Laporan Praktikum Nama :

Mikrobiologi NIM :

Hari/Tanggal :

Waktu :

Asisten : 1.

2.

PJP :

PEWARNAAN MIKROBA

( Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Spora )

Pendahuluan

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Jawetz 2008).

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya (Prescott 2008).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe

disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Bailey 2007).

Cara pewarnaan Gram diciptakan pertama kali tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi yang bernama Christian Gram. Cara pewarnaan ini merupakan cara pewarnaan diferensial, dimana dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi dua grup yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan di dalam air dan dilihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna yang kontras dengan medium di sekelilingnya (Sacher dan McPherson, 2004).Sebelum dilakukan pewarnaan, maka sel-sel bakteri harus terlebih dahulu difiksasi pada gelas objek. Jika kultur diambil dari medium cair, maka penyebaran dapat langsung dilakukan diatas kaca objek yang bersih menggunakan jarum loop atau jarum ose. Tetapi jika kultur diambil dari agar padat, maka sebelumnya diatas kaca objek harus diberi setetes air, kemudian kultur diambil sedikit menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, dan diratakan di atas kaca objek sehingga terbentuk lapisan tipis. Bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Sedangkan bakteri E. coli, Enterobacter aerogenes, dan Pseudomonas tergolong bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Pada proses ini yang harus dihindari adalah fiksasi panas berlebihan, yang dapat merusak integritas struktural bakteri dan morfologi sel. Alasan keberhasilan metode pewarnaan Gram adalah bahwa mikroorganisme yang tidak diwarnai, dan bakteri terwarnai dapat dibedakan berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya. Bakteri gram positif terwarnai ungu memiliki dinding sel yang tebal, dan bakteri gram negatif yang terwarnai merah memiliki dinding sel yang relatif tipis, dilapisi oleh membran luar yang mengandung lipopolisakarida. Etanol merupakan decolorizer yang lebih lambat dibandingkan dengan aseton (Sacher dan McPherson, 2004).Bakteri gram positif adalah bakteri yang memepertahankan zat warna gram A yang mengandung kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri negatif akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat warna gram D (safranin) (Brooks et al., 2001).Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ujung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu dengan lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai. Kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. Streptokokus : sel membelah diri pada satu bidang dan tetap melekat membentituk rantai, tetrakokus : sel membelah diri pada dua bidang dan membentuk kelompok yang terdiri dari empat sel. Stafilokokus : sel membelah diri pada tiga bidang dan membentuk gerombolan kokus, sarsina : membentuk kubus (Pelcszar dan Chan, 1986). Bakteri

terdapat dalam berbagai bentuk : basilus (seperti batang), kokus (bentuk bulat), spirilus (spiral), spiroketa (ulir atau heliks) dan bercabang. Karena sel-sel individual bakteri terlampau kecil, sehingga memiliki variasi dalam bentuk dan ukuran (Elrod dan Stansfield, 2006).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empirisuntuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, grampositif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding selmereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwanDenmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknikini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteriKlebsiella pneumoniae.Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antarakomponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yangdisebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik padakomponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan inimaka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.Pembuatan film / apusan bakteri dilakukan sebelum proses pewarnaangram. Beberapa langkah dalam pembuatan film ini diantaranya pembersihangelas objek dengan kapas yang sudah diberi alkohol 70%. Pembersihan inidimaksudkan agar gelas objek steril dan tidak ada mikroorganisme lain yangmenempel pada gelas objek tersebut. Kemudian gelas objek yang sudahdisterilkan tersebut dikeringkan dengan cara di angin-anginkan. Langkahselanjutnya yaitu pengambilan Öse suspense bakteri secara aseptis.Pengambilan dilakukan secara aseptis agar bakteri yang akan diamati tidakmengalami kontaminasi dengan mikroorganisme lain yang ada disekitarnya. Kemudian bakteri yang telah diambil tadi dioleskan pada gelasobjek dengan penyebaran setipis mungkin.

