laporan p1 biool.docx

LAPORAN RESMIPRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULERPERCOBAAN 1MERANCANG PROBE

I. TUJUANa. Merancang dan menganalisis probe yang akan digunakan dalam Southern Blot dengan menggunakan Bioinformatics data base (NCBI).b. Mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen menggunakan teknik hibridisasi dengan metode Southern Blot.

II. DASAR TEORITiap organisme memiliki gen yang merupakan sekuen DNA yang menyandi kode genetik yang dapat diekspresikan menjadi protein. Gen tidak dapat selalu diekspresikan tergantung pengaturan nomeostatis yang terjadi pada tiap organisme. Dalam beberapa kasus, seperti deteksi penyakit, pelacakan terjadinya ekspresi gen menjadi sangat penting. Oleh karena itu, dikembangkan teknik hibridisasi yang merupakan salah satu cara pengidentifikasian dengan menggunakan probe. Probe merupakan suatu istilah umum yang sering digunakan pada untai DNA atau RNA yang bersesuaian dengan gen atau sekuens yang menjadi minat. Probe dilabel baik dengan radioaktif maupun dengan molekul tertentu yang dapat dideteksi seperti biotin atau flouresin. Untai DNA tau RNA dapat berhibridisasi dengan sekuens yang komplemen / bersesuaian dengannya. Oleh karena itu probe dapat melabel plaques virus, koloni baktei maupun pita dalam gel yang mengandung gen yang menjadi minat dalam pelacakan / deteksi. Prosedur ini dinamakan DNA hibridisasi dan bergantung pada pembentukan pasangan basa yang stabil antara probe dengan sekuen target. Dasar hibridisasi adalah kemampuan DNA untuk mengalami denaturasi dan renaturasi. Pada kondisi tertentu misalnya dengan pemanasan atau penambahan basa untai ikatan H yang menyambungkan 2 basa (2 untai) akan lepas tapi tidak mempengaruhu iktan phosphodiester pada DNA. Secara in vitro, DNA single strand (ss) dapat dikembalikan menjadi DNA double strand (ds) dengan kondisi tertentu seperti penurunan suhu secara perlahan lahan setelah pemanasan( jika penurunan suhu berlangsung secara cepat maka DNA single strand akan tetap menjadi DNA single strand ). Proses pemanasan yang dilanjutkan dengan proses pendinginan secara perlahan lahan disebut annealing. Fomasi duplet DNA pada saat renaturasi tergantung pada sekuens basa yang komplemen. Pada teknik hibridisasi ini, DNA ss hasil denaturasi akan di komplemenkan dengan probe (pelacak) bukan pada pasangannya (antisense nya). Terjadi ekspresi gen dapat diketahui dengan melacak keberadaan mRNA (messenger) atau protein dari gen tersebut. Hibridisasi dapat terjadi antara :1. DNA target dengan pelacak cDNA / mRNA ( disebut Southern blot technique)2. RNA target dengan pelacak DNA / RNA ( disebut Notthern Blot Technique)3. Protein target dengan pelacak antibodi ( disebut Westhern Blot Technique)Probe yang spesifik akan melacak sekuens basa yang spesifik pula. Probe dengan spesifikasi tinggi ini diperlukan agar tidak terjadi kesalahan dalam pendeteksian, karena dalam prakteknya isolasi DNA /RNA yang dilakukan akan berkomplemen dengan DNA/RNA lain yang tidak menjadi target pelacakan (competitor). Salah satu yang mempengaruhi spesifikasi probe adalah panjang probe. Pada umumnya panjang probe adalah 100-1000 bp (base pair). Dengan adnya bioinformatics data base dapat dilakukaan perancangan suatu probe yang spesifik.

III. ALAT DAN BAHAN1. Alat Tulis2. Laptop3. Modem atau seperangkat jaringan.

IV. CARA KERJA Dibuka situs NCBI ( Website ini menyediakan gene bank data base yang diperlukan untuk merancang suatu probe.

Diisi kotak nucleotid for pada menu search dengan nama gen ( NM_000125 ) yang akan dianalisis.

Dipilih gen yang akan dianalisis.

Dengan mengacu pada sekuen CDS, probe dibuat dengan cara memblok pada origin yang termasuk dalam range CDS dengan panjang yang diinginkan. Lalu tekan COPY.

