LAPORAN RESMIPRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LAUTACARA 2TEKNIK PENANAMAN, ISOLAT, DAN TPC

LUTFI RAHMAWATI26020114120043ILMU KELAUTAN - ASHIFT 1

MAULANA JULIA RACHMA26020113120036MUHAMMAD SALAUDDIN R. D.26020113130120PROGRAM STUDI ILMU KELAUTANJURUSAN ILMU KELAUTANFAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTANUNIVERSITAS DIPONEGOROSEMARANG2015

Nutrisi dan PertumbuhanTopik 1 : Penanaman dan Isolasi

1. Jelaskan bagaimana menggunakan mikropipetMenurut Mariyana (2012) bahwa, cara menggunakan mikropipet yaitu: Atur besaran ukuran yang akan diambil Tip diambil dan dihubungkan dengan mikropipet Tekan tombol penghisap pada mikropipet dan masukkan ketabung reaksi Lepas tombol penghisap Cairan dimasukkan kedalam cawan petriPegang mikropipet dengan genggaman menyerupai petinju (seperti mau meninju orang), dengan ibu jari berada di bagian pengatur volume. Tambahkan tip pada ujung pipet dengan cara menekan tip yang berada dalam kotak tip. Lihat dan pelajari kekuatan tekanan dengan cara melihat ujung tip. Untuk memipet larutan, pengaturan berada di tombol bagian atas. Tekanlah tombol sampai berhenti secara alami. Sebagai contoh dengan menggunakan P20, jarak tekanan untuk memipet 2 ullarutan akan lebih dekat dibanding memipet 20 ul. Jadi singkatnya untuk menggunakan mikropipet yaitu: tekan tombol sampai berhenti, tahan, masukkan ujung tip (kira-kira 2 mm) ke dalam larutan yang akan diambil, dan lepaskan tekanan secara perlahan. Hal ini penting, terlebih untuk mengambillarutan yang memiliki tingkat kekentalan (viscosity) tinggi. Setelah itu, masukkan larutan yang telah diambil ke dalam wadah yang baru. Perlahan tekanlah tombol untuk mengeluarkan larutan dari pipet. Setelah semua larutan keluar, lepaskanlah tekanan perlahan. Untuk memipet larutan yang sangat sedikit (kurang dari10 ul atau kurang dari satu tetes), maka tempelkanlah terlebih dahulu ujung tip pada dinding wadah yang baru. Setelah semua selesai, lepaskan tip dari mikropipet dengan cara menekan tombol pembuang (yang berada di bagian belakang), dan buang pada wadah khusus sampah tip. Perlu diingat, gantilah tip jika menyentuh benda-benda lain sebelum memipet cairan yang dimaksud (Mariyana, 2012).2. Apa tujuan pemijaran pada teknik aseptic Tujuan pemijaran pada teknik aseptic yaitu untuk membunuh bakteri yang ada pada jarum ose dan agar jarum ose tidak terkontaminasi oleh bakteri lain. Pemijaran langsung digunakan untuk sterilisasi alat logam, bahan yang terbuat dari porselen, tidak cocok untuk alat yang berlekuk karena pemanasannya tidak rata. Suhu yang digunakan 500-600oC dalam waktu beberapa detik, untuk alat logam sampai berpijar, sehingga mikrobanya mati (Suligundi, 2013).

3. Apa tujuan sub kultur ?Sub kultur adalah Membudidayakan sesuatu menjadi organisme baru yang lebih kecil dan mempunyai sifat seperti induknya (Suryowinoto,1991) berarti tujuan dari sub kultur untuk memisahkan bakteri atau jamur tertentu yang akan diamati menjadi sampel baru dari hasil penanaman sebelumnya. Tujuan sub kultur yaitu untuk memisahkan bakteri dari media atau tempat tumbuh sebelumnya ke media baru agar tumbuh menjadi koloni yang baru dan untuk memisahkan bakteri atau jamut tertentu yang akan diamati menjadi sampel baru dari hasil penanaman sebelumnya (Diharmi, 2011).