Proses pewarnaan Gram memiliki beberapa tahap. Pertama,pemberian pewarna kristal violet pada bakteri yang diletakkan di atas gelasobjek tadi. Pewarna kristal violet ini berguna sebagai indikator bakteri grampositif. Setelah ditetesi pewarna kristal violet, objek glas dibilas dengan airaquades, gelas objek dipegang pada posisi miring kemudian dikeringkandengan menempelkan kertas serap yaitu kertas tissue pada bakteri tanpamengelapnya. Kedua, pemberian Gram Iodium (lugol) yang berfungsisebagai pembentuk kompleks ungu kristal-yodium (UK-Y), kemudiandiamkan selama satu menit lalu dibilas kembali dengan air aquades dandikeringkan seperti tadi. Ketiga, pemberian alkohol 95% untukmenghilangkan warna pada gelas objek sampai warna tidak luntur lagi (± 20detik) lalu dibilas dan dikeringkan lagi. Keempat, pewarnaan dengan larutansafranin yang berfungsi sebagai indikator bakteri gram negatif ataupunpositif selama ± 20 detik kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan.Setelah melakukan tahapan-tahapan tersebut kita akan mendapatkan

warna yang khas, warna ungu kebiruan untuk bakteri Gram positif yangmenyerap pewarna kristal violet dan warna kemerahan untuk bakteri Gramnegatif yang menyerap larutan safranin. Bakteri gram positif adalah bakteriyang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaanGram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop.Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah mudakarena tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaanGram. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutamadidasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.Bakteri gram positif dinding selnya tersusun oleh peptidoglikan dalamjumlah besar. Sedangkan bakteri gram negatif mengandung lebih sedikitpeptidoglikan namun strukturnya lebih kompleks, dimana bagian terluarnyatersusun atas lipopolisakarida (rantai karbohidrat dan lipid). Bakteri gramnegatif lebih berbahaya karena lipopolisakarida bersifat racun.

membran terluar bakteri gram negatif nemberikan perlindungan kepadabakteri gram negatif terhadap bertahan dari sel inang.

Berdasarkan pengamatan dengan perbesaran mikroskop 100 kali yangdilakukan ketika praktikum dari sampel yang diberikan kepada praktikanadalah sampel C diperoleh bakteri dengan warna ungu kebiruan, berbentukbasil, dan bergerombol. Bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif danmerupakan bakteri Lactobacillus sp, yaitu lebih tepatnya bakteriLactobascillus bulgaricus. Bakteri ini tidak berspora, berbentuk batang yangpanjang, anaerobik fakultatif dan katalase negatif. Bakteri ini menyerupaistreptokoki dalam kebutuhannya akan nutrien (Fardiaz, 1992).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan

gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini

diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram

(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Iud W

2008).

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi

dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat

bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh

komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan

pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp

Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus

Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri

dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di

dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak

permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak

terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram

(Entjang I 2003).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu

ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan

negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri

karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan

inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat

dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada

muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat

pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah

methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada

umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya

mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel

sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel.

Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna,

substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri

gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna

merah.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1.      Zat warna utama (violet kristal)

2.      Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan

warna utama

3.      Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang

digunakan uantuk melunturkan zat warna utama

4.      Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-

sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,

sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua

bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini

berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan

struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

1.      Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2.      Pengintesifan cat utama dengan penambahan iod.

3.      Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol 96%.

4.      Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih.

Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu.

Pembersihan biasanya  menggunakan alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri

satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan

diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu

banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri

tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan

mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.

Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas

nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca

obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian.

Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung

bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian

ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir

dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air

bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah

kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan

sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri

kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol

dan dicuci kembali dengan air mengalir.

Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan.

Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati

dibawah mikroskop.

Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan

warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada

bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri

gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam

persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada

praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga

memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel

dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif

sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan

alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun

sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada

komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel 

dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat

lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol

memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal

yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative

lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk

membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat

dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

2.      Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan

terdapat didalam.

3.      lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak

mengandung asam tekoat.

4.      Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5.      Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal

violet.

6.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

7.      Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

8.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.

9.      Peka terhadap streptomisin.

10.  Toksin yang dibentuk Endotoksin.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

2.      Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada

yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat

ringan. Mengandung asam tekoat.

3.      Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4.      Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6.      Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.

