LAPORAN PRAKTIKUM

Hari/tgl : jum’at/14 November 2014

Judul : Analisa kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan(metode hitung

Cawan dan metode MPN)

Prinsip :

Metode hitung cawan

Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunkan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan metode yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba.

Metode hitung cawan dibedakan dalam 2 cara:

1. Metode tuang

Contoh yang suah diencerkan dimasukan kedalam cawan petri, kemudian ditambahkan agar cair steril yan telah didinginkan (47-500c) sebanyak 15-20 ml dan goyangkan supayamenyebar dan merata.

2. Metode permukaan

Cara yang dilakukan pada metode ini adalah terlebih dahulu dibuat medium padat pada cawan petri. Kemudian 0,1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar terseburt dan diratakan pada batang gelas yang melengkung yang steril.

Metode MPN:

Media yang digunakan adalah metode yang cair, media ini ditaruh dalam tabung pengencer. Pertumbuhan mikroba ditandai dengan terjadiya kekeruhan pada tabung atau berbentuk gas.

Tinjauan pustaka :

Hitungan CawanPrinsip dari metode hitungan cawan (TPC) adalah jika sel jasad renik masih

hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel jasad renik akan berkembang biak

dan membentuk koloni yang dapat lihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa

menggunakan mikroskop.

Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk

menentukan jumlah jasad renik, ada keuntungan yang perlu diperhatikan yaitu :

a. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

b. Beberapa jensi dapat dihitung sekaligus

c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik koloni yang terbentuk

mungkin berasal dari suatu jasad renik.

Kelemahan-kelemahan metode hitungan cawan (TPC) :

a. Hasil hitungan tidak menunjukan jumlah sel yang sebenarnya, karena berbeda sel

yang berdekatan membentuk satu koloni

b. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda ax menghasilkan nilai yangh berbeda

c. Jasad reniki yang ditumbuihkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan

membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.

d. Memerluka persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan

Koloni dapat dihitung

Dalam metode hitungan cawan, bahan pangan diperkirakan mengandung lebih

dari 300 jasad renik per ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh

dilakukan pada permukaan), memerlukan perlakuan pengenceran sebelum

ditumbuhkan pada medium agar didalam cawan petri.

Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan dalam jumlah yang dapat

dihtung antara 30 – 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu

1 : 10, 1: 100, 1 : 1000 dengan menggunakan larutan pengenceran yaitu buffer fosfat,

NaCl 0.85 %, Larutan Ringer.

Cara pengumpulan dalam metode hitung cawan dapat dibedakan atau dua cara

yaitu cara tuang (Pour Plate) dan metode permukaan (Surface / Spread Plate).      

1). Metode tuang (pour plate),.

Sejumlah contoh (1 ml atau 0,1 ml) dari pengenceran yang dikehendaki

dimasukan ke dalam cawan petri, kemudian ditambahkan agar cair steril yang telah

didinginkan (47-500C)Sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya contoh menyebar

rata.

2). Metode permukaan (spread plate)

Agar cair dimasukkan dalam cawan terlebih dahulu kemudian sebanyak 0.1 ml

contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar, diratakan dengan batang

gelas melengkung yang steril. Jumlah koloni dapat hitung sebagai berikut :

Koloni/ml/g = Jumlah Koloni per cawan X

Untuk melaporkan hasil analisis mikrobiologi dengan cara hitungan cawan

digunakan standar yaitu Standar Plate Counts (SPC) sebagai berikut :

a. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah 25 – 250 koloni

b. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan kumpulan koloni yang

besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni.

c. Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai

satu koloni.

Dalam Standar Plate Counts (SPC) ditentukan cara pelaporan dan perhitungan

koloni sebagai berikut :

a. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka. Angka yang pertama (satuan),

angkan kedua (desimal). Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari

5, harus dibulatkan satu (1) angka lebih tinggi pada angka kedua. Cth :      1.7 x

103 unti koloni/ml atau 2.0 x 106 unit koloni/g

b. Jika pada semua pengenceran dihasilkan kurang dari 30 pada cawan petri, berarti

pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Oleh karena itu, jumlah koloni pada

pengenceran yang terendah dihitung. Hasil laporan sebagai kurang dari 30

dikalikan dengan besar pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus

dicantumkan di dalam tanda kurung.

c. Jika semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti

pengenceran yang dilakukan terlalu rendah, oleh karena itu jumlah koloni pada

pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari

300 dikalikan dengan faktor pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya hurus

dicantumkan di dalam tanda kurung

d. Jika pada cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah

Antara 30-300, dan perbandingan Antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua

pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengn dua, dilaporkan rata- rata dari

kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan faktor pengencerannya. Jika

perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang

dilaporkan hanya yasil yang terkecil.

