapat mengganggu proses pewarnaan dengan Crystal violet dan Aceto orcein) yang akan berdampak pada ketidakjelasan pengamatan yang dilakukan oleh praktikan dan juga memberikanperlakuankhusus pada ujung akar tersebut setelah disimpan pada suhu rendah, agar nantinya pada waktu pemanasan tidak terjadi shock-temperature yang terlampau hebat yang dimungkinkan bisa menghancurkan akar secara fisik (Rudyatmi, 2014).Setelah pencucian selesai, tahap berikutnya yitu maserasi/ hidrolisa. Dalam proses maserasi ini ujung akar Allium ceparendam dalam HCl 1 N hingga potongan ujung akar bawang merah yang ada terendam sepenuhnya dalam HCl 1 N. Hidrolisa adalah suatu treatment untuk mempercepat proses reaksi kimia sel, memisahkan sel yang satu dengan sel yang lain dengan cara melarutkanpektin,selulosa, dan kandungan sel lain yang menyebabkan sel tersebut kuat (Jai, 2011). Sehingga pada akhirnyadengan adanya proses hidrolisa,jaringan akan menjadi lunak dan diharapkan akan menjadi selapis saja, karena akan mempermudah proses pengamatan tahapan pembelahan mitosis yang berhasil terfiksasi. HCl adalah asam kuat untuk untuk hidrolisa preparat. Untuk mempercepat terjadinya proses hidrolisa dengan bantuan larutan HCl 1 N maka setelah proses ini dilanjutkan dengan proses pemanasan potongan ujung akar pada penangas air, pada suhu 50-60oC selama kurun waktu5 menit (Rudyatmi, 2014). Suhu harus konstan jangan sampai melebihi 600C karena jaringan yang sudah setengah lunak dengan keberadaan HCl akan mudah hancur pada suhu di atas 60oC.Pemanasan dilakukan untuk membantu mempercepat proses reaksi pelunakan menggunakan HCl 1 N. Hal demikian dikarenakan adanya peningkatan suhu akan berbanding lurus dengan peningkatan kecepatan reaksi.Setelahproses pemanasan di dalam penangas airselesai, potongan ujung akar bawang merah dicuci sebanyak 3 kali untuk menghilangkan sisa-sisa HCl yang ada, karena diketahui bahwa konsentrasi akan struktur serta fungsionalitas dari Crystal violet dan Aceto orcein mudah terganggu dengan adanya zat-zat asam kuat lemah atau pun kuat, sehingga semua sisa HCl dan zat-zat lain harus benar-benar dibuang.4. Colouring / pewarnaan Proses selanjutnya setelah pencucian selesai adalah pewarnaan dengan menggunakan Crystal violet dan aceto orcein.Dalam proses pewarnaan ini, kumpulan potongan ujung akarditempatkan2 flakon. Hal ini untuk melakukan langkah efisiensi penggunaan pewarna, karena Crystal violetdan aceto orcein adalahsenyawa pewarna untuk kromosomyangbukan merupakan barang ekonomis sehingga penggunaannya harus efisien. Proses pewarnaan ini memakan waktu3 menit agar seluruh jaringan terwarnaidengan sempurna. Proses selanjutnya ketika pewarnaan ini selesai adalah pencucian potongan ujung akar. Prosedur pencucianpada tahap ini sama dengan prosedur pencucianpada langkah sebelumnya, yakni dicuci sebanyak 3 kali dan tetap di dalam botol flakon dengan menggunakan pipet tetes.5. Squashing Tahap berikutnya adalah pembuatan preparat ujung akar Allium cepa yang merupakan daerah pembelahan mitosis. Dengan menggunakan kuas yang telah dibasahi terlebih dahulu, sebuah potongan ujung akar dipindahkan ke atas gelas objek dan ditutup dengan gelas penutup yang ditempatkan di atas obyek (potongan ujung akar). Penggunaan kuas dimaksudkan untuk lebih memudahkan dalam proses pemindahan potongan ujung akar dan meminimalkan hilangnya potongan ujung akar yang terlalu kecil, megurangi resiko kerusakan organ akar yang telah dipotong. Kemudian secara hati-hati dengan menggunakan ujung karet penghapus untuk menekan potongan ujung akar tersebut sehingga pada nantinya akan meratakan sel-sel meristem ujung akar tersebut hingga terpisah satu dengan yang lainnya sehingga akan mempermudah proses pengamatan. Menetesi kaca benda dengan gliserin kemudian menutupnya dengan deg glass. Tujuan pemberian gliserin adalah sebagai media perekat dalam pembuatan preparat squash supaya lebih mudah teramati. Setelah melalui beberapa tahapan metode squash tersebut, maka preparat sudah siap untuk diamati di bawah mikroskop. Preparat yang sudah selesai dibuat inisecepatnyaharus diamati,karena sel ataupun jaringan yang sudah mengalami berbagai perlakuan seperti yang telah dilakukan tersebut, akan cepat sekali mengalami kerusakan, sehingga harus segera diamati adakah proses mitosis pada preparat ujung akar tersebut.Pengamatan yang dilakukan adalah melihat tahapan-tahapan yang terjadi selama pembelahan mitosis di bawah mikroskop dan selanjutnya melakukandokumentasi dengan pemotretansetelahdiperoleh tahapan pembelahan mitosis pada preparat akar bawang merah.Mitosis merupakan proses pembelahan aseksual sel, pembelahan ini dilakukan dengan satu sel menghasilkan dua sel anakan yang dihasilkan dari pembagian nukleus sel yang melakukan mitosis (Kimball, 1998). Organisme multiseluler terbentuk dari fertilisasi telur yakni gamet betina dibuahi oleh gamet jantan akan menghasilkan zygot diploid (2n) (Setjo, Susetyoadi, 2004). Interval waktu fase mitosis (Fase M) yang terjadi pada sel terjadi kurang lebih selama 1 jam. Tahap mitosis ini merupakan tahap di mana terjadi pembelahan sel (baik pembelahan biner atau pembentukan tunas). Pada mitosis, sel membelah dirinya membentuk dua sel anak yang terpisah. Mitosis atau pembelahan inti merupakan stadium akhir dari siklus sel dan merupakan stadium yang paling pendek, yaitu kurang lebih 10% dari keseluruhan waktu yang dibutuhkan untuk satu kali siklus (Mulyani, Sri, 2010)Sebelum Pembelahan mitosis, DNA sel akan terduplikasi sehingga masing-masing sel anakan mengandung informasi gen yang sama dengan sel induk. Mekanisme mitosis dapat dilihat dari beberapa tahapan pembelahan informasi gen yang diturunkan berupa kromosom yang akan bertransfomasi menjadi nukleus dari masing-masing sel anakan.Menurut Suryo (1996), proses pembelahan mitosis dibagi menjadi 5 fase. Pada setiap fasenya menunjukkan pertumbuhan morfologi kromosom dan pergerakkan kromosom.Berikut adalah 5 fase dari pembelahan mitosis:1. InterphaseSel siap untuk membelah tetapi belum memperlihatkan kegiatan membelah. Nukleus terlihat keruh kemudian lambat laun nampak benang-benang kromatin yang halus.2. ProphasePada tahap ini, benang-benang kromatin di dalam nukleus makin pendek dan menebal. Kemudian terbentuklah kromosom yang akan membelah memanjang. Sel anakan kromosom dinamakan kromatid. Dinding inti mulai menghilang dan sentriol mulai membelah.Pada proses awal, kromosom mulai tampak lebih pendek serta menebal. 