8.      Tidak peka terhadap streptomisin.

9.      Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Berdasarkan pengamatan pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil

dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan

morfologi koloni streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan

morfologi koloni streptobacil, sampel 4 morfologi sel berbentuk bacil dan

morfologi koloni streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan

morfologi koloni streptobasil.

Simpulan

Berdasarkan pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada sampel 1

morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2

morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi koloni streptococus, sampel 3

morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobacil, sampel 4

morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil dan sampel 5

morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil.

Daftar Pustaka

Bailey and Scott’s. 2007. Diagnostic Microbiology 12th edition. Mosby Elsevier : Houston.Entjang I.  2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta : PT.

Citra Aditya BaktiIud W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang : UMM PressJawetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta : Penerbit Buku

Kedokteran EGCPrescott, Harley, Klein’s. 2008. Microbiology 7th edition. Boston : Published by McGraw-Hill

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap kultur padat Lactobacillus acidophillus dan Streptococcus thermophilus dengan perbesaran 100x, diperoleh hasil sebagai berikut :

Ilustrasi 1. Struktur Lactobacillus acidophillus

Bentuk : bacillus (batang)Koloni : berkelompokWarna : biru gelapGram : positif

Bentuk : bacillus (batang)Koloni : berkelompokWarna : biru keunguanGram : positifSumber : Data Primer Praktikum Sumber : sitemaker.umich.eduMikrobiologi, 2011.

Berdasarkan pewarnaan Gram pada Lactobacillus acidophillus, diperoleh hasil : bentuk bakteri basil (batang), koloninya berkelompok dengan jumlah koloni 20, warna biru gelap. Warna biru gelap pada dinding sel Lactobacillus acidophillus menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif, hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan Sacher dan McPherson (2004) yaitu bakteri gram positif terwarnai ungu atau biru gelap memiliki dinding sel yang tebal. Bentuk basil pada bakteri Lactobacillus acidophillus panjang dan ramping serta ada pula yang tidak panjang dan ramping, hal ini sesuai dengan pendapat Pelczsar dan Chan (1986) yang menyatakan bahwa ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus.

Ilustrasi 2. Struktur Streptococcus thermophilus

Bentuk : coccus (bulat)Koloni : berkelompokWarna : biru gelapGram : positif

Bentuk : coccus (bulat)Koloni : berkelompokWarna : biru gelapGram : positifSumber : Data Primer Praktikum Sumber : picazilla.co.ccMikrobiologi, 2011.

Berdasarkan pewarnaan Gram pada Streptococcus thermophilus, diperoleh hasil : bentuk bakteri coccus (bulat), jumlah koloni TBUD dan warna dinding selnya biru gelap. Hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Pada hasil pengamatan, bakteri Streptococcus thermophilus tampak bulat dan tidak menggerombol, hal ini menunjukkan bahwa bentuknya berpasangan (diplokokus). Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Pelczsar dan Chan (1986) yaitu kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan.

DAFTAR PUSTAKA

Brooks, G. F., Janet, S. B., dan Stephen A. M. 2001. Mikrobiologi Kedokteran Penerbit Salemba Medika, Jakarta.

Campbell, N.A., J. B. Reece, dan L. G. Mitchell. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi Kelima. Erlangga, Jakarta.

Darmadi. 2008. Infeksi Nosokomial. Penerbit Salemba Medika, Jakarta.

Elrod, S. L. dan W. D. Stansfield. 2006. Genetika Edisi Keempat. Erlangga, Jakarta.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Penerbit IPB, Bogor.

Fardias, S. 1993. Analisis Mikrobiologi. PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Harmita dan Radji, M. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi 3. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Pelczsar, M. J. dan Chan ESC. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. UI-Press, Jakarta.

Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara, Jakarta.

Sacher, R. A. dan R. A. McPherson. 2004. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Schlegel, H. G. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Suriawiria, U. 1993. Mikrobiologi Air. Penerbit Alumni, Bandung.

Suwahyono, U. 2009. Biopestisida. Penebar Swadaya, Jakarta.

www.sitemaker.umich.edu

www.picazilla.co.cc

Yuwono, T. 2008. Boiologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.

