Laporan Final 1

Fermentasi etanol dari agricultural by products oleh yeast Saccharomyces cerevisiae

Laporan Riset Ditri Satrio Pramudito, Rendi Standy 1

Bab I : Pendahuluan

Energi merupakan kebutuhan yang sangat penting dalam menunjang segala bentuk

aktivitas manusia selama ini. Mayoritas konsumsi energi di dunia berasal dari bahan bakar

fossil. Masalah yang terjadi saat ini adalah sumber bahan bakar fossil saat ini semakin sedikit,

keadaan seperti ini dapat menyebabkan terjadinya krisis energi di berbagai belahan dunia,

selain itu bahan bakar fossil juga menyebabkan emisi karbon di udara meningkat yang dapat

menyebabkan pemanasan global dan juga dapat mengganggu kesehatan manusia. Banyak

upaya yang sudah dilakukan untuk mengurangi penggunaan bahan bakar fossil segabai

sumber energi yang utama yaitu dengan membuat bahan bakar alternatif. Salah satu bahan

bakar alternatif yang saat ini sedang dikembangkan adalah bioetanol. Etanol adalah salah satu

bahan bakar alternatif yang dapat diperbaharui, ramah lingkungan, serta menghasilkan gas

emisi karbon yang lebih rendah jika dibandingkan dengan bensin atau sejenisnya (sampai

85% lebih rendah) [Daniel et al., 2012].

Pembuatan bioetanol memanfaatkan proses fermentasi dari glukosa menjadi alkohol

atau alkoholisasi. Dalam tahap pertama fermentasi glukosa selalu terbentuk asam piruvat

melalui proses glikolisis. Asam piruvat tersebut diubah menjadi alkohol melalui dua tahap.

Pertama, asam piruvat didekarboksilasi menjadi asetaldehid oleh enzim piruvat

dekarboksilasle (katalis) dengan melibatkan tiamin pirofosfat. Kedua, asetaldehid oleh enzim

alcohol dehydrogenase (katalis) direduksi dengan NADH2 menjadi alcohol.

Saccharomyces cerevisiae merupakan khamir yang biasa digunakan dalam proses

pembuatan bioetanol. Khamir Saccharomyces Cerevisiae sudah sejak lama digunakan dalam

pembuatan ethanol yang digunakan dalam minuman minuman beralkohol seperti wine dan

bir. Penggunaan Saccharomyces Cerevisiae dalam produksi etanol secara fermentasi telah

banyak dikembangkan di beberapa negara, seperti Brasil, Afrika Selatan, dan Amerika

Serikat [Narita, 2005]. Saccharomyces Cerevisiae ini lebih sering digunakan dalam proses

pembuatan etanol karena fisiologi dan morfologi nya yang sudah lebih dikenal dibandingkan

dengan khamir atau fungi lain yang dapat berfungsi sama.

Pada saat ini sebagian besar etanol dibuat dengan menggunakan fermentasi dari gula.

Etanol sebenarnya dibagi menjadi dua generasi yaitu 1st generation, dan 2nd genertaion. Pada

1st generation bahan baku utama yang digunakan adalah tanaman pangan seperti gula tebu,

sorghum, biji-bijian, dan lain-lain. Di Eropa, etanol dibuat secara komersial menggunakan

sereal gandum (50%), jelai (20%), dan sugarbeet (30%) [STS, 2005]. Namun proses ini

memiliki kendala tersendiri, pemanfaatan tumbuhan yang penting secara ekonomi seperti

jagung, gandum ,dan tebu memiliki banyak halangan karena persaingan dengan

penggunaannya sebagai sumber makanan manusia, yang mempengaruhi keberlangsungan

proses [Grey et al., 2006]. Sementara itu pada 2nd generation, bahan baku yang digunakan

adalah produk sampingan dari pengolahan 1st generation atau tumbuhan lain seperti bagasse,

jerami, serbuk gergaji, dan lain-lain. Ketersediaan dari bahan baku 2nd generation ini

sangatlah melimpah karena memang bahan baku ini adalah hasil sampingan dari produk

utama yang biasanya hanya dibuang saja. Kelimpahan dan kegunaannya yang masih tidak

banyak diketahui orang juga membuat harga bahan baku 2nd generation relatif rendah. Bahan

baku ini mengandung polimer gula dalam bentuk selulosa dan hemiselulosa, yang mana dapat



dibebaskan denga hidrolisis dan kemudian difermentasi menjadi etanol oleh mikroorganisme

[Millati et al., 2002; Palmqvist and Hahn-Hargendal, 2000].

Penggunaan agricultural by-product sebagai bahan baku utama pembuatan etanol

memiliki keuntungan karena produk sampingan ini sangat berlimpah. kelimpahan

agricultural by-product disebabkan karena masih kurangnya pemanfaatan dari produk

sampingan ini untuk digunakan sebagai bahan baku penghasil energi. Pemanfaatan

agricultural by-product sebagai bahan baku pembuatan etanol dapat mengurangi sampah

agricultural. Bahan baku agricultural by-product, khususnya bagasse, juga menawarkan

biaya yang rendah dengan jumlah yang banyak [ORNL, 2007], yang menandakan bahwa

pengunaan agricultural by-product sebagai bahan baku tidak membutuhkan biaya yang besar.