4. Dalam melakukan subkultur kapan menggunakan jarum oseJarum ose atau disebut juga jarum inokulum berfungsi menginokulasi kultur mikrobia serta memindahkan suatu kultur mikroba (koloni) pada media satu ke media lainnya Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah agar. Prinsip kerjanya yaitu ose disentuhkan pada bagian mikrobi kemudian menggosokkan pada kaca preparat untuk diamati (Diharmi, 2011).Saat menginokulasi biakan dilakukan dengan jarum ose pada permukaan atas agar yang penuh dengan biakan campuran (misalnya specimen ludah atau bahan lain). Ada beberapa metode penggoresan yang berbeda, namun kesemua metode bertujuan untuk meletakkan sebagian besar organisme pada beberapa goresan pertama. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakkan jarum ose bergantian dari satu bagian ke bagian lain cawan petri, bakteri yang tertinggal pada jarum ose semakin berkurang. Jika dilakukan secara sempurna, goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami pertumbuhan, koloni yang berasal dari bakteri individual akan benar-benar terpisah satu sama lain. Kemudian koloni tunggal dapat ditinggalkan kemedium steril, dan akan tumbuhlah biakan murni (Diharmi, 2011).

5. Bagaimana mungkin bisa terjadi kontaminasi subkultur ?Ketika dalam proses pemindahan sampel dilakukan jauh dari bunsen dan setelahnya cawan petri tidak dirapatkan dengan plastic wrap sehingga mikroba yang tidak diperlukan terkontaminasi di dalam sampel. Karena itu dilakukan strerilisasi kondisi dimana semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium dan pengerjaan, dijaga agar tetap steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi (Yulvizar, 2013).Sebelum penggunaan dalam proses pengamatan dilakukan sterilisasi. Sterilisasi merupakan hal yang erat dengan pembuatan medium isolasi dan pembiakan mikroorganisme secara murni. Pengertian umum sterilisisasi adalah suatu proses yang berusaha membebaskan bahan atau alat dari mikroorganisme. Namun perlu diketahui bahwa bahan atau alat yang telah melalui proses sterilisasi tidak akan benar-benar bebas dari mikroorganisme. Tujuan utama sterilisasi adalah untuk meminimalkan gangguan oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki (kontaminan), sekaligus meminimalkan gangguan akibat proses sterilisasi itu sendiri sekecil mungkin (Yulvizar, 2013).

6. Bagaimana menentukan bahwa media yang akan digunakan benar-benar steril sebelum digunakan Untuk menentukan media yang akan digunakan benar-benar steril yaitu sebelum penggunaan dalam proses pengamatan, media dan alat yang akan digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu dalam autoklaf.Menurut Rtakhmawati (2012) bahwa, ada beberapa macam sterilisasi alat :1. Sterilisasi dengan pemijaran2.Sterilisasidenganudarakering3.Sterilisasidenganuapair 4.Sterilisasidenganuappanas 7. Bagaimana tanda-tanda terjadinya pertumbuhan pada medium cair Tanda-tanda terjadinya pertumbuhan pada medium cair yaitu dengan melihat kekeruhan dalam medium cair menunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan medium kaldu pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel (Sunaryanto, 2011).Ciri-ciri pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair, ditandai dengan adanya kekeruhan, bentuk cincin, pelikel serta ada tidaknya endapan. Bila pertumbuhan mikroorganisme menumpuk di bagian dasar tabung akan terlihat sedimen, sebaliknya bila mikroorganisme tumbuh dibagian permukaan terlihat sebagai pelikel berupa lapisan tipis pada permukaan. Kadang pertumbuhan merupakan gabungan keduanya (Sunaryanto, 2011).