DAFTAR PUSTAKAFardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan GiziIPB. BogorFardiaz, S. 1992. Mikrobiologi pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.Frazier, W. C. and D. C. Westhoff. 1978. Food Microbiology. 3thedition. Tata McGraw-Hill New Delhi.Halferich,W. dan D.C. Westhoff. 1980. All About Yogurt. Prentice Hall. Inc NewYorkPelczar, Michael J. Dan E. C. S. Chan. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. PenerbitUniversitas Indonesia (UI-Press). Jakarta.Sumanti, Debby M. dkk. 2009. Diktat Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan.Jurusan Teknologi Industri Pangan Fakultas Teknologi Industri PertanianUniversitas PasjadjaranRobert Wayne Hutkins. 2006. Microbiology and Technology of Fermented Foods.Wiley-Blackwell.Anonima. 2011. Gambar Lactobascillus bulgaricus.http://www.novinite.com/media/images/2004-04/33678.jpg diakses tanggal 4Maret 2011Anonimb. 2011. Gambar Lactobacillus acidophilus. http://www.museeafrappier.qc.ca/images/site/large/lactobacillus-acidophilus02-milos-kalab.jpgdiakses tanggal 4 Maret 2011Anonimc. 2011. Gambar Streptococcus thermophilus.http://www.buyprobiotics.com/Miva_Graphics/Micro6.jpg diakses tanggal 4Maret 2011Anonimd. 2011. Gambar Bifidobacterium bifidum.http://www.sciencephoto.com/images/download_wm_image.html/B2201561-Bifidobacterium_bifidum-SPL.jpg?id=662201561 diakses tanggal 4 Maret2011Anonime. 2011. Gambar Saccharomyces cereviceae.

http://www.deanza.edu/faculty/mccauley/6a_site_images/fungiimages/saccharomyces-400.jpg diakses pada 5 Maret 2011

Jenis Lactobacillus dapat dibedakan atas dua kelompok, yaitu:1. Bersifat homofermentatifBakteri homofermentatif memecah gula menjadi asam laktat dan dapattumbuh pada suhu 370C atau lebih. Spesies yang tergolonghomofermentatif misalnya:a. Lactobacillus bulgaricusb. Lactobacillus lactisc. Lactobacillus acidophilusd. Lactobacillus thermophiluse. Lactobacillus delbrueckii2. Bersifat heterofermentatifBakteri heterofermentatif memecah gula menjadi asam laktat danproduk-produk lain seperti alkohol, asetat dan karbondioksida. Spesiesyang tergolong heterofermentatif misalnya Lactobacillus fermentatumdan Lactobacillus brevis. (Fardiaz, 1992).

Bakteri yang diamati pada praktikum ini selain bakteri Lactobascillusbulgaricus adalah bakteri Lactobacillus acidophilus, Streptococcusthermophilus dan Bifidobacterium bifidum.Bakteri Lactobacillus acidophilus merupakan bakteri gram positifkarena setelah diberi pewarnaan gram dan diamati di bawah mikroskopbakteri ini berwarna ungu kebiruan, berbentuk basil atau batang, bersifatnon motil, dan nonspora yang memproduksi asam laktat sebagai produkutama dari metabolisme fermentasi dan menggunakan laktosa sebagaisumber karbon utama dalam memproduksi energi. Lactobacillusacidophilus dapat tumbuh baik dengan oksigen ataupun tanpa oksigen, danbakteri ini dapat hidup pada lingkungan yang sangat asam sekalipun, sepertipada pH 4-5 atau dibawahnya dan bakteri ini merupakan bakterihomofermentatif yaitu bakteri yang memproduksi asam laktat sebagai satusatunyaproduk akhir.Gambar 3. Bakteri Lactobacillus acidophilus (sampel A).Perbesaran 160/0,17Sedangkan gambar bakteri Lactobacillus acidophilus berdasarkanliteratur adalah sebagi berikut:Gambar 4. Bakteri Lactobacillus acidophilus (musee-afrappier,2011)Antara gambar yang diperoleh berdasarkan hasil di bawah mikroskoptidak terjadi perbedaan. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri yang diamatibenar-benar merupakan bakteri Lactobacillus acidophilus.Nova Nurfauziawati240210100003Kelompok 1A