Selain itu, penggunaan agricultural by-product tidak berkompetisi dengan produk makanan

[Yalun et al., 2013]

Bagasse merupakan produk sampingan utama dari tebu, bagasse merupakan sisa

padatan yang dihasilkan setelah tebu diambil sari gulanya. Saat ini bagasse biasanya dibakar

dalam boiler untuk menghasilkan uap dan listrik [Dias et al., 2009]. Jumlah bagasse

sangatlah banyak, hampir 35% berat dari tebu adalah bagasse [EUBIA, 2006]. Di Indonesia

sendiri jumlah bagasse sangatlah melimpah dengan banyaknya pabrik pabrik gula yang

beroprasi di Indonesia. Setiap tahunnya Indonesia menghasilkan limbah bagasse tebu sebesar

47 juta ton [Rolanda et al., 2012]. Bagasse itu sendiri mengandung 43.6% selulosa, 33.8%

hemiselulosa, 18.1% lignin, 2.3% abu, 0.8% wax [Sun et al., 2004].



Bab II : Tujuan

Secara umum tujuan dari dilakukannya riset ini adalah untuk mempelajari metode

dasar pembuatan bioethanol dari khamir Saccharomyces Cerevisiae sebagai agen untuk

memfermentasikan gula dari agricultural by-product yaitu bagasse. Selain tujuan diatas

adapun tujuan khusus dari riset ini yakni mempelajari pembuatan media padat, pembuatan

media cair, penanaman kultur khamir di media padat, pretreatment dan sakarifikasi bagasse,

serta penanaman kultur khamir di media cair secara aerobik maupun secara anaerobik.



Bab III : Teori Dasar dan Metode Kerja

3.1 Teori Dasar

Pada riset ini akan dibuat bioetanol dengan bahan baku bagasse. Bagasse

merupakan bahan baku lignoselulosa, lignoselulosa merupakan gabungan dari

lignin, hemi selulosa dan selulosa [Amit et al., 2007]. Fungsi utama dari lignin

adalah membentuk struktur pendukung untuk tanaman. Lignin menutupi hemi

selulosa dan selulosa yang mengandung glukosa, oleh karena itu untuk dapat

melakukan fermentasi dengan glukosa yang berasal dari bagasse perlu dilakukan

pretreatment terlebih dahulu yaitu hidrolisis.

Hidrolisis merupakan suatu proses pemecahan molekul air menjadi H+ dan

OH- melalui suatu proses kimia. Dalam riset ini, dilakukan hidrolisis lignoselulosa

yang terdiri dari pretreatment dan hidrolisis selulosa. Proses pretreatment ini

bertujuan memecahkan hemiselulosa dan lignin. Pemecahan dilakukan dengan

metode hidrolisis thermochemical dimana bagasse dicampurkan dengan basa kuat

(NaOH) kemudian dikondisikan dalam suhu dan tekanan tinggi. Sedangkan untuk

hidrolisis selulosa bertujuan untuk memutuskan ikatan glikosidik yang dilakukan

dengan melarutkan asam kuat (H2SO4) encer dalam bagasse kemudian

dikondisikan dalam suhu tinggi.

Pembuatan etanol dilakukan dengan melakukan proses fermentasi.

Fermentasi merupakan proses metabolic yang dilakukan oleh mikro organisme

untuk mengubah karbohidrat seperti gula atau pati menjadi alcohol atau asam.

Pada riset ini akan digunakan khamir atau yeast Saccharomyces Cerevisae. Pada

proses fermentasi sample bagasse, yeast Saccharomyces Cerevisae akan

dimasukkan kedalam larutan sample bagasse. Yeast mengandung enzim invertase

yang akan mengkatalis dan membantu mengubah sukrosa menjadi glukosa dan

fruktosa (C6H12O6).

Invertase

C12H22O11

Sukrosa

+ H2O

Air

C6H12O6

Fruktosa

+ C6H12O6

Glukosa

Fruktosa dan glukosa yang terbentuk akan bereaksi dengan enzim lain yang

disebut enzim zymase yang juga terdapat dalam yeast dan berguna untuk

mengubah glukosa/fruktosa menjadi etanol dan karbon dioksida.

Zymase

C6H12O6

Glukosa / Fruktosa

2C2H5OH

Etanol

+ 2CO2

Karbon dioksida

Proses fermentasi dilakukan selama 3 hari pada suhu 25C 30C.