3. MetaphaseMetaphase merupakan tahap yang singkat dalam mitosis. Kromosom bergerak ke bidang ekuator benang spindel (bidang pembelahan). Kromosom terikat pada benang spindel melalui sentromer. Kromosom terletak di bidang ekuator agar pembagian jumlah informasi DNA yang akan diberikan kepada sel anakan yang baru benar-benar rata dan sama jumlahnya.4. AnaphaseSentromer membelah dan benangspindel memendek. Kedua buah kromatid memisahkan diri kemudian bergerak menuju ke kutub sel yang berlawanan. Tiap kromatid hasil pembelahan itu memilki sifat dan keturunan yang sama. Mulai saat ini kromatid-kromatid ini berlaku sebagai kromosom baru.Tahap anaphase menghasilkan salinan kromosom berpasangan.5. TelophaseTahap terakhir dari mitosis. Pada fase ini tiap kutub sel telah terbentuk stel kromosom yang identik. Serabut gelendong inti lenyap dan dinding inti sel mulai terbentuk lagi. Plasma sel terbagi menjadi dua bagian (sitokinesis). Pada sel hewan sitokinesis ditandai dengan melengkungnya sel ke dalam, sedang pada sel tumbuhan karena selnya berdinding, maka sitokinesis ditandai dengan terbentuknya dinding sel di tengah-tengah sel.Mitosis pada tumbuhan terjadi selama mulai dari 30 menit sampai beberapa jam dan merupakan bagian dari suatu proses yang berputar dan terus-menerus. Mitosis terjadi di dalam sel somatik yang bersifat meristematik. Mitosis biasanya diikuti dengan pembelahan sel yang disebut dengan sitokenesis yang mana sel akan terpisah menjadi dua. Berdasarkan latar belakang di atas, maka dilakukan praktikum preparat segar mitosis (Crowder, L. V, 2006). Mitosis merupakan pembelahan sel yang umumnya terjadi pada sel-sel yang hidup terutama sel-sel yang sedang tumbuh, dan dan sel-sel ini umumnya terdapat pada ujung akar dan ujung batang tumbuhan (Welsh, 1991). Penggunaan akar pada praktikum kali ini karena akar merupakan salah satu organ vegetatif, yang sel-sel penyusunnya berupa sel-sel somatik, dan khusus pada ujung akar bersifat meristematik. Hal inilah yang melatarbelakangi digunakannya akar dalam praktikum mitosis ini. Selanjutnya alasan pemotongan akar bawang merah yang dilakukan pada pukul 08.00 pagi adalah karena mitosis pada akar bawang merah terjadi pada jam-jam tersebut. Proses mitosis pada tanaman umumnya terjadi selama antara 30 menit sampai beberapa jam dan merupakan bagian dari suatau proses yang berputar dan terus-menerus (siklus) dan pada akar bawang merah (Allium cepa). Pembelahan mitosis terjadi pada pagi hari. Akar bawang merah digunakan untuk mempelajari mitosis dengan alasan karena akar bawang memiliki kromosom yang besar, jumlah kromosomnya tidak terlalu banyak, sehingga lebih memungkinkan untuk mendapatkan hasil percobaan yang lebih baik akan lebih mudah didapatkan (Puspita, 2015). Akar bawang merah yang mana selnya memilki kromosom 2n=16.Berdasarkan hasil pengamatan, preparat dengan pewarnaan Aceto orcein dan kristal violet memperlihatkan bagian-bagian sel yang sama, hanya saja preparat yang diwarnai dengan menggunakan aceto orcein menunjukan hasil yang lebih bagus dari segi kejelassan, warna dan kekontrasan kenampakan preparat. Pewarnaan dengan aceto orcein lebih jelas daripada menggunakan Kristal violet. Pengamatan preparat squash dengan pewarnaan kristal violet menggunakan perbesaran 20X dan 40X memberikan hasil warna ungu dengan bagian yang teramati tidak begitu jelas. Preparat Kristal violet hanya memperlihatkan bagian-bagian seperti inti sel, sitoplasma dan dinding sel. Preparat yang teramati menunjukan kerusakan pada sel-selnya karena terdapat bagian yang berwarna lebih hitam daripada bagian lain. Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna suatu target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan bagian dari sel yang bersifat asam, dengan begitu bagian dari sel yang transparan akan terlihat berwarna ungu. Kristal violet atau gentian violet juga dikenal sebagai metil 10B, violet atau hexamethyl pararosaniline chloride adalah triarylmethane pewarna. Pewarna ini juga digunakan sebagai histologis noda dan di metode Gram klasifikasi bakteri. Krystal violet memiliki efek antibakteri, antijamur, dan obat cacing properti dan sebelumnya penting sebagai topikal antiseptik (Welsh, J.R, 1991). Preparat yang diamati tidak menunjukan kromosom di dalam tahap-tahap mitosis secara jelas. Dalam pembuatan preparat dengan metode squash dengan pewarnaan Kristal violet, kami menggunakan dua metode yaitu metode pencet yang lazim digunakan dan metode cacah menggunaakan permukaan silet yang berkarat. Penggunaan permukaan silet yang berkarat bertujuan untuk memaksimalkan penyerapan warna ke dalam kromosom dengan tujuan meningkatkan reaksi oksidasi pewarna dengan kromosom sehingga preparat dengan pewarnaan kristal violet menggunakan metode cacah menunjukan hasil pengamatan yang lebih jelas daripada Kristal violet dengan metode pencet. Hal ini terlihat dari hasil pengamatan, preparat yang dibuat dengan metode cacah lebih menunjukan garis-garis dinding sel yang telah pecah sehingga terlihat sitoplasma dengan banyak inti selnya. Sementara preparat yang dibuat dengan metode pencet dengan perbesaran 40X menunjukan dinding selnya masih relatif utuh sehingga nukelus bahkan kromosomnya kurang dapat teramati secara jelas. Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 20 X dengan pewarnaan Kistal Violet CacahGambar Praktikum Akar Bawang Merah 40 X dengan pewarnaan Kistal Violet Pencet