Sampel lain yang digunakan dalam praktikum ini adalah sampel Dyang merupakan bakteri Streptococcus thermophilus. Bakteri jenis inimemiliki bentuk kokus atau bulat, bergerombol dan merupakan bakterigram positif. Namun, pada praktikum kali ini, praktikan menemukan bahwabakteri ini merupakan bakteri gram negatif. Kesalahan ini mungkindisebabkan karena perlakuan fiksasi yang terlalu lama ataupun karena agaryang tidak sengaja terambil pada saat pengambilan sampel. Selain itu, jugabisa disebabkan karena terkotaminasi. Kemungkinan lain yang dapatmenyebabkan kesalahan ini adalah kotornya lensa pada mikroskop yangdigunakan untuk mengamati bakteri tersebut.Berikut ini merupakan bakteri Streptococcus thermophilusGambar 5. Streptococcus thermophilus (sampel D)Perbesaran 16 x 40Sedangkan gambar berdasarkan literatur adalah sebagai berikut:Gambar 6. Streptococcus thermophilus (buyprobiotics, 2011)Streptococcus memiliki karakteristik berbentuk bulat, hidupberpasangan dengan rantai pendek atau panjang yang tergantung padaspesies dan kondisi pertumbuhannya, dan semuanya bersifathomofermentatif (Frazier dan Westhoff, 1978, Pelczar dan Chan, 1988).Streptococcus memiliki diameter yang kurang dari 2μm,membutuhkan kondisi nutrisi yang kompleks dengan suhu pertumbuhanNova Nurfauziawati240210100003Kelompok 1Aoptimum sekitar 370C (Pelczar dan Chan, 1988). Beberapa spesies bersifatproteolitik dan biasanya bersifat lipolitik (Fardiaz, 1989).Streptococcus thermophilus merupakan spesies yang tergolong grupviridan, penting dalam pembuatan keju (Frazier dan Westhoff, 1978), dapattumbuh pada suhu 450C dan masih tahan dengan perlakuan suhu 600Cselama 30 menit (Fardiaz, 1989). Secara morfologis, Streptococcusthermophilus berbentuk bulat, sering hidup dalam bentuk rantai, bersifattermofilik dengan pH optimum untuk pertumbuhannya sekitar 6,6 – 6,8(Helferich dan Westhoff, 1980).Sesuai dengan namanya, bakteri Streptococcus thermophilus bersifattermofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh dalam suhu yang relatif tinggidengan suhu minimum 250C, suhu optimum 44-550C dan maksimum 55-650C.Sampel terakhir yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu sampelB dengan nama bakteri Bifidobacterium bifidum. Beberapa karakteristik daribakteri Bifidobacterium ini adalah gram-positif, anaerobik, non-motil (tidakbergerak), tidak membentuk spora, berbentuk batang, dan memiliki persenG+C (guanosin-sitosin) yang tinggi (55-67%). Sel umumnya terlihatberpasangan membentuk huruf V atau Y.[ Suhu optimal untuk pertumbuhan

Bifidobacterium adalah 37-41 °C dan pH optimum antara 6,5-7. Dari 30spesies Bifidobacterium yang ditemukan, beberapa di antaranya digunakansebagai probiotik, yaitu Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis,Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacteriumbreve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, danBifidobacterium thermophilum. Bakteri ini telah digunakan secara komersialsebagai probiotik dalam pembuatan yogurt dan produk olah susu lainnya.Pada praktikum kali ini, setelah pengamatan di bawah mikroskop,praktikan menemukan bahwa bakteri Bifidobacterium bifidum ini berbentukcoccus, padahal seharusnya bakteri jenis ini berbentuk basil. Kesalahan inimungkin disebabkan karena perlakuan fiksasi yang terlalu lama ataupunkarena agar yang tidak sengaja terambil pada saat pengambilan sampel.Selain itu, juga bisa disebabkan karena terkotaminasi. Kemungkinan lainNova Nurfauziawati240210100003Kelompok 1Ayang dapat menyebabkan kesalahan ini adalah kotornya lensa padamikroskop yang digunakan untuk mengamati bakteri tersebut.Berikut ini merupakan bakteri Bifidobacterium bifidumGambar 7. Bifidobacterium bifidum (sampel B)Perbesaran 100 kaliBerdasarkan hasil pengamatan Bifidobacterium bifidum berbentukcoccus, padahal seharusnya berbentuk basil sesuai dengan gambarberdasarkan literatur sebagai berikut:Gambar 8. Bifidobacterium bifidum (sciencephoto, 2011)Bifidobacterium bifidum adalah organisme probiotik sangat pentingyang ditemukan dalam jumlah besar di usus dan mukosa vagina.Bifidobacterium bifidum mencegah perkembangbiakan E. coli, Salmonelladan Clostridium. Bakteri ini juga memproduksi asam laktat dan asam asetatyang menurunkan pH usus dan mencegah pertumbuhan bakteri jahat.Penelitian lain pada Bifidobacterium menunjukkan bahwa organisme inijuga merangsang penyerapan mineral seperti besi, kalsium, magnesium, danseng.