8. Jelaskan apa yang dimaksud dengan kultur cair dan apa bedanya dengan kultur miringPerbedaannya terletak pada media yang digunakan. Kultur cair yaitu kultur yang menggunakan media cair, seperti zobel cair. Media cair juga merupakan media yang mempunyai komposisi bahan dan nutrisi yang diperlukan tanpa bahan pemadat (agar). Media miring, yaitu media agar padat dalam tabung reaksi yang diletakkan miring sehingga mempunyai permukaan media yang lebih luas daripada permukaan agar tegak, digunakan untuk menumbuhkan dan menyimpan biakan murni sebagai stock biakan murni (stock pure culture) (Sunaryanto, 2011).

9. Apa fungsi mineral oil steril dalam pemeliharaan stok kulturPenyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan secara berkala jangka pendek, misalnya sebulan sekali dari media lama ke median baru. Beberapa teknik penyimpanan sederhana yang efektif Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan dalam Minyak mineral (Skerman 1973) dasar teknik penyimpanan ini yaitu mempertahankan viabilitas mikroba dengan mencegah pengeringan medium, sehingga waktu peremajaan dapat diperpanjang hingga beberapa tahun( Mahmud, 2001 ).

10. Jelaskan bagaimana suatu kultur dapat di lyophilisasiMenurut Mirsadiq (2013) bahwa, prinsip dari lyophilisasi yaitu penyusun atau penurunan suhu dibawah titik beku untuk menurunkun aktivitas enzim dan penghilangan air sel dengan cara pengeringan vakum untuk menghambat metabolisme. Cara kerja dari lyophilisasi yaitu : Sel-sel dalam fase stasioner dibuat suspense dalam medium pelindung seperti susu, serum atau natrium glutamat Beberapa tetes suspense dimasukkan kedalam ampul, kemudian dibekukan dan divakum sampai sublimasi selesai Ampul ditutup dan disimpan dalam refrigerator

11. Apa yang dimaksud dengan koloni bakteriKoloni bakteri merupakan sekumpulan bakteri sejenis yang mengelompok menjadi satu. Dalam suatu media, koloni bakteri akan terlihat membentuk satu titik dengan ukuran dan bentuk yang bervariasi (Suligundi, 2013).

12. Mengapa diperlukan membuat seri pengenceran agar proses penanaman dan isolasi mikrobiaUntuk mendapatkan hasil bakteri yang lebih utuh atau spesifik dan memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tesuspensi dalam cairan (Rakhmawati, 2012).

13. Jelaskan bermacam macam bentuk bentuk koloniMenurut Damongilala (2009), macam-macam bentuk koloni yaitu : Bentuk koloni tampak atas : Titik-titik Bulat Seperti benang Tak teratur Serupa akar Kumparan Bentuk koloni tampak samping : Rata Timbul datar Melengkung Mencembung Membukit Serupa kawah Bentuk koloni tampak atas : Utuh Berombak Berbelah Bergerigi Berbenang Keriting

14. Apa tujuan teknik spread-plateTeknik spread plate (cawan sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau menghapuskannya di atas media agar yang telah memadat, sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belom memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan agar (Mahmud, 2001 ).

15. Pada semua pekerjaan laboratorium yang menggunakan cawan petri, kenapa label diletakan di bawah cawan petriPenggunaan pada label yang digunakan untuk memberi tanda dan diletakkan dibawah cawan petri agar saat melakukan pengamatan pertumbuhan kultur tidak terganggu karena pengamatan biasanya dilakukan melalui bagian atas cawan petri dan untuk menghindari penguapan dari media yang akan menggangu pengamatan.

16. Pada teknik streak-plate, bagaimana mikroorganisme diencerkan dan disebar untuk membentuk koloni individuJarum ose yang sudah terdapat sampel bakteri ditempelkan pada cawan petri kosong, kemudian sampel mikroorganisme diratakan dalam cawan petri tersebut secara zig-zag, pertama rapat kemudian semakin lama semakin renggang. Tujuannya untuk memperoleh koloni bakteri yang utuh dan terpisah.