Etanol yang dihasilkan dari proses fermentasi, masih tercampur dengan

berbagai zat lain seperti air, media tumbuh, dan produk sampingan dari proses

fermentasi yang harus dihilangkan. Untuk mendapatkan etanol yang murni maka

diperlukan proses destilasi. Destilasi merupakan metode yang sering digunakan

untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan kondisi yang dibutuhkan

untuk berubah fasa, seperti perbedaan titik didih. Campuran hasil fermentasi yang

mengandung etanol akan dipanaskan hingga etanol menguap pada 78.3C, etanol

yang menguap kemudian dikondensasi hingga menjadi cair kembali.

Dalam pengukuran kadar etanol, akan digunakan alkoholmeter. Alat ini

biasanya digunakan dalam industri serta rumah tangga untuk mengukur kadar

alkohol dalam suatu zat. Prinsip kerja alkoholmeter berdasarkan berat jenis antara

air dan alkohol. Alkoholmeter dicelupkan kedalam larutan kemudian dilihat angka

yang ditunjukan pada alkoholmeter. Alkohol yang sifatnya memiliki massa jenis

rendah akan cenderung menenggelamkan alkoholmeter yang menunjukan kadar

alkohol dalam larutan cenderung besar. Sebaliknya apabila alkoholmeter

cenderung mengapung, menandakan bahwa densitas dari larutan tersebut tinggi

dan kadar alkohol di dalam larutan cenderung sedikit dan banyak zat pengganggu

lain yang mempengaruhi densitas larutan.

3.2 Metode Kerja

3.2.1 Pembuatan Medium Padat

Dalam pembuatan medium padat digunakan bahan antara lain Yeast

extract 1 % w/v, Peptone 2 % w/v, Dextrone 2 % w/v, Agar - agar 1.5 %

w/v. Bahan - bahan tersebut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 mL dan

dilarutkan dengan 300 mL akuades. Setelah semua bahan tercampur tutup

Erlenmeyer dengan aluminium foil agar tidak terjadi kontaminasi. Masukkan

Erlenmeyer yang berisi campuran bahan kedalam autoclave selama 15 menit

dengan suhu 121 o dengan tujuan mensterilisasi campuran bahan. Setelah

selesai dilakukan sterilisasi, segera tuangkan campuran bahan kedalam

cawan petri agar campuran media yang masih cair tidak membeku dalam

Erlenmeyer, penuangan campuran bahan ini dilakukan dalam laminar agar

tetap steril. Dalam menuangkan campuran bahan kedalam cawan petri

usahakan jangan terlalu tipis atau terlalu tebal agar media padat yang

dihasilkan dapat digunakan untuk menumbuhkan khamir Saccaromyces

Cerevisiae. Seteleh itu inkubasi campuran bahan hingga menjadi padat.

3.2.2 Pembuatan Medium Cair

Pada proses pembuatan media cair semi-sintetik digunakan bahan

(NH4)2SO4 5 g/L, K2SO4 6.58 g/L, KH2PO4 3 g/L, MgSO4 0.5 g/L, Yeast

extract 2 g/L, Glucose 2% w/v. Bahan bahan tersebut dimasukkan kedalam

botol pereaksi 1000 mL dan dilarutkan dengan 500 mL akuades, setelah itu

ditera hingga 1000 mL dengan akuades. Setelah Tutup botol pereaksi,

dalam menutup botol usahakan jangan terlalu keras agar saat disterilisasi



dengan autoclave tidak meledak ketika tekanan tinggi. Masukkan botol

pereaksi yang berisi campuran bahan kedalam autoclave untuk disterilisasi

selama 15 menit pada suhu 121o. Medium cair ini nantinya akan digunakan

dalam perkembang biakan khamir Saccaromyces Cerevisiae secara aerobik

dan anaerobik.

3.2.3 Penanaman Kultur Yeast di Medium Padat

Pada penanaman kultur yeast Saccaromyces Cerevisiae di medium

padat digunakan tusuk gigi untuk alat yang digunakan dalam melakukan

metode T-streak. Metode T-streak ini dilakukan dengan cara seperti pada

gambar.

Gambar 1. Metode T-Streak

Metode ini bertujuan untuk mendapat kan bentuk koloni tunggal dari kultur

yeast Saccaromyces Cerevisiae.

3.2.4 Pretreatment dan Sakarifikasi Bagasse

A. Pretreatment dan sakarifikasi Bagasse (Thermochemical Hydrolysis

Bagasse)