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain tidak berwarna, bakteri itu juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itulah pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Adapun macam-macam pewarnaan, antara lain :1. Pewarnaan SederhanaPewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini

dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin.2. Pewarnaan GramPewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.3. Pewarnaan KapsulPewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel.4. Pewarnaan SporaPewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis. Teknik- teknik pewarnaan secara umum, antara lain :A. Pewarnaan SederhanaPewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai, gerombol, berpasangan, dan tetrad).B. Pewarnaan diferensialPewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan pewarna inti.V. CARA KERJAA. Pewarnaan Sederhana1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;8. Mendiamkannya selama 1 menit;9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;10. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering;11. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;

12. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati,13. Mengamati slide tersebut.B. Pewarnaan Gram1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;8. Mendiamkannya selama 1 menit;9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;10. Meneteskan iodine hingga menutupi permukaan bakteri kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 1-2 menit;11. Membilas biakan tadi dengan air akuades;12. Meneteskan alkohol 95% ke atas bakteri kemudian mendiamkannya selama 30 detik;13. Membilasnya dengan air akuades;14. Meneteskan safranin ke atas bakteri dan mendiamkannya selam kurang lebih 1 menit, kemudian membilasnya dngan air akuades;15. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering;16. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;17. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati,18. Mengamati slide tersebut.C. Pewarnaan Spora 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;7. Setelah tampak keputih-putihan pada objek glass tersebut, kemudian merendam dengan malachit green selama 10 menit;

8. Melewatkan objek glass tersebut di atas api bunsen dengan tidak terlalu sering, dan jika pewrana sudah kering, perlu ditambhkan lagi pewarna tersebut (diusahakan selama 10 menit tersebut malachit green tidak kering);9. Setelah 10 menit, mencuci objek glass dengan akuades hingga warna hilang;10. Mengeringkan sisa pencucian tado dengan tisue kering;11. Merendam dengan safranin selama 1 menit;12. Mencuci kembali dengan akuades;13. Mengeringkan slide dengan dilewatkan pada api bunsen;14. Menutup dengan cover glass;15. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati;16. Mengamati slide tersebut.VI. HASIL PENGAMATANNo Bakteri Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan spora1 Bacillus subtilis Strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), susunan bekterinya berantai. Termasuk gram positif. Memiliki endospora.2 Staphylococcus aureus Berbentuk coccus, susunan bakterinya bergerombol seperti buah anggur. Termasuk gram positif. 3 Pseudomonas putida Berbentuk batang pendek (cocoid), susunan bakterinya tunggal. Termasuk gram negatif.