Keluar dari halaman tersebut, atau buka lagi situs yang sama lalu klik menu BLAST.

Lalu dipilih dan klik nucleotide-nucleotide blast.

Pada kotak QUERY, pastekan hasil copyan rancangan probe untuk mencari komplemennya.

Tekan BLAST. Setelah muncul halaman baru akan tekan FORMAT, akan muncul hasil format pada new window.

Dilakukan analisis lebih lanjut apakah rancangan probe yang dibuat spesiifik atau tidak.

Dirancang 3 buah probe dan dibandingkan rancangan probe mana yang paling spesifik dan diberikan alasannya.

Ditentukan promotor /TATA Box dari gen tersebut.

V. Data PengamatanA.LatihanKode Gen = NM_000125Nama Gen =Homosapiens Estrogen Reseptor 1CDS=235. . . 2022Probe 1=601. . . 1020Description Max Score % Query

Homo sapiens Estrogen Reseptor 1 (ESRI) transkip varian 4,mRNA 776100%



PREDICTED: Homo Sapiens estrogen reseptor 1, transkip variant X6, mRNA 771100%










Homo Sapiens cromosome 6 alternate assembly CHM1 1.136194%

Homo Sapiens Cromosome 6 GRCH 38.P2.Primary Assembly 36194%

Kode Gen = NM_000125Nama Gen =Homosapiens Estrogen Reseptor 1CDS=235. . . 2022Probe 2 =781. . . 1020

Description Max Score % Query

















Kode Gen = NM_000125Nama Gen =Homosapiens Estrogen Reseptor 1CDS=235. . . 2022Probe 3 =481. . . 1320

Description Max Score % Query


















B. TugasKode Gen =NM_198253.2Nama Gen =Homo Sapiens Telomerase Reverse transkriptase CDS =59. . .3457Probe 1 =61. . .300Description Max Score% Query

Homo Sapiens Telomerase Reverse Transkriptase ( TERT) transkip varian 2,mRNA 444100%


Homo Sapiens Chromosom 5, alternate assembly CHM1 1.140791%

Homo Sapiens Chromosom 5,GRCH 38.p2.Primary Assembly40791%

Kode Gen =NM_198253.2Nama Gen =Homo Sapiens Telomerase Reverse transkriptase CDS =59. . .3457Probe 2 =61. . .660Description Max Score% Query





Kode Gen =NM_198253.2Nama Gen =Homo Sapiens Telomerase Reverse transkriptase CDS =59. . .3457Probe 3 =61. . .1020