Pada proses pretreatment bagasse digunakan 5 gram bagasse, 250 mL

NaOH 1% w/v, 250 mL H2SO4 1%. Pada tahap campurkan bagasse

dengan 250 mL NaOH 1% w/v, kemudian masukkan kedalam autoclave

dengan suhu 121 o selama 30 menit. Campuran bagasse dan NaOH

kemudian di saring menggunakan corong Buchner yang diberikan kertas

saring, labu vakum, dan pompa vakum. Hasil saringan yang berupa

padatan atau pelet dibilas dengan akuades hingga bersih dari sisa sisa

NaOH. Pelet yang sudah dibilas selanjutnya dicampurkan dengan 250

mL H2SO4 1%, kemudian masukkan kedalam autoclave dengan suhu

121o selama 30 menit. Campuran bagasse dan H2SO4 kemudian disaring

dengan corong Buchner, labu vakum, dan pompa vakum. Pada

penyaringan kali ini ambil air hasil saringan yang berupa sample

bagasse, kemudian masukkan kedalam Erlenmeyer dan tutup dengan



aluminium foil. Tujuan dari pretreatment dan sakarifikasi bagasse

dengan metode Thermochemical Hydrolisis Bagasse ini adalah untuk

memecah lignin dengan basa dan panas yang terdapat pada bagasse dan

memutus rantai selulosa dengan asam dan panas yang terdapat pada

bagasse menjadi rantai pendek glukosa yang natinya akan difermentasi

dengan yeast Saccaromyces Cerevisiae menjadi etanol.

B. DNS Method

Proses ini bertujuan untuk mengukur kadar gula yang terkandung

dalam bagasse menggunakan kurva standar yang dibuat dengan 5

larutan gula yang sudah diketahui konsentrasi dan dihitung absorbance-

nya dengan spektrofotometer. Pada proses tahap pertama ini dibutuhkan

5 larutan gula dengan konsentrasi 0.75 gr/mL, 0.5 gr/mL, 0.3 gr/mL, 0.2

gr/mL, 0.1 gr/mL yang masing masing dibuat sebanyak 5 mL. Masukkan sampel sampel tersebut kedalam tabung reaksi menggunakan mikro pipet 1000 L agar dapat mencapai konsentarasi

larutan yang tepat karena kuantitas larutan yang dipakai dalam proses is

sangat sedikit. Kemudian masukkan masing - masing 0.5 mL larutan

glukosa kedalam tabung reaksi dengan mikro pipet 1000 L, tambahkan

0.5 mL akuades dan 1.5 mL DNS, siapkan juga 1 mL akuades ditambah

1.5 mL DNS yang akan digunakan sebagai blanko, larutan blanko ini

digunakan untuk menstandarisasi spektometer sebelum digunakan

untuk mengukur absorbance dari larutan gula. Masukkan setiap larutan

gula kedalam kuvette, ukur absorbance masing masing larutan glukosa dengan spektometer dengan panjang gelombang 540 nm,

panjang gelombang ini digunakan berdasarkan hasil serapan maksimum

dan bisa didapatkan dengan percobaan. Setelah didapatkan absorbance

dari larutan gula, buat kurva standar yang bertujuan untuk mendapatkan

persamaan hukum Lambert-Beer yang nantinya dapat digunakan untuk

menentukan kandungan gula dalam bagasse.

Pada proses tahap kedua dibutuhkan sampel bagasse yang sudah

diencerkan 10x dan 20x, pengenceran ini bertujuan agar konsentrasi

sampel bagasse tidak terlalu pekat dan dapat dibaca dengan tepat oleh

spektrofotometer. Sebelum diencerkan sampel bagasse akan dinetralkan

terlebih dahulu menggunakan KOH 5 M yang ditambahkan secara

terukur menggunakan mikro pipet, perhitungan pH dilakukan dengan

pH meter. Masukkan sampet bagasse yang sudah diencerkan dan

dinetralkan masing masing ke dalam tabung reaksi sebanyak 0.5 mL. Tambahkan 0.5 mL akuades dan 1.5 mL DNS, kemudian tutup tabung

reaksi dengan aluminium foil agar sampel tidak tereduksi oleh cahaya.

Panaskan semua sampel bagasse selama 10 menit, tutup tabung reaksi

dengan klereng agar larutan tidak menyembur keluar saat dipanaskan.

Setelah 10, ambil sampel dan diamkan pada suhu ruang.

Pada tahap ketiga akan dilakuan pengukuran absorbance dari

sampel bagasse. Pindahkan larutan dalam tabung reaksi ke kuvette

untuk diukur absorbance-nya dalam spektometer dengan panjang

gelombang 540 nm. Setelah diketahui absorbance danri sampel

bagasse, persamaan yang sudah didapatkan dalam proses tahap pertama



dapat digunakan untuk menentukan kadar gula dalam sampel bagasse

ini.

3.2.5 Penanaman Kultur Yeast di Medium Cair secara Aerobik dan

Anaerobik

Untuk penanaman kultur di medium cair secara aerobik dibutuhkan

medium cair sebanyak 100 mL. Tambahkan gula sebanyak 5 gram dan aduk

hingga larut dengan tujuan mendapatkan larutan dengan 5 % gula. Untuk

mensterilisasi medium cair yang sudah ditambahkan gula, digunakan

membrane filter dengan ukuran pori 0.22 m, cara filtrasi dengan membran

filtrat lebih baik untuk tahap ini jika dibandingkan sterilisasi dengan panas

dengan alasan panas dapat merusak protein yang ada dalam media cair.