VII. PEMBAHASANa. Pewarnaan Sederhana1. Pewarnaan Sederhana pada Bacillus subtilisPada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus subtilis zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus subtilis yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai.2. Pewarnaan Sederhana pada Pseudomonas putidaPada pengecatan mikroba jenis Pseudomonas putida dilakukan pengecatan dengan menggunakan zat warna basa kristal violet. Pertama jarum inokulasi disterilkan lalu kemudian mulut tabung reaksi disterilkan juga di api bunsen, kemudian mikroba yang ada di tabung reaksi (media agar miring) diambil dan diletakkan di objek glass,

sebelumnya objek glass sudah diberi air sedikit. Kemudian setelah mikroba dan air dicampur, dilakukan metode smear yaitu meratakan mikroba kira-kira membentuk sebuah bentuk koin. Kemudian dilakukan fiksasi yaitu dengan melewatkan smear secara cepat di api bunsen, lalu dikering-anginkan. Setelah melakukan metode smear, selanjutnya adalah metode pengecatan. Objek glass yang sudah di titrasi diberi pewarna kristal violet (selama 60 detik). Kemudian diberi air aquades untuk membersihkan kelebihan warna. Sisa-sisa air yang ada di objek glass dibersihkan dengan tissue. Terakhir objek glass ditutup dengan cover glass, dan diletakkan di mikroskop cahaya untuk diamati dengan perbesaran 1000 X dengan catatan menggunakan minyak emersi setelah menemukan titik fokus perbesaran 40 X.3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureusKaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus aureus, kemudian dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak lapisan putih yang tipis, semitransparan, dan rata yang menunjukkan adanya bakteri. Setelah smear difiksasi, smear kemudian diberi pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam pemberian metilen blue ini, diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear. Pewarnaan dengan menggunakan metilen biru dibutuhkan waktu 2-60 detik, setelah itu dicuci dengan aquades. Dari sini akan nampak lapisan yang sebelumnya berwarna putih tipis dan semitransparan, akan berubah warna menjadi biru transparan. Selanjutnya adalah milangkan sisa aquades dengan menggunakan kertas tissue. Setelah itu dilihat dalam mikroskop dengan perbesaran 1000 X. dalam mikroskop akan nampak bakteri Stapylococcus aereus berwarna biru matang dan bentuk bulat berantai.B. Pewarnaan Gram1. Pewarnaan gram pada Bacillus subtilisPada pewarnaan ini digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama (mordant), alcohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil(batang) dan merupakan bakteri gram positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa pada Bacillus subtilis memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang.Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol. 2. Pewarnaan Gram pada Pseudomonas putida Pada pengamatan genus Pseudomonas dengan menggunakan pewarnaan gram, kami menggunakan bakteri Pseudomonas putida sebagai contoh yang mewakili. Sebelum mewarnai perlu difiksasi di atas api bunsen, pertama kali, koloni bakteri disuspensikan

secara tipis di atas akuades. Smear yang tipis memberikan hasil pada gelas objek dan dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna. Kompleks UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri Pseudomonas yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan dapat masuk apabila pewarna utamanya telah keluar dari sel bakteri. Bakteri pseudomonas dapat terwarnai merah. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki karateristik mikroskopik sebagai berikut yang diamati di bawah mikroskop cahaya yaitu :• Gram-negatif; • Berbentuk kokoid (batang pendek);• Tidak membentuk spora. 3. Pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri negatif dan bakteri positif. Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Staphylococcus aureus yang termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang berwarna biru terang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 – 1,0 µm. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37º dengan waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri dari fagositosis host, selain itu bakteri tersebut merupakan bakteri patogen.Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut: 1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol

yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. 2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.C. Pewarnaan Spora 1. Pewarnaan Spora pada Bacillus subtilisEndosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Bacillus subtilis memiliki endospora, endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian.VIII. KESIMPULANBerdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan pengecatan gram, pengecatan sederhana, dan pengecatan spora.2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna.3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.4. Pengecatan spora dilakukan dengan memberi warna pada endospora suatu bakteri. Zat pewarna yang digunakan pertama adalah malachit green. Pengecatan spora digunakan untuk mengetahui spora dengan sel vegatatifnya. 5. Pada preparasi smear, ketebalan smear sangat penting dalam pengamatan di mikroskop. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis. 6.Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-anginkan dua-tiga kali pada api bunsen.

7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna merah pada pewarnaan safranin.

IX. DAFTAR PUSTAKAAnonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:09.Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) diakses pada 29 Oktober 2010 13:28.Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29.Nurodin, Ade., 2009. http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparat-bakteri-pewarnaan.html diakses pada 29 Oktober 2010 13:17.Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Stanier Roger, Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia Mikroba 1. Jakarta: Bharata Karya Aksara.