Jika menggunakan dua cawan petri (DUPLO) per pengenceran, data yang diambil

harus dari kedua cawan, tidak boleh diambil salah satu. Oleh karena itu, harus

dipilih tingkat pengenceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni

di antara 30  dan 300.

Metode MPN (Most Probable Number)Pada metode MPN berbeda dengan metode hitung cawan dimana digunakan

medium padat, dalam metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi,

dimana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang

ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.

Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya

kekeruhan atau terbentuknya gas didalam tabung kecil (tabung durham) yang

diletakkan pada posisi terbalik yaitu untuk jasad renik pembentukan gas. Untuk setiap

pengenceran pada umumnya digunakan tiga atau lima seri tabung. Lebih banyak

tabung yang digunakan semakin menunjukkan ketelitian yang tinggi, tetapi alat gelas

yang digunakan juga lebih banyak.

Dalam metode MPN, pengenceran harus dilakukan lebih tinggi dari pada

pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yan berisi medium

cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu

sel jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel, sedangkan

tabung lainnya tidak mengandung sel. Dengan demikian, setelah inkubasi diharapkan

terjadi pertumbuhan pada beberpa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positif,

sedangkan tabung lainnya negative.

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik

didalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pua digunakan pada contoh yang

berbentuk padatdengan terlebih dahulu membentuk suspense 1:10 dari contoh

tersebut.Grup jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi

tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan.

Dalam metode MPN, dari setiap pengenceran dimasukkan 1 ml masing-

masing ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran

digunakan tiga seri tabung atau lima seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan

waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif, yaitu tabung yang ditimbulkan

jasad renik yang dapat ditandai dengan timbulnya kekeruhan.Misalnya pada

pengenceran pertama ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada

pengenceran kedua dua tabung positif, pengenceran ketiga satu tabung positif, dan

pada pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positif. Kombinasi menjadi 3, 2, 1, 0

dan jika diambil tiga pengenceran yang pertama kombinasinya akan menjadi 3, 2, 1.

Angka kombinasi ini kemudian dicocokan dengan tabel MPN dan nilai MPN Contoh

dapat dihiting sebagai berikut:

MPN =Nilai MPN dari tabel X

Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari tiga segi tabung

berbeda dengan tabel untuk lima seri tabung. Kombinasi yang dipilih dimulai dari

pengenceran tertingg yang masih menghasilkan semua tabung positif, sedangkan pada

pengenceran berikutnya ada tabung yang negative.Kombinasi yang diambil terdiri

dari tiga pengenceran.Jika pada pengenceran yang keempat atau seterusnya masih

ditemukan tabung yang hasilnya positif, maka jumlah tabung yang positif tersebut

harus di tambahkan pada angka kombinasi yang ketiga sampai mencapai jumlah

maksimum.

Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik tertentu

yang terdapad di antara campuran jasad renik lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan

lactose Broth maka adanya bakteri yang dapat menfermentasi lactose ditunjukkan

dengan terbentuknya gas di dalam tabung durham. Cara ini biasanya digunakan untuk

menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koliform

termasuk bakteri yang dapat mentransfer laktosa.

Reagen/bahan :

1. Metode hitungan cawan

Bahan :NA dan akuades

Sampel : Susu bubuk frisian flag

Alat : Cawan petri dan pipet

2. Metode MPN

Bahan : Air kran, akuades, dan NaCL

Sampel : Air kran/air sumur/air tahu/yogurt/asinan

Alat : Tabung pengencer

Tabung durham

Pipet

Prosedur kerja :

Metode hitung cawan

a. Sampel diencerkan dalam larutan pengencerb. Sampel dari pengenceran diambil sebanyak 0.1 ml dengan pipet dan dipindahkan ke

cawan petri sterilc. Sebelumya telah disiapkan media untuk pertumbuhan sel. Media ini biasanya

mengandung agar dan dalam kondisi yang caird. Media ini dituangkan kedalam agar dan digoyang-goyangkan supaya bahan menyebar

rata di dalam medium. Kemudian medium didiamkan sampai medium mengeras (membentuk gel) karena suhunya turun atau menjadi dingin.

e. Cawan tersebut diinkubasi dalam keadaan terbalik selama 48 jam dengan suhu 350 c.

Metode MPN

1. Dibuat sartu seri pengenceran bahan dan masing-masing tingkat pengenceran terdiri dari 3 tabung. Yang akan ditentukan jumlahnya adalah mikroba yang dapat memfermentasi lactosa dan medianya adalah lactosa broth.

2. Inkubasi 24 jam, amati jumlah tabung positif pada masing-masing tingkat pengenceran, kemudian lanjutkanninkubasi 24 jam berikutnya dan amati lagi.

Hasil :

1. Hitung cawan

Kekeruhan 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Susu segar 3 3 3 3 - - -

Air sumur - 3 3 3 3 3 3