Keterangan : 1. Inti sel2. Sitoplasma3. Dinding sel4. Kerusakan preparat (noda hitam)

Noda-noda hitam yang terlihat pada saat pengamatan merupakan suatu pertanda bahwa preparat yang kami buat mengalami kerusakan. Hal ini disebabkan karena jarak antara waktu pembuatan dengan waktu pengamatan yang terlalu lama, sehingga preparat yang seharusnya segera diamati, kemudian tertunda waktu pengamatannya karena kondisi tidak memungkinkan sehingga terjadilah reaksi pada preparat yang tidak sesuai dengan yang diinginkan. Menurut teori Kimball (1989), preparat yang sudah selesai dibuat inisecepatnyaharus diamati,karena sel ataupun jaringan yang sudah mengalami berbagai perlakuan seperti yang telah dilakukan tersebut, akan cepat sekali mengalami kerusakan, sehingga harus segera diamati adakah proses mitosis pada preparat ujung akar tersebut. Jika dibandingkan dengan preparat hasil referensi, hasil pengamatan tidak menunjukan gambar yang jelas untuk setiap tahap pembelahan mitosis. Referensi yang diperoleh menunjukan adanya tahapan mitosis yang jelas mulai dari tahap meafase, tahap awal anaphase, dan tahap awal telofase hingga ditemukan adanya dua sel anakan yang identik. Sementara praktikan dalam kegiatan praktikum tidak dapat menemukan adanya tahap-tahap dalam pembelajan mitosis pada sel akar bawang merah. Hal ini disebabkan karena kurang trampilnya praktikan dalam membuat preparat dengan metode squash. Sumber :www.biologi-community.blogspot.comKeterangan:1) Tahap metaphase 2) Tahap awal anaphase 3) Tahap awal telophase4) Dua sel anakan identik