17. Pada area yang mana dari media dalam cawan petri yang akan ditumbuhi paling padat oleh pertumbuhan bakteri ? Dan dimana yang terdapat pertumbuhan paling sedikit ? jelaskanPertumbuhan bakteri akan terdapat lebih banyak pada cawan petri yang dioleskan jarum ose secara merapat, karena akan koloni yang terbentuk lebih berdekatan. Sedangkan pertumbuhan bakteri paling sedikit pada bagian cawan petri yang dioleskan jarum ose secara merenggang, karena bakteri tidak terlalu rapat dan banyak membentuk koloni.

18. Apakah setiap koloni yang terpisah menggambarkan pertumbuhan satu sel? Bagaimana membuat agar diperoleh koloni tunggal?Ya, karena koloni terpisah biasanya akan memiliki bentuk sel yang berbeda. Koloni tunggal didapatkan dari proses purifikasi, dimana dari proses ini didapatkan kultur murni suatu bakteri.

19. Bagaimana streak-plate dapat terkontaminasiMetodespread plateyaitu teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar, agar diperoleh kultur murni. Suspensi cairan diambil sebanyak 0,1 ml dengan mikropipet kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Trigalski kemudian dibakar diatas bunsen dan didinginkan beberapa detik. Kemudian suspensi diratakan dengan menggosokannya pada permukaan agar. Setelah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC, bakteri udara pengenceran 10-4, diperoleh jumlah koloni sebanyak 4 koloni yang berbentuk rhizoid dan circulair, berwarna krem serta pertumbuhannya pada permukaan medium. Pada koloni ini tidak dilakukan pengamatan dengan pengecatan gram. Kelebihan metode ini adalah diperoleh koloni bakteri yang terpisah, labih mudah dilakukan dan membutuhkan medium yang sedikit. Kekurangannya adalah waktu yang digunakan lebih lama dan mudah terkontaminasi (Yulvizar, 2013).

20. Bagaimana hasil metode pour-plate dibandingkan dengan streak-plate dan spread-platePada pour-plate menghasilkan paling banyak koloni bakteri, karena bakteri dapat tumbuh lebih merata dibandingkan teknik streak-plate dan spread-plate, hal tersebut karena pertumbuhan bakteri lebih merata pada media agarnya.

21. Sebutkan keuntungan utama metode pour-plate dibandingkan metode isolasi bakteri yang lain?Keuntungan utama metode pour plate yaitu rendahnya kontaminasi, karena pertumbuhan sel bakteri tidak hanya pada bagian permukaannya saja, tetapi di dalam media juga ada pertumbuhannya. Kelebihan dari metode pour plate adalah tekniknya mudah dilakukan. Dan, karena sampel dikocok homogen maka bakteri aerob maupun anaerob dimungkinkan dapat hidup. Dengan menggunakan metode pour plate bakteri yang diamati pada pertumbuhannya akan menyeluruh pada seluruh bagian media agar, sedangkan menggunakan metode spread plate bakteri yang tumbuh hanya pada bagian permukaan media agarnya saja ( Mahmud, 2001 ).

22. Mengapa agar (yang telah dilelehkan) pada suhu 48 dan 50C tidak mematikan sebagian besar bakteri.Mikroba patogen biasanya tumbuh baik pada suhu 37 derajat celcius meskipun sebagian besar berkembang biak pada suhu 15 sampai 45 derajat celcius, Clostridium perfringens tumbuh dan berbiak pada suhu 47 sampai 50 derajat celcius suhu 10 sampai 20 derajat celcius tidak akan membunuh bakteri. Pada umumnya suhu tersebut hanya memperlambat pertumbuhan bakteri. Ditambahkan pada suhu didih (100 derajat celcius), semua bakteri akan mati, tetapi bakteri yang berspora masih bisa bertahan. Bahkan, suhu sterilisasi (110 derajat celcius ) pun hanya bisa membunuh sel-sel vegetatif bakteri tadi. Untuk membunuh spora bakteri diperlukan waktu lebih lama, mungkinhingga lima jam sterilisasi bahkan lebih (Damongilala (2009).

