LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SEDERHANA

Senin, 3 Maret 2015

Kelompok I

Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama NPM

Prasetyo Dwi A.P. 260110130135

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuel) (Puspagita)

I. TUJUAN

Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari

bakteri, dengan menggunakan satu macam zat pewarna.

II. PRINSIP

1. Teknik aseptis

Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin

preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Tekink aseptis

digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan,

lingkungan sekitar, maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat

diterapkan metode sterilisasi.

2. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yanng digunakan

hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut

yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat mrfologi

bakteri secara umum

3. Ikatan ion

Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara

komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari

pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena

adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada

pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan

pewarna asam dan pewarna basa.

III. TEORI DASAR

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan

karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Salah satu

cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk

diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal

tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu

mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

(Waluyo, 2007)

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,

karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat

kecil. Unutk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik

pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah

diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan

salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan

baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak

langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah

untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun

fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur

dalam jasad.

4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga

sifat-sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. (Suriawiria,

1999)

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana

(simple stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan

pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi, 2008).

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna

untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya.

Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan

ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada

mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus),

batang (basil), dan spiral. (Lay, 1994).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan

sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)

sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana

umumnya bersifat alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan

positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu

fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi, pewarnaan dan

penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang sudah menyerap zat

warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus.

Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.

Bakteri-bakteri ini disebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri

khas bagi suatu spesies. (Dwidjoeseputro, 1998)

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesiemen mikroba untuk

pemeriksaan mikroskopis adalah :

Penempatan olesan atau lapisan spesiemen pada kaca objek.

Fiksasi olesan pada kaca objek

Aplikasi pewarnaan tunggal (pewarnaan sederhana) atau

serangkain larutan pewarna atau reagen. (Pelczar,1986)

IV. ALAT DAN BAHAN

a. Alat

1. Bak pewarna

2. Cawan petri

3. Kaca obyek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Ose

7. Pembakar spirtus

8. Mikroskop cahaya

b. Bahan

1. Alkohol 70%

2. Aquadest

3. Minyak emersi

4. Sampel air liur

5. Zat warna biru metilen

6. Zat warna karbol gentian violet (CGV)

c. Gambar Alat

1. Bak pewarna

2. Cawan petri

3. Kaca objek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Ose

7. Pembakar spirtus

8. Mikroskop cahaya

V. PROSEDUR

Pertama, kaca objek dibersihkan menggunakan alkohol 70%

hingga tidak terdapat lemak di kaca objek. Kemudian sampel dari air

liur dioleskan di atas kaca objek yang telah dibersihkan. Selanjutnya

sampel yang telah dioleskan di atas kaca objek difiksasi di atas api.

Setelah dingin, preparat diteteskan oleh zat pewarna CGV di atas bak

warna dan didiamkan selama 15-30 detik. Selanjutnya zat pewarna

CGV yang berlebih dituangkan dari preparat lalu dibilas dengan

aquadest sampai bersih dari zat pewarna. Setelah itu, preparat

dikeringkan oleh kertas saring dan diteteskan minyak emersi.

Kemudian preparat diamati dibawah mikroskop cahaya. Hasil

pengamatan digambar di buku gambar. Untuk pewarnaan

menggunakan metilen biru langkah yang dilakukan sama, hanya

berbeda saat pendiaman setelah penetesan zat warna. Untuk metilen

biru didiamkan selama 1-2 menit setelah diteteskan.

VI. HASIL PENGAMATAN

Zat

pewarna

Perbesaran Hasil pengamatan

CGV

40x

100x

Metilen

biru 40x

100x

VII. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan pengamatan pada bakteri dengan

menggunakan pewarnaan sederhana. Digunakan pewarnaan karena

pada umumnya bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil

sehingga sulit untuk diamati. Untuk membantu dalam pengamatan

bakteri maka digunakan pewarnaan bakteri oleh zat pewarna. Pada

pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk

meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya.

Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan

penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk

yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Hal pertama yang harus

dilakukan adalah penyiapan preparat. Pertama-tama kaca objek

dibersihkan menggunakan alkohol 70% sampai bersih. Hal ini

bertujuan agar tidak ada kandungan lemak yang tersisa di atas kaca

objek saat diamati nantinya. Selanjutnya adalah penyiapan preparat,

yaitu pengolesan sampel di atas kaca objek yang sudah ditandai

dengan spidol agar mempermudah daerah pengamatan bakteri

nantinya. Sebelum sampel dioleskan, ose yang nantinya akan

digunakan untuk mengambil sampel harus disterilkan terlebih dahulu

dengan cara difiksasi. Setelah ose dingin, sampel yang terdapat dalam

cawan petri tertutup diambil menggunakan ose untuk kemudian

dioleskan di atas kaca objek yang sudah dibersihkan. Proses ini

dilakukan di dekat pembakar spirtus agar sampel tidak terkontaminasi

mikroorganisme dari luar. Sampel diletakkan di dalam cawan petri

tertutup agar terhindar dari mikroorganisme yang terdapat dari udara

sekitar, agar bakteri yang diamati pada sampel tidak terkontaminasi

dari lingkungan luar. Setelah sampel dioleskan di atas kaca objek, kaca

objek difiksasi dengan cara melewatkan kaca objek di atas pembakar

spirtus. Hal ini bertujuan agar sampel bisa melekat pada kaca objek.

Saat fiksasi preparat kaca objek hanya dilewatkan sebentar saja, karena

jika terlalu lama bakteri yang ada pada sampel akan mati karena tidak

tahan panas. Selanjutnya preparat yang sudah diolesi sampel ditetesi

zat pewarna. Zat pewarna yang digunakan pada praktikum pewarnaan

sederhana kali ini ada dua, yaitu CGV dan metilen biru. Tiap zat

pewarna memiliki waktu untuk didiamkan yang berbeda ketika sudah

diteteskan di atas sampel. Untuk CGV, hanya didiamkan selama 15-30

detik, sedangkan untuk metilen biru didiamkan selama 1-2 menit.

Bakteri pada sampel akan bereaksi dengan zat pewarna karena

sitoplasma dari bakteri bersifat basofilik (suka terhadap basa),

sedangkan zat pewarna yang digunakan bersifat alkalin (komponen zat

warnanya bermuatan positif). Setelah didiamkan selama waktu yang

telah ditentukan, zat pewarna berlebih di atas preparat dibuang dan

kemudian preparat dibilas secara perlahan menggunakan aquadest.

Untuk menghilangkan sisa aquadest, digunakan kertas saring untuk

mengeringkan preparat yang akan diamati nantinya. Kemudian sampel

yang berada dalam daerah pengamatan di preparat ditetesi oleh minyak

emersi untuk kemudian diamati. Saat pengamatan akan didapatkan

bakteri-bakteri dalam bentuk coccus (bulat) dan batang yang berwarna

sesuai dengan zat pewarna yang diteteskan yaitu warna ungu untuk

pewarna CGV dan warna biru untuk pemarna metilen biru.

VIII. KESIMPULAN

1. Bentuk dan struktur bakteri dalam sampel dapat teramati dengan

menggunakan pewarnaan sederhana

2. Di dalam sampel teramati bakteri dengan bentuk bulat dan batang

IX. DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D,1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang:

Djambatan

Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali.

Pelczar & Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta :

Universitas Indonesia

Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN GRAM

Senin, 3 Maret 2015

Kelompok I

Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama NPM

Prasetyo Dwi A.P. 260110130135

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

I. TUJUAN

Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram

negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami

setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur

tersebut.

II. PRINSIP

1. Teknik aseptis

Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin

preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Tekink aseptis

digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan,

lingkungan sekitar, maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat

diterapkan metode sterilisasi.

2. Pewarnaan diferensial

Pewarnaan diferensial merupakan teknik pewarnaan yang

menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian sel-

sel mikroba. Teknik pewarnaan ini tidak hanya menggunakan satu

jenis zat pewarna, berbeda dengan pewarnaan sederhana yang

hanya menggunakan satu zat pewarna.