Medium cair yang sudah steril kemudian di pisahkan ke dalam dua tempat

yang berbeda dengan perbandigan 50 : 50 dengan tujuan 50 mL untuk

penanaman kultur secara aerobik dan 50 mL untuk penanaman kultur secara

anaerobik. Untuk kultur secara aerobik digunakan erlenmeyer buffel flask

agar yeast dapat menangkap udara dengan baik saat diinkubasi dan untuk

kultur secara anaerobik digunakan Erlenmeyer biasa. Sebelum inokulum

Yeast Saccaromyces Cerevisiae dimasukkan kedlam media, akan diukur

terlebih dahulu optical density-nya dengan menggunakan spektofotometer

dengan panjang gelombang 660 nm. Sebelum diukur, encerkan inokulum

sampai 10x. Masukkan inokulum Yeast Saccaromyces Cerevisiae 0.36 mL

kedalam masing - masing media cair yang sudah dipisahkan. Inkubasi kedua

media cair, untuk kultur secara aerobik inkubasi dilakukan dalam shaker

dengan suhu 30 o dan rotasi 200 rpm agar yeast dapat lebih baik menagkap

udara karena adanya rotasi, dan untuk kultur secara anaerobik inkubasi

dilakukan dalam oven dengan suhu 30 o.

3.2.6 Scale Up

Dalam penanaman kultur yeast secara anaerob dalam skala besar (2

liter) ini dibuat media cair semi sintetik yang dibuat dari (NH4)2SO4

sebanyak 10 gram/L, K2SO4 13.16 gram/L, KH2PO4 6 gram/L, MgSO4 1

gram/L Yeast extract 4 gram/L, dan gula pasir 10% w/v. setelah itu media

dilarutkan dengan akuades 1950 mL dan inokulum 50 mL ke dalam tabung

Erlenmeyer 2000 mL. setelah larut kemudian diambil sampel dalam larutan

ini untuk pengukuran OD. Dalam scale up ini, glukosa yang akan

difermentasikan tidak lagi didapat dari bagasse karena konsentrasi glukosa

yang didapat dari metode DNS sebelumnya terlalu kecil dan meleset dari

perkiraan sehingga akan sulit apabila melanjutkan fermentasi menggunakan

bagasse sebagai sumber glukosa. Karena itu digunakan gula pasir sebagai

pengganti sumber glukosa. Media cair tersebut kemudian di sterilkan dan

dikondisikan anaerobik. Media dimasukan kedalam oven dengan suhu

sebesar 30 0C selama 3 hari yang bertujuan agar glukosa di dalam larutan



yang kita dapatkan benar-benar habis terkonversi menjadi etanol. Setelah 3

hari, Erlenmeyer di keluarkan dari oven dan di dibiarkan dalam suhu

ruangan dan etanol siap diukur. Tujuan dari scale up ini adalah untuk

memperbesar volume glukosa yang difermentasi sehingga hasil etanol akan

lebih banyak dan pengukuran kadar alkohol dapat dilakukan dengan lebih

mudah.

Pengukuran OD (optical density) bertujuan untuk mengetahui jumlah

yeast saccharomyces cerevisiae sebelum dan sesudah fermentasi.

Pengukuran OD dari kultur di lakukan pada saat sebelum fermentasi dan

sebelum fermentasi. Sampel di ambil dengan pipet kemudian di simpan

(untuk sampel sebelum fermentasi). Setelah fermentasi, diambil sampel dari

media dengan pipet kemudian dimasukan kedalam kuvet. Ke dalam kuvet

yang berbeda juga dimasukan sampel sebelum fermentasi serta larutan

blanko yang didapat dari YPD. Dari ketiga kuvet tersebut di ukur optical

density dengan metode spektrofotometri.

3.2.7 Pengukuran Kadar Alkohol

Dalam pengukuran kadar etanol, ada 2 metode yang dapat diterapkan

yakni metode analitik dan metode skala rumah tangga / industri. Dalam

metode analitik, dapat digunakan beberapa alat seperti HPLC (High

Performance Liquid Chromatography) atau GC-MS (Gas Chromatography

Mass Spectrometry) yang dapat melihat profil keseluruhan analit didalam

sampel yang ingin diketahui komponennya.

Dalam riset ini, akan digunakan pengukuran dengan metode skala

rumah tangga / industri dengan menggunakan alkoholmeter. Pengukuran

dilakukan dengan menggunakan air keran (air tawar), alkohol 95% dan

media cair semi sintetik sebagai pembanding, serta fermentation broth yang

akan diukur kadar alkoholnya. Air keran dimasukan kedalam silinder ukur

kemudian alkoholmeter dicelupkan kedalamnya kemudian dilihat angka

yang tertera dalam alkoholmeter yang menunjukan % alkohol didalam

larutan. Apabila kadar alkohol semakin tinggi alkoholmeter akan semakin

tenggelam sebaliknya apabila kadar alkohol semakin rendah maka

alkoholmeter akan semakin terangkat / mengambang. Percobaan dilakukan

dengan volume yang berbeda-beda. Kemudian, dilakukan perlakuan yang

sama seperti air keran terhadap alkohol 95%, media cair dan fermentation

broth.