Pengamatan preparat squash dengan pewarnaan aceto orcein menggunakan perbesaran 20X dan 40X menunjukan hasil yang lebih jelas ketika dibandingkan dengan pewarnaan Kristal violet. Aceto orsein memberikan warna cenderung kemerah-merahan pada sel. Proses pewarnaan akar bawang merah diberi pewarna aceto orcein bertujuan untuk mewarnai kromosom agar nampak jelas ketika dilakukan pengamatan terhadap fase-fase mitosisnya. Beberapa jenis tanaman menghasilkan pewarnaan yang lebih bagus dengan menggunakan aceto orcein bila dibandingkan dengan pewarna Kristal violet. Pewarna tersebut sangat baik digunakan pada tanaman dengan jumlah kromosom yang sedikit. Menurut teori Puspita (2015), akar bawang merah digunakan untuk mempelajari mitosis dengan alasan karena akar bawang memiliki kromosom yang besar, jumlah kromosomnya tidak terlalu banyak, sehingga lebih memungkinkan untuk mendapatkan hasil percobaan yang lebih baik akan lebih mudah didapatkan. Akar bawang merah yang mana selnya memilki kromosom 2n=16. Kromosom akan terwarnai dengan jelas dan sitoplasma nampak jelas. Proses pewarnaan berlangsung sekitar 5 menit dan setelah itu dilakukan proses pejetan dan cacahan untuk proses pengamatan sel-sel akar bawang merah. Hasil pejetan yang kelompok kami peroleh dalam pengamatan sel akar bawang merah, kami menemukan 1 tahap pembelahan mitosis yaitu tahap telofase dimana ditunjukan dengan terbentuknya dia sel anakan yang identik dalam suatu sitoplasma yang sedang mengalami sitokinesis hal ini dapat diamati pada preparat dengan metode pencet pada perbesaran 40X. Hal ini menunjukan bahwa pewarna aceto orcein memiliki kemampuan dalam mewarnai sel lebih baik daripada aceto orcein. Dalam pembuatan preparat dengan metode squash, kami menggunakan dua metode yaitu metode pencet yang lazim digunakan dan metode cacah menggunaakan permukaan silet yang berkarat. Penggunaan permukaan silet yang berkarat bertujuan untuk memaksimalkan penyerapan warna ke dalam kromosom dengan tujuan meningkatkan reaksi oksidasi pewarna dengan kromosom sehingga preparat dengan pewarnaan aceto orcein menggunakan metode cacah menunjukan hasil pengamatan yang lebih jelas daripada aceto orcerin dengan metode pencet. Hal ini terlihat dari hasil pengamatan, preparat yang dibuat dengan metode pencet lebih menunjukan tahapan pembelahan mitosis yaitu dnegan ditemukannya tahapan telofase pada saat pembelajan sitoplasma dan telah terbentuknya dua anak inti. Sementara preparat yang dibuat dengan metode cacah dengan perbesaran 20X menunjukan nukelus dan sitoplasma tanpa ditemukannya tahapan pembelahan sel. Metode pencet dan metode cacah yang digunakan dalam preparat untuk pewarnaan acetoorcein memberikan hasil yang berbeda dengan pewarnaan menggunakan Kristal violet. Hal ini karena metode cacah dan pencet untuk setiap sampel dilakukan oleh orang yang berbeda sehingga teknik yang digunakan untuk mencacah dan mmencetpun menghasilkan hasil pengamatan yang berbeda. Perbandingan antara hasil pengamatan yang diperoleh asisten dengan yang diperoleh kelompok 6 (praktikan) menunjukan bahwa praktikan kurang terampil dalam membuat preparat dengan metode squash. Preparat hasil pengamatan asisten menunjukan lebih banyak tahap pembelahan mitosis yaitu ditemukan tahap metaphase, tahap awal telophase, dan tahap anaphase. Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 20 X dengan pewarnaan Aceto orcein Cacah (Praktikan)Gambar Referensi Akar Bawang Merah dengan pewarnaan Aceto orcein (Browsing)