3. Ikatan ion

Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara

komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari

pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena

adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada

pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan

pewarna asam dan pewarna basa.

4. Absorpsi

Absorpsi adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran gas

dengan cara pengikatan bahan tersebut pada permukaan absorben

cair yang diikuti dengan pelarutan.

III. TEORI DASAR

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,

karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat

kecil. Unutk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik

pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah

diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan

salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).

Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik

pewarnaan yang paling penting dan luas di gunakan untuk

mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah

terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet,

larutan yodium, larutan akohol(bahan pemucat) dan zat pewarnaan

tandinganya berupa zat warna safranin atau air fucshin. Metode ini di

beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian

Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884

untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela,

pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini dibagi

menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram

negatif. Bakteri garam positif akan memprtahankan zat pewarna kristal

violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah

mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna

Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat

pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau safranin

akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh

perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar, 2007).

Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat

warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini

akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop sedangkan bakteri

gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan

klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama berdasarkan pada

perbedaan struktur dinding sel bakteri .Bakteri gram negatif adalah

bakteri yang tidak mempertahankan zat metal ungu pada metode

pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan mempertaahankan warna

ungu gelap setelah di cuci dengan alkohol. Sementara bakteri gram-

negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu pewarnaan penimbal

(conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua

bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.

Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini

perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies organisme inang,

sifat pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada

dinding sel gram-negatif terutama lapisan lipopolisakarida. (Pelczar,

2007)

IV. ALAT DAN BAHAN

d. Alat

9. Bak pewarna

10. Cawan petri

11. Kaca obyek

12. Kapas

13. Kertas saring

14. Ose

15. Pembakar spirtus

16. Mikroskop cahaya

e. Bahan

7. Alkohol 70%

8. Aquadest

9. Lugol

10. Minyak emersi

11. Pemucat alkohol 95%

12. Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus

13. Zat warna karbol fuchsin

14. Zat warna karbol gentian violet (CGV)

f. Gambar Alat

1. Bak pewarna

2. Cawan petri

3. Kaca objek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Ose

7. Pembakar spirtus

8. Mikroskop cahaya

V. PROSEDUR

Pertama, kaca objek dibersihkan menggunakan alkohol 70%

hingga tidak terdapat lemak di kaca objek. Kemudian sampel dari

suspensi dioleskan di atas kaca objek yang telah dibersihkan.

Selanjutnya sampel yang telah dioleskan di atas kaca objek difiksasi di

atas api. Setelah dingin, preparat diteteskan oleh zat pewarna CGV di

atas bak warna dan didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya zat

pewarna CGV yang berlebih dituangkan dari preparat lalu dibilas

dengan aquadest sampai bersih dari zat pewarna. Setelah itu, preparat

diteteskan oleh lugol dan didiamkan selama 2 menit. Lugol yang

berlebih kemudian dibuang dan preparat dibilas menggunakan

aquadest. Setelah itu preparat ditetesi oleh larutan pemucat alkohol

tetes demi tetes secara singkat dan kemudian dibilas lagi menggunakan

aquadest. Kemudian preparat ditetesi karbol fuhsin dan didiamkan

selama 30 detik, kemudian karbol fuhsin yang berlebih dibuang dan

preparat dibilas menggunakan aquadest. Selanjutnya preparat

dikeringkan menggunakan kertas saring dan setelah kering ditetesi

oleh minyak emersi untuk kemudian diamati.

VI. HASIL PENGAMATAN

Perbesaran Hasil pengamatan

40x

VII. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan pengamatan pada bakteri dengan

menggunakan pewarnaan gram. Hal pertama yang harus dilakukan

adalah penyiapan preparat. Pertama-tama kaca objek dibersihkan

menggunakan alkohol 70% sampai bersih. Hal ini bertujuan agar tidak

ada kandungan lemak yang tersisa di atas kaca objek saat diamati

nantinya. Selanjutnya adalah penyiapan preparat, yaitu pengolesan

sampel di atas kaca objek yang sudah ditandai dengan spidol agar

mempermudah daerah pengamatan bakteri nantinya. Sebelum sampel

dioleskan, ose yang nantinya akan digunakan untuk mengambil sampel

harus disterilkan terlebih dahulu dengan cara difiksasi. Setelah ose

dingin, sampel yang terdapat dalam tabung reaksi tertutup diambil

menggunakan ose untuk kemudian dioleskan di atas kaca objek yang

sudah dibersihkan. Proses ini dilakukan di dekat nyala api agar sampel

tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme dari luar. Sampel diletakkan