Bab IV : Hasil dan Pembahasan

4.1 Medium Padat

Komponen medium padat dengan pengukuran aktual :

Yeast Extract 1% 3.0050 gr.

Peptone 2% 6.0559 gr.

Dextrose 2% 6.0163 gr.

Agar 1.5% 4.5273 gr.

Akuades hingga 300 ml

Gambar 2. Media padat YPD

4.2 Medium Cair

Komponen media cair semi-sintetik dengan pengukuran actual dalam 1000 ml :

(NH4)2SO4 5.00 gr K2SO4 6.58 gr KH2PO4 2.99 gr MgSO4 0.5097 gr Yeast extract 2.0066 gr Glukosa 20.0613 gr

Akuades hingga 1000 mL

Gambar 3. Media cair semi sintetik

4.3 Penanaman Kultur Yeast dalam Medium Padat

Gambar 4. YPD yang sudah ditumbuhi kultur yeast dengan metode T-Streak.



4.4 Pretreatment, Sakarifikasi Bagasse dan DNS Method

Pada awalnya sebelum kami mengukur kandungan gula dalam bagasse,

digunakan prinsip hukum Lambert-Beer untuk membuat plot grafik hubungan

antara konsentrasi sampel (glukosa) dengan absorbansinya dengan metode DNS.

Untuk kalibrasi dibuat larutan blanko yang mendapat perlakuan sama dengan

sampel namun tidak mengandung sampel.

Komponen larutan yang diujikan:

o Sampel 0.5 mL

o DNS 1.5 mL

o Akuades 0.5 mL

Komponen larutan blanko:

o DNS 1.5 mL

o Akuades 1 mL

Untuk sampel bagasse, karena asumsi kami kandungan gula didalam bagasse

cukup besar, maka kami melakukan pengenceran sebesar 10x dan 20x.

Konsentrasi Sampel

(mg/mL)

Absorbansi

0.1 0.034

0.2 0.155

0.3 0.277

0.5 0.502

0.75 0.907

pengenceran 10x 0.045

Pengenceran 20x 0.021

Table 1. Data pengamatan absorbansi pada spektrofotometer

Dari tabel diatas di buatlah kurva standar untuk mendapatkan persamaan untuk

mencari nilai kandungan gula didalam sampel uji.



Grafik 1. Kurva standar sampel glukosa

Dari persamaan yang didapat dari kurva diatas, dimana:

Y = 1.3246X - 0.1151

Dimana Y adalah absorbansi dan X adalah kandungan gula yang terdapat di dalam

sampel maka didapat:

Konsentrasi sampel bagasse pengenceran 10x = 0.12086 mg/mL.

Konsentrasi sampel bagasse pengenceran 20x = 0.10274 mg/mL.

Gambar 5.1. Sampel dalam tabung reaksi Gambar 5.2. Sampel di dalam kuvet

Karena asumsi sedikit meleset, dimana kandungan gula yang didapat dari sampel

bagasse pengenceran 10x dan pengenceran 20x terlalu kecil kami melakukan

pengujian ulang dengan konsentrasi sampel yang berbeda yakni:

Pengenceran sampel bagasse 5x yang didapat nilai absorbansinya sebesar

0.189.

Sampel bagasse tanpa pengenceran yang didapat nilai absorbansinya sebesar

1.649.

Masih dengan persamaan yang sama yang didapat dari kurva diatas

didapat konsentrasi sampel bagasse dengan pengenceran 5x sebesar 0.2295

mg/mL dan konsentrasi sampel bagasse tanpa pengenceran sebesar 1.33719

mg/mL.

Dari nilai konsentrasi yang didapat, akan sulit apabila melanjutkan ke

tahap berikutnya karena jumlah etanol yang terkonversi dari gula yang sangat

sedikit juga akan menghasilkan entanol yang sedikit. Untuk itu sebelum

melanjutkan ke proses berikutnya, ditambahkan gula sebanyak 5 gram pada media

cair. Penambahan gula di tengah proses seperti ini memang tidak disarankan

karena media yang sudah ada sudah steril namun karena adanya penambahan gula

kita harus mensterilisasikannya lagi.



4.5 Penanaman Kultur Yeast di Medium Cair secara Aerobik dan

Anaerobik

Gambar 6. Penanaman kultur secara anerobik dan aerobik

Dari nilai konsentrasi yang didapat pada proses sebelumnya, akan sulit

apabila melanjutkan ke tahap berikutnya karena jumlah etanol yang terkonversi

dari gula yang sangat sedikit juga akan menghasilkan etanol yang sedikit. Untuk

itu sebelum melanjutkan ke proses berikutnya, kami tidak lagi menggunakan

bagasse tapi melainkan menggantikannya dengan menambahkan gula sebanyak 5

gram pada media cair dalam 100 mL. Penambahan gula di tengah proses seperti

ini memang tidak disarankan karena media yang sudah ada sudah steril namun

karena adanya penambahan gula kita harus mensterilisasikannya lagi.