(Rudyatmi, Ely, 2014)

Keterangan : 0. Nukleus 0. Sitoplasma 0. Dinding sel Keterangan : 1. Sitoplasma2. Inti sel(kromosom)3. Dinding sel4. Sel interfase

Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 40 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Praktikan)Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 20 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Asisten)

Keterangan : 1. Telofase 2. Inti sel 3. Dinding sel Keterangan :1. Sitoplasma 2. Nukleus3. Dinding sel

Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 100 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Asisten)Gambar Praktikum Akar Bawang Merah 40 X dengan pewarnaan Aceto orcein Pencet (Asisten)

Keterangan:1) Anafase 2) Inti sel 3) Tahap akhir anaphase 4) Dinding sel5) Sitoplasma 6) Dinding selKeterangan:1) Metaphase 2) Tahap awal telophase 3) Anaphase 4) Inti sel 5) Sitoplasma

Kegagalan atau ketidaksesuaian praktikan dalam praktikum dengan metode squash menggunakan pewarnaan Kristal violet dikarenakan oleh beberapa hal: 1) Kesalahan dalam memilih bawang. Bawang merah yang dipilih seharusnya bawang dengan ukuran yang cukup besar dan cukup segar. Tetapi praktikan kurang memperhatikan hal tersebut. 2) Metode yang digunakan untuk menumbuhkan akar bawang merah yaitu dengan mengguankan nampan dan kapas yang telah dibasahi air mungkin kurang sesuai karena akar yang muncul tidak maksimal. 3) Kesalahan dalam memotong dan menentukan ujung akar dengan zona meristematis. Seharusnya pemotongan ujung akar bawang merah diukur pada daerah 1 cm dari ujung akar dengan asumsi bahwa ujung akar dengan jarak 1 cm dari ujung akar merupakan zona meristematis yang akan memudahkan dalam pemotongan dan pengamatan karena biasanya sel-selnya berjajar dengan rapid akan memudahkan praktikan dalam mengamati sel-sel yang sedang mengalami proses mitosis (Rudyatmi, 2014).4) Kurang bersihnya pencucian ujung akar terfiksatif dengan menggunakan air. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali pada saat praktikum. Pencucian bertujuan untuk membersihkan larutan fiksatif yang ada (karena dikhawatirkan kandungan larutan fiksatif yang terlampau banyak dapat mengganggu proses pewarnaan dengan kristal violet dan aceto orcein) yang akan berdampak pada ketidakjelasan pengamatan yang dilakukan oleh praktikan dan juga memberikan perlakuan khusus pada ujung akar tersebut setelah disimpan pada suhu rendah, agar nantinya pada waktu pemanasan tidak terjadi shock-temperature yang terlampau hebat yang dimungkinkan bisa menghancurkan akar secara fisik (Rudyatmi, 2014).5) Kesalahan saat fiksasi. Dalam hal waktu yang berkaitan dengan lamanya fiksasi yang justru malah membuat sel akar bawang merah menjadi rusak, atau kemungkinan karena kurang lamanya proses fiksasi maka penyerapan zat warna dan kealahan teknis berupa ketidakstabilan suhu di dalam kulkas yang membuat proses fiksasi menjadi tidak stabil sehingga proses metabolisme yang seharusnya terhenti pada suhu yang rendah ketika kulkas mati makan naik kembali aktivitas metabolismenya. 6) Kesalahan saat proses hidrolisa. Hidrolisa adalah suatu treatment untuk mempercepat proses reaksi kimia sel, memisahkan sel yang satu dengan sel yang lain dengan cara melarutkanpektin,selulosa, dan kandungan sel lain yang menyebabkan sel tersebut kuat (Jai, 2011). Sehingga pada akhirnyadengan adanya proses hidrolisa,jaringan akan menjadi lunak dan diharapkan akan menjadi selapis saja, karena akan mempermudah proses pengamatan tahapan pembelahan mitosis yang berhasil terfiksasi. HCl adalah asam kuat untuk untuk hidrolisa preparat. Untuk mempercepat terjadinya proses hidrolisa dengan bantuan larutan HCl 1 N maka setelah proses ini dilanjutkan dengan proses pemanasan potongan ujung akar pada penangas air, pada suhu 50-60oC selama kurun waktu5 menit (Rudyatmi, 2014). Suhu harus konstan jangan sampai melebihi 600C karena jaringan yang sudah setengah lunak dengan keberadaan HCl akan mudah hancur pada suhu di atas 60oC.Kesalahan praktikan dalam pemanasan menggunakan pengangas yaitu suhu yang seharusnya stabil pada 50-60oC tetapi praktikan tidak dapat mengkondisikan suhunya supaya tetap stabil. Pemanasan dilakukan untuk membantu mempercepat proses reaksi pelunakan menggunakan HCl 1 N. Hal demikian dikarenakan adanya peningkatan suhu akan berbanding lurus dengan peningkatan kecepatan reaksi. Setelahproses pemanasan di dalam penangas airselesai, potongan ujung akar bawang merah dicuci sebanyak 3 kali untuk menghilangkan sisa-sisa HCl yang ada, karena diketahui bahwa konsentrasi akan struktur serta fungsionalitas dari Crystal violet dan Aceto orcein mudah terganggu dengan adanya zat-zat asam kuat lemah atau pun kuat, sehingga semua sisa HCl dan zat-zat lain harus benar-benar dibuang.7) Kesalahan saat proses colouring terkait dengan lamanya waktu perendaman pada zat warna dan kesalahan dalam meneteskan pewarna dalam jumlah yang terlalu banyak sehingga pewarna cenderung menggumpal dan menutup karena terlalu tebalnya pewarna yang terbentuk. 