23. Jelaskan bagaimana pour-plate dapat digunakan untuk isolasi jamur.Pour plate tidak dapat digunakan untuk isolasi jamur karena jamur memiliki hifa dan spora yang terus tumbuh, sedangkan metode ini hifa dan spora tidak dapat tumbuh pada medianya. Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur atau biakan murni. Ada beberapa cara umum yang dapat dilakukan dengan cara goresan (steak plate), cara taburan atau tuang (pour plate), serta mikromanipulator (the micromanipulator methods) (Yulvizar, 2013).

24. Mengapa cawan petri harus dibalik pada saat dilakukan inkubasiWadah media yang menggunakan cawan petri, pada saat inkubasi mikroba pada cawan petri selalu dalam posisi terbalik. Hal ini dimaksudkan supaya saat inkubasi berjalan, uap yang dihasilkan oleh panas diperkirakan jatuh hanya pada tutup cawan petri yang berada di bawah sehingga tidak dikhawatirkan akan terkenai medium dan tidak mengganggu proses kultivasinya, sehingga kualitas mikroba tidak rusak atau mengalami gangguan (Yulvizar, 2013).

Simpulan dan Saran : Simpulan :1. Ada 4 teknik penanaman yaitu spread plate, pour plate, isolasi dan purifikasi2. Isolasi mikroba merupakan memindahkan mikroba dengan lingkungannya dengan mengisolasi mikroba bakteri yang diperlukan atau dengan kata lain mikroba yang tidak kita butuhkan segera disingkirkan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni sendiri yaitu kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal3. Memisahkan mikroba dari hasil penanaman di cawan petri ke agar miring dengan cara menggoreskan jarum ose ke cawan petri yang berisi mikroba lalu digoreskan secara zig-zag ke agar miring dari yang merapat hingga merenggang.

Saran :1. Sebaiknya saat menggoreskan bakteri ke media tidak terlalu di tekan, agar media tidak rusak2. Sebaiknya saat memindahkan bakteri ke media didekatkan ke bunsen agar tidak terjadi kontaminasi

Daftar PustakaDamongilala, Lena Jeane. 2009. Kadar Air Dan Total Bakteri Pada Ikan Roa (Hemirhampus Sp) Asap Dengan Metode Pencucian Bahan Baku Berbeda. FPIK UNSRAT. Manado.Diharmi, Andraini. 2001. KARAKTERISTIK KARAGENAN HASIL ISOLASI Eucheuma Spinosum (Alga Merah) DARI PERAIRAN SEMENEP MADURA. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Machmud, Muhammad. 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.Mariyana, Ana. 2012. Pengaruh Penguasaan Penggunaan Mikroskop Terhadap Nilai Praktikum Ipa Materi Pokok Organisasi Kehidupan Pada Siswa Kelas Vii Di Mts Negeri Ketanggungan Brebes Tahun Pelajaran 2011-2012. Institut Agama Islam Negeri Walisong. Semarang.Suligund, Bonifasia Tripina. 2013. Penurunan Kadar Cod (Chemical Oxygen Demand) Pada Limbah Cair Karet Dengan Menggunakan Reaktor Biosand Filter Yang Dilanjutkan Dengan Reaktor Activated Carbon. Jurusan Teknik Sipil Fakultas Teknik. Universitas TanjungpuraSunaryanto, Rofiq. 2011. Isolasi, Purifikasi, Identifikasi, Dan Optimasi Medium Fermentasi Antibiotik Yang Dihasilkan Oleh Aktinomisetes Laut. Institut Pertanian Bogor. Bogor.Yulvizar, Cut. 2013. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Probiotik Pada Rastrelligersp. Isolation And Identification Of Probiotic Bacteria In Rastrelligersp. Universitas Syiah Kuala. Indonesia.