Inokulum ini setelah kami encerkan 10x, didapat nilai optical density sebesar

1.4 yang berarti nilai optical density sebenarnya sebesar 14. Hal ini

mengindikasikan bahwa terdapat 3-4 gram Saccharomyces Cerevisiae di tiap liter

inokulum tersebut.

4.6 Scale Up

Dalam pembuatan media cair semi sintetik, komposisi bahan yang terukur

adalah sebagai berikut:

(NH4)2SO4 10.04 gr

K2SO4 13.20 gr

KH2PO4 6.09 gr

MgSO4 1.06 gr

Yeast extract 4.03 gr

Gula pasir 200.11 gr

Gambar 7. Fermentation broth



Dalam pengukuran optical density, digunakan panjang gelombang 660 nm

dan didapat optical density sebelum fermentasi sebesar 0.413 dan sesudah

fermentasi di dapat OD sebesar 0.639. Kenaikan optical density ini menandakan

adanya petambahan jumlah yeast dalam fermentation broth selama proses terjadi,

hal ini terjadi karena yeast Saccharomyces Cerevisiae berkembang biak saat

proses fermentasi terjadi.

4.7 Pengukuran Kadar Alkohol

4.7.1 Pada Alkohol 95%

Gambar 8. Pengukuran kadar alkohol pada alkohol 95%

Jika dilihat dari gambar, dapat dilihat bahwa alkoholmeter menunjukan

angka 80, hal ini menunjukan bahwa kadar alkohol yang terdapat pada

larutan alkohol tersebut adalah 80%. Memang ada ketidak sesuaian antara

kadar alkohol hasil pengukuran dengan kadar alkohol yang terdapat pada

label yaitu 95%.

4.7.2 Pada Air Tawar

Gambar 9. Pengukuran kadar alkohol pada air tawar



Jika dilihat pada gambar, kadar alkohol pada air adalah 0. Percobaan ini

membuktikan bahwa alkoholmeter yang digunakan tidak mengalami kerusakan

sehingga dapat digunakan untuk mengukur larutan yang mempunyai kadar alkohol

tertentu, karena pada saat mengukur air yang tidak mengandung alkohol, angka

pada alkoholmeter menunjukan angka 0.

4.7.3 Pada Media Cair Semi sintetik

Gambar 10. Pengukuran kadar alkohol pada media cair semi sintetik

Pada pegukuran kadar alkohol yang terdapat dalam media cair semi

sintetik, angka kadar alkohol tidak dapat terbaca seperti yang terlihat pada

gambar. Seperti yang telah diketahui bahwa prinsip pengukuran dengan

alkoholmeter adalah berdasarkan massa jenis dari larutan yang diukur. Pada

media cari semi sintetik diketahui bahwa didalamnya banyak campuran-

campuran bahan seperti gula, dan yeast extract yang dapat mempengaruhi

pengukuran, diketahui juga bahwa pada media cair semi sintetik tidak

terkandung alkohol karena belum ada yeast yang dicampurkan dan belum

difermentasikan, sehingga seharusnya kadar alkohol dari media cair semi

sintetik adalah 0.



4.7.4 Pada Fermentation Broth

Gambar 11. Pengukuran kadar alkohol pada fermentation broth.

Sama halnya dengan pengukuran kadar alkohol pada media cair semi

sintetik. Kadar alkohol pada fermentation broth juga tidak dapat ditentukan

walaupun yeast sudah dicampurkan dan proses fermentasi sudah terjadi

sehingga seharusnya terdapat alkohol di dalam fermentation broth. Keadaan

seperti ini terjadi karena dalam fermentation broth tidak hanya ada alkohol

saja melainkan masih banyak senyawa senyawa lain yang mungkin masih

tersisa, seperti gula dan yeast atau adanya hasil sampingan dari proses

fermentasi, seperti karbon dioksida dan asam, sehingga kadar dari alkohol

dalam fermentation broth tidak dapat terukur.

Jika dilakukan perhitungan secara teoritis maka seharusnya jumlah

etanol yang didapatkan adalah :

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

0.5843 mol - -

0.5843 mol 0.5843 mol 0.5843 mol

-

0.5843 mol 0.5843 mol

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

0.5843 mol - -

0.5843 mol 1.1686 mol 1.1686 mol

- 1.1686 mol 1.1686 mol

MWsukrosa = 342.29648 g/mol etanol = 789 g/L

MWetanol = 46.06844 g/mol



Nsukrosa =

metanol = 1.1686 x 46.06844 = 53.8345 g

Vetanol =

Etanol yang didapatkan dengan asumsi seluruh sukrosa sebanyak 200 g

yang dimasukan terfermentasi semua menjadi etanol, maka akan didapatkan

etanol sebanyak 68.2314 mL.