8) Kesalahan dalam proses squashing. Squashing menggunakan dua metode yaitu pemencetan atau pencahcahan. Pemencetan menggunakan karet penghapus harus dilakukan dengan perlahan. Kesalahan praktikan terletak pada cara pemencetan yang seharusnya dilakukan dengan perlahan-lahan tetapi praktikan memencet berulang kali dan tidak dengan hati-hati. Sedangkan metode pencacahan dengan menggunakan silet yang berkarat dengan tujuan supaya warna yang terserap lebih maksimal ke dalam kromosom dengan tujuan meningkatkan reaksi oksidasi pewarna dengan dengan kromosom. 9) Kesalahan dalam menggunakan gliserin. Gliserin yang digunakan sebaiknya dalam taraf yang tepat, karena jika terlalu berlebihan dalam menggunakan gliserin akan membuat preparat menjadi sulit teramati. 10) Kesalahan dalam pengamatan. Praktikan kurang ahli dalam menggunaan mikroskop sehingga gambar yang dihasilkan tidak fokus dan kurang tepat. 1. KESIMPULAN Metode Squash : metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis. Preparat pejetan atau yang disebut dengan squash preparation merupakan preparat yang dibuat dengan cara memejet sebuah objek diatas gelas objek atau kaca preparat dengan menggunakan ibu jari/ alat bantu lain (karet penghapus). Preparat pejetan yang digunakan untuk melihat proses mitosis pada akar alium cepa. Pembelahan mitosis terjadi pada pagi hari. Akar bawang merah digunakan untuk mempelajari mitosis dengan alasan karena akar bawang memiliki kromosom yang besar, jumlah kromosomnya tidak terlalu banyak, sehingga lebih memungkinkan untuk mendapatkan hasil percobaan yang lebih baik akan lebih mudah didapatkan (Puspita, 2015). Akar bawang merah yang mana selnya memilki kromosom 2n=16. Tahapan pembuatan preparat dengan metode squash :6. Penanaman bawang merah pada media perkecambahan 6. Persiapan fiksasi Menggunakan asam asetat 45%, fiksasi tujuan untuk menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah kerusakan jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologis seperti kondisi sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang lembek sehingga akan terjadi koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen di dalam protoplasma, jaringan dapat diwarnai sehingga bagian-bagian dari jaringan mudah dikenali.6. Hidrolisa Hidrolisa adalah suatu treatment untuk mempercepat proses reaksi kimia sel, memisahkan sel yang satu dengan sel yang lain dengan cara melarutkanpektin,selulosa, dan kandungan sel lain yang menyebabkan sel tersebut kuat (Jai, 2011). Sehingga pada akhirnyadengan adanya proses hidrolisa,jaringan akan menjadi lunak dan diharapkan akan menjadi selapis saja, karena akan mempermudah proses pengamatan tahapan pembelahan mitosis yang berhasil terfiksasi. HCl adalah asam kuat untuk untuk hidrolisa preparat. Untuk mempercepat terjadinya proses hidrolisa dengan bantuan larutan HCl 1 N maka setelah proses ini dilanjutkan dengan proses pemanasan potongan ujung akar pada penangas air, pada suhu 50-60oC selama kurun waktu5 menit. 6. ColouringProses pewarnaan ini memakan waktu3 menit agar seluruh jaringan terwarnaidengan sempurna. Pewarnaan menggunakan aceto orcein dan Kristal violet. 6. SquashingDengan metode pencet dan metode cacah. Gliserin fungsinya sebagai perekat untuk merekatkan sampel dengan kaca benda dan deg glass. Tahap pembelahan mitosis meliputi : profase, metaphase, anaphase dan telofase. Berdasarkan hasil pengamatan, preparat dengan pewarnaan Aceto orcein dan kristal violet memperlihatkan bagian-bagian sel yang sama, hanya saja preparat yang diwarnai dengan menggunakan aceto orcein menunjukan hasil yang lebih bagus dari segi kejelassan, warna dan kekontrasan kenampakan preparat. Pewarnaan dengan aceto orcein lebih jelas daripada menggunakan Kristal violet. Table perbandingan antara preparat dengan pewarnaan krital violet dengan Aceto orcein. Kristal VioletAceto orcein

