Laporan Pewarnaan Gram

17
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN DIFERENSIAL Senin, 3 Maret 2015 Kelompok IV Senin, Pukul 13.00 – 16.00 WIB Nama NPM Raissa Dwi A. 260110130155 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015 Nilai TTD (Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

description

pewarnaan gram adalah

Transcript of Laporan Pewarnaan Gram

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN DIFERENSIAL

Senin, 3 Maret 2015Kelompok IVSenin, Pukul 13.00 16.00 WIB

NamaNPMRaissa Dwi A.260110130155

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS PADJADJARANNilaiTTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

2015

PEWARNAAN GRAM

1. TujuanMengamati dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.2. Prinsip1) Teknik AseptisTeknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.

2) Pewarnaan DiferensialPewarnaan Diferensial adalah teknik pewarnaan yang dilakukan untuk mengetahui perebedaan antara sel-sel dari tiap-tiap mikroba. Pewarnaan diferensial menggunakan dua pewarna atau lebih.

3) Ikatan IonPewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

4) AbsorpsiAbsorpsi atau penyerapan, dalam kimia, adalah suatu fenomena fisik atau kimiawi atau suatu proses sewaktu atom, molekul, atau ion memasuki suatu fase limbak (bulk) lain yang bisa berupa gas, cairan, ataupun padatan.

3. Teori DasarMikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003).Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Lestari, Rina, 2013).Pewarnaan gram ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel, yaitu:a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010). Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin/fuchsin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009). Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.(Lestari, Rina, 2013).

Faktor-faktor lain yang dapat, menimbulkan keragaman pada reaksi Gram ialah :1) Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesanOlesan bakteri yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan pecahnya dinding sel. Akibatnya sel Gram positif akan melepaskan pewarna primer dan menerima pewarna landingan.2) Kerapatan sel pada olesan.Olesan yangterlalu tebal akan memucat lebih lama dari olesan dengankerapatan sel normal.3) Konsentrasi dan umur reagen yang digunakan.4) Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai.Sebagai pemucat, alkohol 95% bekrja paling lambat dan aseton paling cepat.Umumnya digunakan campuran alkohol 95% dan aseton (l : 1).5) Sejarah biakan.Sejarah biakan meliputi umur biakan serta pH medium tempat bakteri tumbuh. Umumnya reaksi Gram menggunakan biakan berumur 18-24 jam. Biakan Gram positif yang lebih tua (terutama bila sudah autolisis) dalam medium asam, seringkali memberikan reaksi Gram positif atau Gram variabel (campuran Gram positif dan Gram negatif). Hal tersebut diakibatkan perubahan permeabilitas dinding sel pada biakan tua. Tetapi bakteri Gram negatif tidak terpengaruh oleh umur atau medium yang digunakan. Jangan dipersoalkan teramatinya beberapa sel Gram negatif dalam suatu preparat sel Gram positif(Sulistianingsih. Milanda, Tiana, dkk.,2015).4. Alat dan Bahan

4.1. Alat Bak pewarna Cawan petri Kaca obyek Kapas Kertas saring Mikroskop Ose

Pembakar spirtus Tabung Reaksi

4.2. Bahan Alkohol Aquadest Fuchsin Karbol gentian violet Lugol Metilen blue Minyak emersi Suspensi Bakteri

4.3. Gambar Alat

Cawan petri kaca obyek kapas kertas saring

Mikroskop ose pembakar spiritus Tabung Reaksi

5. ProsedurPertama, kaca obyek dibersihkan dengan alkohol lalu suspensi bakteri dioleskan dengan ose pada bagian yang telah ditandai pada kaca obyek. Kaca obyek difiksasi diatas spiritus. kaca obyek diletakkan di atas bak pewarna. Kemudian, olesan bakteri dengan digenangi pewarna karbol gentian violet (pewarna primer) selama 1 menit, lalu zat warna yang berlebih dibuang, dibilas dengan air suling. Kedua, olesan digenangi dengan lugol selama 2 menit, lugol dibuang yang berlebih lalu dibilas dengan air suling. Olessan dicuci dengan pemucat alkohol 95% sebanyak satu tetes, lalu dibilas dengan air suling. Terakhir, olesan digenangi dengan pewarna tandingan fuksin (sekunder) selama 30 detik, warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling lalu dikeringkan dengan kertas saring. Kemudian, teleskan sedikit minyak emersi pada preparat. Preparat dikeringkan dengan kertas saring, lalu minyak emersi dituangkan untuk melihat preparat dengan mikroskop. Hasil diamati dan digambar.6. Hasil Pengamatan