Description Max Score% Query





VI. PEMBAHASANPada praktikum ini mahasiswa diharapkan merancang,menganalisis probe secara komputerisasi menggunakan biofarmasetics database (NCBI),serta mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik hibridisasi metode Southern blot. Probe merupakan istilah yang digunakan untuk untai DNA /RNA yang bersesuaian dengan gen atau sekuens yang menjadi minat. Probe ini digunakan sebagai indikator untuk mendeteksi ekspresi suatu gen pada reseptor yang dilakukan seecara komputerisasi. Salah satu cara pengidentifikasian menggunakan probe digunakan teknik hibridisasi,dimana teknik ini bergantung pada pembentukan pasangan basa yang stabil antara probe dengan sekuens target. Dasar dari hibridisasi adalah kemampuan DNA untuk mengalami denaturasi dan renaturasi.Sehingga dengan teknik hibridisasi ini, DNA hasil denaturasi akan dikomplemenkan dengan suatu probe (pelacak),bukan dengan DNA pasangan (antisense nya). Probe dapat mendeteksi ekspresi pada suatu gen secara spesifik antara target yang diinginkan maupun target yang tidak diinginkan (kompetitor). Tapi kespesifikan suatu probe didasarkan pada panjangnya probe. Pada umumya panjang probe adalah 100-1000 bp (base pair). semakin panjang probe semakin spesifik,namun jika DNA probe terlalu panjang ,probe tersebut susah untuk disintesis dan juga probe bisa mengikat dirinya sendiri,sehingga mengurangi afinitas dengan DNA target. Penentuan panjang probe harus pada rentang pada CDS.CDS (kode sekuens) merupakan sekuens yang megkode suatu protein. Rentang CDS yang digunakan pada latihan adalah 235. . . 2022, sedangkan rentang CDS pada tugas adalah 59. . .3457. Pada Latihan, kode gen yang digunakan adalah NM_000125, dengan nama gen Homo Sapiens Estrogen Reseptor 1 (ESR1). Dilakukan 3 perancangan probe dengan panjang probe yang berbeda beda( Pendek, sedang, dan panjang). 1. Rancangan probe 1 (601. . . 1020) dengan panjang probe 419.Dari rancangan probe yang pertama ini dapat dilhat spesifikasi nya probe dengan melihat : Jumlah kompetitornya sedikit, yaitu hanya 2 % kompetitor sebesar 94 % sedangkan % gen target sebesar 100% Perbedaan max score antara gen target dan kompetitor terlalu jauh yaitu sebesar 415 ( antara 776 dan 361)Dapat disimpulkan rancangan probe 1 adalah spesifik.2. Rancangan probe 2 (781. . . 1020) Panjang probe adalah 239.Dari hasil rancangan probe , dapat dilihat spesifikasinya dengan : Jumlah kompetitornya sedikit, yaitu hanya 2 % kompetitor sebesar 89 % sedangkan % gen target sebesar 100% Perbedaan max score antara gen target dan kompetitor terlalu jauh yaitu sebesar 222 pada kompetitor 1, dan 227 pada kompetitor 2. Dapat disimpulkan rancangan probe yang kedua adalah spesifik.3. Rancangan probe 3 (481. . . 1320) Panjang probe adalah 839.Dari rancangan probe, dapat dilihat spesifikasi dengan : Jumlah kompetitornya sedikit, yaitu hanya 2 . % kompetitor dengan % gen target sam, yaitu sebesar 100%. Perbedaan max score antara gen target dan kompetitor terlalu jauh yaitu sebesar 948 pada kompetitor 1 dan 953 pada kompetitor 2. Pada Tugas, Kode gen yang digunakan adalah NM_198253.2.dengan nama gen adalah Homo Sapiens Telomerase Reverse transkriptase (TERT). Dilakukan 3 perancangan probe dengan panjang probe yang berbeda beda. a. Probe 1 (61. . .300) Panjang probe adalah 239.Dari rancangan probe , dapat dilihat spesifikasinya dengan : Jumlah kompetitornya sama dengan jumlah gen yaitu 2 % kompetitor sebesar 91 % sedangkan % gen target sebesar 100% Selisih max score antara gen target dengan kompetitor hanya 37.b. Probe 2 (61. . .660) Panjang probe adalah 599.Dari rancangan probe,, dapat dilihat spesifikasinya dengan : Jumlah kompetitornya sama dengan jumlah gen yaitu 2 % kompetitor dengan % gen target sam, yaitu sebesar 100%. Selisih max score antara gen target dengan kompetitor sebesar 396.c. Probe 3 (61. . .1020) Panjang probe adalah 959.Dari rancangan probe,dapat dilihat spesifikasinya dengan : Jumlah kompetitornya sama dengan jumlah gen yaitu 2 % kompetitor dengan % gen target sam, yaitu sebesar 100%. Selisih max score antara gen target dengan kompetitor sebesar 395.

VII. KESIMPULAN 1. Rancangan probe pada latihan dari probe 1-3 dapat dikatakan spesifik, tetapi lebih panjang probe pendeteksiannya lebih spesifik pula dilihat dari jumlah selisih max score antara gen target dengan kompetitor.2. Rancangan probe pada tugas dapat dikatakan tidak spesifik . Hal ini dikarenakan jumlah kompetitor dari gen target dengan kompetitor sam yaitu 2, dan % queri antara gen target dan kompetitor sam yaitu 100%, selisih max score yang dihasilkan juga tidak jauh berbeda. Hal ini dapat disimpulkan bahwa ketiga rancangan probe yang dibuat tidak bisa mendeteksi gen target secara spesifik.

DAFTAR PUSTAKA Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538-539.

Schlamp, K.; Weinmann, A.; Krupp, M.; Maass, T.; Galle, P. R.; Teufel, A. (2008). "BlotBase: A northern blot database". Gene 427 (12): 4750.

laporan p1 biool.docx

Documents

Transcript of laporan p1 biool.docx