Preparat yang dibuat dengan metode cacah lebih menunjukan garis-garis dinding sel yang telah pecah sehingga terlihat sitoplasma dengan banyak inti selnya. Sementara preparat yang dibuat dengan metode pencet dengan perbesaran 40X menunjukan dinding selnya masih relatif utuh sehingga nukelus bahkan kromosomnya kurang dapat teramati secara jelasMetode pencet dan metode cacah yang digunakan dalam preparat untuk pewarnaan acetoorcein memberikan hasil yang berbeda dengan pewarnaan menggunakan Kristal violet. Hal ini karena metode cacah dan pencet untuk setiap sampel dilakukan oleh orang yang berbeda sehingga teknik yang digunakan untuk mencacah dan mmencetpun menghasilkan hasil pengamatan yang berbeda.

Preparat yang dibuat dengan metode cacah lebih menunjukan garis-garis dinding sel yang telah pecah sehingga terlihat sitoplasma dengan banyak inti selnya. Sementara preparat yang dibuat dengan metode pencet dengan perbesaran 40X menunjukan dinding selnya masih relatif utuh sehingga nukelus bahkan kromosomnya kurang dapat teramati secara jelas.Preparat yang dibuat dengan metode pencet lebih menunjukan tahapan pembelahan mitosis yaitu dnegan ditemukannya tahapan telofase pada saat pembelajan sitoplasma dan telah terbentuknya dua anak inti. Sementara preparat yang dibuat dengan metode cacah dengan perbesaran 20X menunjukan nukelus dan sitoplasma tanpa ditemukannya tahapan pembelahan sel.