7. PembahasanPada praktikum kali ini, dilakukan pewarnaan differensial, yaitu pewarnaan gram. Pewarnaan gram dilakukan untuk mengamati kelompok bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Kelompok bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran selPertama, dilakukan pembuatan olesan bakteri dengan sampel suspensi. Kaca obyek harus disterilisasi dengan alkohol hingga bersih serta bebas lemak agar tidak ada kontaminan yang menggangu hasil pewarnaan. Suspensi bakteri yang berada dalam tabung reaksi dikocok terlebih dahulu agar bakteri yang ada di dalamnnya merata, lalu dioleskan secara merata menggunakan ose ke daerah yang telah ditandai pada kaca obyek. Saat pengambilan sampel, ose harus disterilisasi dengan cara dibakar hingga berpijar kemudian ditunggu hingga dingin di dekat api. Begitu juga daerah atas tabung reaksi sebelum dan sesudah ditutup harus difiksasi agar tidak terjadi kontaminasi ke dalam sampel. Kaca Obyek difiksasi dengan dilewatkan diatas pembakar spiritus untuk melekatkan bakteri dengan kaca obyek.Kedua, proses pewarnaan gram dapat dimulai. Kaca obyek digenangi dengan karbol gentian violet diatas bak pewarna dan ditunggu selama satu menit agar pewarna dapat meresap dan melekat sempurna pada dinding sel. Karbol gentian violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Reagen ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberikan warna pada bakteri target. Karbol gentian violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Setelah itu, pewarna yang berlebih dibuang ke dalam bak pewarna. Kaca obyek dibilas dengan aquadest secara perlahan-lahan agar daerah olesan bakteri tidak ikut tercuci. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Kemudian, kaca obyek digenangi dengan lugol dan ditunggu selama dua menit. Lugolmerupakan Zat pemantek (mordant), yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Zat tersebut berfungsi untuk menambah gaya gabung, dimana hasil reaksi antara sel dan zat warna diendapkan oleh pemantek menjadi presipitat berbulir-bulir besar sehingga tidak mungkin keluar melalui pori-pori dinding sel dan memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Lugolyang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Pewarna yang berlebih dibuang ke dalam bak pewarna. Kaca obyek dibilas dengan aquadest secara perlahan-lahan. Selanjutnya, alkohol 95% diteteskan di ataskaca obyek tersebut kemudian didiamkan selama 10-30 detik. Setelah itu,kaca objekdibilas denganairhingga warnanya hilang. Alkohol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Kaca obyek kembali dibilas lagi dengan aquadest. Selanjutnya kaca obyek digenangi oleh pewarna sekunder (tandingan), yaitu fuchsin selama 30 detik. Pewarna ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Pewarna fuchsin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah (pink) pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pewarna fuchsin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Kemudian, kaca obyek dibilas dengan aquadest dan dikeringkan dengan kertas saring. Penggunaan kertas saring juga harus secara perlahan-lahan agar daerah olesan bakteri tidak hilang terkikis oleh kertas saring. Lalu, ditetesi minyak emersi agar objek yang diamati dapat terlihat lebih jelas. Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air atau udara sehingga objek yang diamati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak imersi.Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.Dari hasil pengamatan, didapatkan dua kelompok, yaitu bakteri gram positif yang berbentuk bulat yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur, staphylococcus aureus dan gram negatif yang berbentuk batang, escherichia coli. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Bakteri gram positif menghasilkan warna ungu. Bakteri ini akan mempertahankan pewarna primernya karena pewarna tersebut akan terjerap ke dalam dinding sel dengan peptidoglikan yang tebal. Kompleks zatlugolterperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. Dinding sel yang tebal pada bakteri Gram positif akan menyusut oleh pembilasan alkohol (terdehidrasi), sehingga pori-pori dinding sel menutup dan mencegah larutnya kompleks pewarna primer pada saat pemucatan. Sedangkan, bakteri gram negatif tidak dapat mempertahankan pewarna primernya sehingga akan menghasilkan warna dari pewarna tandingannya, yaitu merah (pink). Dinding sel Gram negatif mengandung banyak lipid, yang pada umumnya larut dalam alkohol. Larutnya lipid akan memperbesar pori-pori dinding sel dan menyebabkan proses pemucatan berlangsung lebih cepat sehingga pewarna primer tidak terjerap ke dalam sel dan tercuci oleh alkohol.Beberapa faktor kesalahan pada praktikum yang menyebabkan sulitnya mengamati preparat olesan bakteri dengan mikroskop antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak tampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air.8. KesimpulanDapat dipahami proses pewarnaan gram dan diamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri gram positif yang berbentuk bulat yang berkoloni berbentuk seperti buah anggur dan berwarna ungu adalah staphylococcus aureus dan gram negatif yang berbentuk batang dan berwarna merah (pink) adalah escherichia coli.

Daftar PustakaAditya.2010. TeknikPewarnaanBakteri. Tersedia online di http://mushoffaditya.co.id/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html (diakses 7 Maret 2015).Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan. Bandung: Citra Aditya BaktiFitria. 2009. Fitria, Bayu. 2009.Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif). Tersedia inline di http://biobakteri.co.id/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif (diakses 7 Maret 2015).Lestari, Rina.2013. Pewarnaan Sederhana, Negatif, Kapsul dan Gram, tersedia online di http://rinayarina.pun.bz/files/mikrobiologi-pewarnaan.pdf (diakses 7 Maret 2015).

Sulistianingsih. Milanda, Tiana, dkk.2015. PENUNTUN PRAKTIKUMMIKROBIOLOGI DASAR. Jatinangor: Fakultas Farmasi UNPAD