BAB III

METODE KERJA

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum analisis keamanan pangan dilaksanakan selama lima hari berturut-

turut dari tanggal 23-27 April 2012. Pada tanggal 23 Januari dilakukan praktikum

pembuatan media LB, BGLBB, EMBA dan penenceran NaCl pukul 08.00-10.00

wita. Pada tanggal 24 Januari dilakukan praktikum uji pendugaan pukul 07.00-

08.30 wita. Pada tanggal 25 Januari dilakukan uji kepastian pukul 07.00-08.30

wita. Pada tanggal 26 Januari dilakukan uji pelengkap pukul 07.00-08.30 wita.

Pada tanggal 27 Januari dilakukan pengamatan uji pelengkap dan dilaukan

perhitungan MPN count.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

- Tabung reaksi

- Rak tabung

- Tabung durham

- Lampu bunsen

- Mikropipet

- Blue tip

- Korek api

- Kertas label

- Pipet volume 10 ml

- Petridish

- Jarum ose

- Laminar air flow

- Inkubator

- Vortex

- Aluminium foil

- Gelas kimia

3.2.2 Bahan

- Alkohol 70 %

- NaCl 0,9 %

- Susu kedelai

- Media LB

- Media BGLBB

- Aquades

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Pembuatan Media

1. Disiapkan alat dan bahan untuk membuat media

2. Disiapkan bahan bubuk lactose dan air untuk membuat media LB.

3. Dimasukkan bubuk lactose dan air dalam erlenmeyer.

4. Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan hot plate stirrer. Jangan

dipanaskan.

5. Kemudian dimasukkan media LB kedalam tabung reaksi sebanyak 5 ml

dengan pipet volum.

6. Disiapkan bahan brillian green dan air untuk membuat media BGLBB.

7. Dimasukkan brillian green dan air dalam erlenmeyer. Kemudian

dihomogenkan dengan hot plate stirrer. Jangan dipanaskan.

8. Diambil 5 ml media BGLBB dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

9. Disiapkan bahan serbuk EMBA dan air untuk membuat media EMBA.

10.Dimasukkan serbuk EMBA dan air dalam erlenmeyer kemudian

dipanaskan dan dihomogenkan diatas hot plate stirrer.

11.Dimasukkan 15 ml media EMBA kedalam cawan petri.

12.Disiapkan bahan garam dan air untuk membuat pengenceran NaCl.

Kemudian dihomogenkan dengan hot plate stirrer. Jangan dipanaskan.

13.Diambil 4,5 ml pengenceran NaCl dimasukkan dalam tabung reaksi.

3.3.2 Uji pendugaan (Media LB)

1. Disiapkan alat dan bahan, sampel dikocok 25 kali.

2. Disemprot tangan dengan alkohol 70 %.

3. Pasangankan blue tip pada mikropipet.

4. Dibuka botol sampai berisi susu kedelai.

5. Diambil tabung yang berisi LB untuk seri pertama yaitu seri dengan 5

ml sampel + 5 ml media LB, dibuka aluminium foil.

6. Dimikropipet 10 kali sampel susu kedelai, masukkan dalam tabung

reaksi isi media LB. masukkan sampel sebanyak 5 ml ke 2 tabung reaksi

isi media LB yang lain. Kemudian ditutup dengan aluminium foil. (seri

10).

7. Dimasukkan lagi sebanyak 0,5 ml sampel kedalam 3 tabung isi media

LB seri I dengan mikropipet.

8. Diambil tabung pengenceran NaCl yang pertama, diambil sampel

sebanyak 0,5 ml, dimasukkan dalam tabung pengenceran NaCl pertama.

9. Kemudian divortex, diambil sebanyak 0,5 ml dan dimasukkan dalam 3

tabung isi media LB yang baru.

10.Diambil 0,5 ml dari tabung reaksi isi NaCl dan sampel yang telah

divortex (10-1), dimasukkan kedalam tabung isi NaCl yang baru,

kemudian di vortex (10-2).

11.Diambil 0,5 ml dari tabung 10-2 , dimasukkan dalam 3 tabung isi media

LB yang baru. Ditutup dengan aluminium fil

12.Semua tabung reaksi diikitan sesuai dengan serinya, kemudian

diinkubasikan selama 24 jam dengan 37o C.

3.3.3 Uji Penegas (BGLBB)

1. Dikeluarkan tabung uji pendugaan dari inkubator

2. Diamati mana tabung yang positif (keruh/mengandung bakteri).

Kemudian dihitung MPN count.

3. Disemprot tangan dengan alkohol 70 %.

4. Diinokulasikan 1 ose dari masing-masing tabung pengujian ke tabung isi

media BGLBB dengan cara, dipanaskan terlebih dahulu jarum ose diatas

bunsen kemudian anginkan, dimasukkan kedalam tabung pengujian

sambil digoyang-goyang kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi

isi media BGLBB sambil digoyangkan jarum ose. Lakukan inokulasi

pada semua tabung isi media BGLBB.

5. Tabung kemudian di inkubasikan dengan suhu 37oC selam 24 jam.

6. Hitung tabung durham yang mengandung udara/positif mangandung

bakteri.

7. Hitung nilai MPN.

3.3.4 Uji pelengkap

1. Dari tabung yang positif keruh dan menghasilkan gelembung pada uji

penegasan.

2. Dipanaskan jarum ose diatas api bunsen, kemudian diangin-anginkan/

3. Diinokulasikan dalam tabung dengan cara masukkan dalam tabung uji

penegas kemudian digoyangkan. Dilakukan streak dalam petridish isi

media EMBA.

4. Inokulasikan semua tabung uji penegas ke dalam semua petridish.

5. Inkubasikan secara terbalik dengan suhu 37oC selama 24 jam.

6. Amati bentuk koloni yang tumbuh pada medium EMBA. Uji positif bila

terdapat koloni hijau metalik dengan titik hitam ditengah koloni pada

medium EMBA.