Hasil pengamatan tidak menunjukan gambar yang jelas untuk setiap tahap pembelahan mitosis. Pada gambar referensi terdapat tahapan mitosis yang jelas mulai dari tahap meafase, tahap awal anaphase, dan tahap awal telofase hingga ditemukan adanya dua sel anakan yang identik. Sementara praktikan dalam kegiatan praktikum tidak dapat menemukan adanya tahap-ahap dalam pembelajan mitosis pada sel akar bawang merah.Perbandingan antara hasil pengamatan yang diperoleh asisten dengan yang diperoleh kelompok 6 (praktikan) menunjukan bahwa praktikan kurang terampil dalam membuat preparat dengan metode squash. Preparat hasil pengamatan asisten menunjukan lebih banyak tahap pembelahan mitosis yaitu ditemukan tahap metaphase, tahap awal telophase, dan tahap anaphase.

Kesalahan praktikan 1) Kesalahan dalam memilih bawang.2) Metode yang digunakan untuk menumbuhkan akar bawang merah yaitu dengan mengguankan nampan dan kapas yang telah dibasahi air mungkin kurang sesuai karena akar yang muncul tidak maksimal. 3) Kesalahan dalam memotong dan menentukan ujung akar dengan zona meristematis. 4) Kurang bersihnya pencucian ujung akar terfiksatif dengan menggunakan air. 5) Kesalahan saat fiksasi. Lama waktu fiksasi yang tidak tepat. 6) Kesalahan saat proses hidrolisa. Kesalahan praktikan dalam pemanasan menggunakan pengangas yaitu suhu yang seharusnya stabil pada 50-60oC tetapi praktikan tidak dapat mengkondisikan suhunya supaya tetap stabil. 7) Kesalahan saat proses colouring terkait dengan lamanya waktu perendaman pada zat warna dan kesalahan dalam meneteskan pewarna dalam jumlah yang terlalu banyak.8) Kesalahan dalam proses squashing. Kesalahan praktikan terletak pada cara pemencetan yang seharusnya dilakukan dengan perlahan-lahan tetapi praktikan memencet berulang kali dan tidak dengan hati-hati. 9) Terlalu banyak menggunakan gliserin. 10) Kesalahan dalam pengamatan. Praktikan kurang ahli dalam menggunaan mikroskop sehingga gambar yang dihasilkan tidak fokus dan kurang tepat.

1. DAFTAR PUSTAKACampbell,Reece, dan Mitchell. 2002. Biologi Edisi Ke-5 jilid 3. Jakarta: ErlanggaCrowder, L. V. 2006. Genetika Tumbuhan. Yoyakarta: Gajah Mada University PressJai. 2011. Analisis Mitosis Pada ujung Akar Bawang Bombay dan Aglaonema. http://jai.staff.ipb.ac.id/2011/02/04/analisis-mitosis-pada-ujung-akar-bawang-merah-bawang-bombay-dan-aglaonema/. Diakses pada tanggal 4 November 2014Kimball. 1998. Biologi. Jakarta: ErlanggaMulyani, Sri. 2010.Anatomi Tumbuhan.Yogyakarta: KanisiusPuspita, Dewi Sari. 2015. Buku Panduan Praktikum Mikroteknik. Surakarta : UNS PressRudyatmi, Ely. 2012.Bahan Ajar Mikroteknik. Semarang: Jurusan Biologi FMIPA UNNESSetjo, Susetyoadi. 2004. Anatomi Tumbuhan. Malang: JICASuryo. 1996.Genetika. Yogyakarta: Gajah Mada University PressWelsh, J.R 1991. Dasar-Dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Jakarta: Erlangga

1. LAMPIRAN1 lembar dokumentasi

Surakarta, 22 Oktober 2015Asisten, Praktikan

Dian Fajarwati SK4313027

FOTO LAMPIRAN DOKUMENTASI MIKROTEKNIK METODE SQUASH

DOKUMENTASI DATA PENGAMATAN

Aceto orcein Cacah Akar Bawang Merah 20 XAceto orcein Pencet Akar Bawang Merah 40 X

Kristal Violet Cacah Akar Bawang Merah 20 XKristal Violet Pencet Akar Bawang Merah 40 X