Nilai Akhir:...............................................................................Nama & Paraf Asisten: ............................................................

Perhitungan Jumlah Total BakteriTopik 1 : Teknik Total Plate Count

1. Mengapa teknik plate count dianggap sebagai pengukuran tidak langsung dari kepadatan selTeknik plate count dianggap sebagai pengukuran tidak langsung dari kepadatan sel karena pada teknik perhitungan ini yang terhitung hanya bakteri hidupnya saja. Pertumbuhan tersebut dapat diukur secara langsung maupun tidak langsung. Pengukuran langsung akan diperoleh jumlah keseluruhan mikrobia, baik yang hidup maupun yang mati, sedangkan pengukuran tidak langsung hanya menghitung mikrobia yang hidup. Pengukuran langsung dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Pengukuran tidak langsung dapat dilakukan dengan metode plate count, MPN maupun dengan pengukuran turbiditas dengan menggunakan spektrofotometer (Maulana, 2012).

2. Apa keunggulan metode plate count dibandingkan metode spektrofotometriMetode plate cout merupakan metode dengan menggunakan pengukuran standar kepadatan sel secara tidak langsung dan hanya bakteri yang hidup saja yang terhitung. Sedangkan metode spektofotometri merupakan perhitungan yang didasarkan pada kekeruhan dan hasil pengukurannya menghitung bakteri yang hidup dan mati (Dwidjoseputro, 2005).Menurut Dwidjoseputro (2005), keunggulan dari metode plate count yaitu : Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus Hanya sel mikroba yang hidup dan dapat dihitung Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik.

3. Berikan beberapa alasan mengapa perlu untuk mengguncang kosong air 25 kaliMenurut Nugie (2011), untuk mengguncang kosong air 25 kali yaitu agar : Memecah sub koloni agar menjadi koloni Meratakan bakteri agar tumbuh di seluruh permukaan media Mendistribusikan bakteri sehingga tidak memadat di satu tempat

4. Apa yang dimaksud dengan CFU?CFU adalah singkatan dari Colony-Forming Unit yang mencerminkan satuan mikroba yang membentuk sebuah koloni, setiap sel bakteri yang layak adalah terpisah dari yang lain dan akan berkembang menjadi satu koloni diskrit. CFU adalah singkatan dari Colony-Forming Unit yang mencerminkan satuan mikroba yang membentuk sebuah koloni (Mieke, 2010).

Simpulan dan Saran : Simpulan :1. Melakukan perhitungan plate count dilakukan dengan cara membagi cawan petri menjadi 8 kuadran dan 2 kuadran, setiap kuadran dilakukan 3 kali perhitungan untuk dicari rata-rata 2. Jumlah bakteri yang telah ada berhasil ditanam dapat dihitung dengan menggunakan perhitungan total plate count

Saran :1. Sebaiknya pada saat melakukan perhitungan bakteri harus berada di tempat yang terang dan diberi pencahayaan agar dapat mengamati bakteri dengan baik dan teliti2. Pada saat melakukan perhitungan harus teliti dan benar agar hasil yang didapatkan maksimal Daftar Pustaka Dwidjosapoetra D. 2005. Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

HarleyPrescott:, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition, The McGrawHill Companies, 449 p.

Maulana,Puri.2012.http://perpustakaancyber.blogspot.com/2012/11/pertumbuhan- mikroba-kurva- laju -lag- eksponensial-stasioner-bakteri-pengaruh-kecepatan.html.

Mieke. 2010. http://isjd.pdii.lipi.go.id/index.php/.

Nugie, Nugroho. 2011. http://onlineortho.blogspot.com/2011/01/pengambilan-sampel -bakteri-pengujian.html.

Nilai Akhir:...............................................................................Nama & Paraf Asisten: ............................................................