di dalam tabung reaksi tertutup karena sampel bersifat likuid dan juga

agar terhindar dari mikroorganisme yang terdapat dari udara sekitar,

agar bakteri yang diamati pada sampel tidak terkontaminasi dari

lingkungan luar. Setelah sampel dioleskan di atas kaca objek, kaca

objek difiksasi dengan cara melewatkan kaca objek di atas pembakar

spirtus. Hal ini bertujuan agar sampel bisa melekat pada kaca objek.

Saat fiksasi preparat kaca objek hanya dilewatkan sebentar saja, karena

jika terlalu lama bakteri yang ada pada sampel akan mati karena tidak

tahan panas. Selanjutnya preparat yang sudah diolesi sampel ditetesi

zat pewarna. Zat pewarna yang pertama digunakan adalah CGV,

preparat ditetesi oleh CGV. Setelah itu preparat dibilas menggunakan

aquadest dan ditetesi oleh lugol dan didiamkan selama 2 menit. Setelah

itu lugol dibilas menggunakan aquadest dan preparat diteteskan larutan

pemucat alkohol secara sekilas. Kemudian preparat dibillas aquadest

dan diteteskan karbol fuchsin dan didiamkan selama 30 detik untuk

kemudian dibilas menggunakan aquadest. Bakteri pada sampel akan

bereaksi dengan zat pewarna karena sitoplasma dari bakteri bersifat

basofilik (suka terhadap basa), sedangkan zat pewarna yang digunakan

bersifat alkalin (komponen zat warnanya bermuatan positif). Untuk

menghilangkan sisa aquadest, digunakan kertas saring untuk

mengeringkan preparat yang akan diamati nantinya. Kemudian sampel

yang berada dalam daerah pengamatan di preparat ditetesi oleh minyak

emersi untuk kemudian diamati. Saat pengamatan akan didapatkan

bakteri Staphylococcus aureus berbentuk coccus yang berwarna ungu

dan juga Eschericia coli berbentuk batang yang berwarna merah muda.

Hal ini disebabkan karena Staphylococcus aureus merupakan bakteri

gram positif dimana lapisan peptidoglikan pada membrannya lebih

tebal dibandingkan lipid. Peptidoglikan akan mengikat zat warna yang

cocok dengan kepolarannya yaitu CGV. Sehingga saat dibilas alkohol,

CGV yang terikat pada peptidoglikan tidak akan terbawa alkohol. Hal

tersebut akan menyebabkan bakteri gram positif akan berwarna sama

dengan warna CGV yaitu ungu. Sedangkan Eschericia coli adalah

bakteri gram negatif, dimana kandungan lemak dalam membran

bakteri tersebut lebih banyak dibanding peptidoglikannya. Lemak

memiliki kepolaran yang berbeda dengan zat pewarna CGV sehingga

CGV tidak berikatan dengan bakteri melainkan hanya berada di

lapisan luar bakteri. Hal tersebut menyebabkan zat pewarna CGV akan

hilang terbawa ketika dibilas dengan alkohol. Lemak memiliki

kepolaran yang sama dengan karbol fuhsin yang menyebabkan

membran bakteri gram negatif akan berikatan dengan karbol fuhsin

secara kuat dan memberi warna pada bakteri saaat pengamatan (warna

merah muda).

VIII. KESIMPULAN

1. Bakteri gram positif dan gram negatif yang terdapat pada sampel

dapat teramati menggunakan pewarnaan gram

2. Bakteri gram positif yang teramati dalam sampel adalah

Staphylococcus aureus

3. Bakteri gram negatif yang teramati dalam sampel adalah

Eschericia coli

IX. DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta :

Djambatan.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.