Bab V : Kesimpulan

5.1 Kesimpulan

Penggunaan agricultural by-product dalam pembuatan bioetanol dengan yeast

Saccaromyces Cerevisiae merupakan langkah yang baik dalam mengatasi krisis

energi dalam skala kecil dan pencemaran lingkungan. Tetapi disamping itu

penggunaan bahan bakar dari bioetanol dalam skala besar masih kurang efisien,

karena energi yang dihasilkan dari etanol masih jauh lebih kecil jika dibandingkan

dengan bensin, hal ini dapat dilihat dari rantai karbon etanol yang lebih pendek dari

rantai karbon bensin. Selain itu proses pembuatan etanol sendiri tidak mudah,

dibutuhkan waktu dan effort yang cukup besar dan juga biaya yang tidak sedikit, hal

ini juga mempengaruhi harga etanol yang menjadi lebih mahal jika dibandingkan

dengan bensin.

5.2 Future Work

Dalam riset ini terdapat kendala yaitu konsentrasi glukosa yang terkandung

dalam sampel bagasse sangat kecil sehingga sulit untuk dilakukan tahap selanjutnya

yaitu fermentasi. Kendala ini kemungkinan besar terjadi karena proses hidrolisis dan

sakarifikasi bagasse yang kurang sempurna. Hidrolisis dan sakarifikasi yang kurang

sempurna dapat mempengaruhi seluruh proses pembuatan bioethanol ini, karena

proses hidrolisis dan sakarifikasi yang kurang sempurna mengakibatkan masih

banyaknya lignin yang menutupi selulosa dan hemi selulosa yang mengandung gula

sehingga sulit untuk mengambil kandungan gula yang terdapat dalam selulosa dan

hemi selulosa. Selain itu pemutusan rantai gula yang kurang sempurna dapat

menyebabkan kesalahan dalam pengukuran kadar gula dengan metode

spektofotometri, karena satu rantai panjang gula yang bisa saja terdiri dari beberapa

rantai glukosa hanya terbaca satu rantai glukosa saja sehingga kadar glukosa yang

terbaca hanya sedikit. Untuk mengatasi kendala ini dapat dilakukan dengan

memperpanjang waktu hidrolisis dan sakarifikasi agar proses tersebut berlangsung

secara sempurna.

Dalam melakukan pengukuran kadar alkohol dengan alkoholmeter, sebaiknya

etanol dalam fermentation broth di murnikan terlebih dahulu dengan cara distilasi

untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang dapat mengganggu pengukuran kadar

alkohol, sehingga kadar alkohol dapat diukur dengan lebih baik.



Refrensi

Agence Internationale De LEnergie. 2008. FROM 1st- TO 2nd-GENERATION BIOFUEL

TECHNOLOGIES.

Amores I, Ballesteros I, Manzanares P, Sez F, Michelena G, Ballesteros M. 2013. Ethanol

Production from Sugarcane Bagasse Pretreated by Steam Explosion.

Arifin Y, Tanudjaja E, Dimyati A, Pinontoan R. 2013. A Second Generation Biofuel from

Cellulosic Agricultural By-product Fermentation Using Clostridium Species for

Electricity Generatio.

Dias M, Ensinas A, Nebra S, Filho R, Rossell C, Maciel M. 2009. Production of bioethanol

and other bio-based materials from sugarcane bagasse: Integration to conventional

bioethanol production process.

Elevri P, Putra S. 2006. Produksi Etanol Menggunakan Saccaromyces Cerevisiae yang

dimobilisasi Dengan Agar Batang.

EUBIA (European Biomass Industry Association). 2006. Creating Markets for Renewable

Energy Technologies EU RES Technology Marketing Campaign.

Indral D, Salim M, Mardiah E. 2012. Pembuatan Bioetanol dari Ampas Sagu dengan

Hidrolisis Asam dan Menggunakan Saccharomyces Cerevisiae.

Laopaiboon P, Thani A, Leelavatcharamas V, Laopaiboon L. 2009. Acid Hydrolysis of

Sugarcane Bagasse for Lactic Acid Production.

Nag A, Pradhan R. 2007. Production of Ethanol From Bagasse.

Nerdy Science Blog. 2014. http://science.kukuchew.com/2008/04/13/plate-streaking/.

Diakses pada hari Kamis, 19 Juni 2014 pukul 15.30 WIB.

Rolanda E, Yuwono T, Widjaja A, Soeprijanto. 2012. Fermentasi Hidrolisat Enzimatik

Bagasse Tebu Menjadi Hidrogen.

STS (Sustainable Tranport Solusion). 2005. Bioethanol Fact Sheet.

Taherzadeh M, Karimi K. 2007. Acid-Based Hydrolysis Processes for Ethanol from

Lignocellulosic Materials.

Laporan Final 1

Documents

Transcript of Laporan Final 1