LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM KIMIA BAHAN ALAM

Kelompok/ gelombang : Chalkon/ IIA

Nama Kelompok :

1. Ratna Mutiara

(G1F013017)

2. Triana Dewi

(G1F013019)

3. Desi Purnamasari

(G1F013021)

4. Ira Yuliana

(G1F013025)

5. Nurul Kamilah S.

(G1F013027)

Tanggal Praktikum

: 27 Mei 2015

Nama AsistenJaga

: Gita dan Nama Dosen Jaga

: Harwoko, M.Sc, Apt.LABORATORIUM BIOLOGO FARMASI

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PURWOKERTO

2015

ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI Manihot utilissima FOLIUM DAN IDENTIFIKASI DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPISI. TUJUAN PRAKTIKUMMemahami dan melakukan isolasi dan analisis kualitatif golongan senyawa flavonoid dari daun ketela pohon (Manihot utilissima) dengan metode kromatografi lapis tipis.II. PENDAHULUANSalah satu senyawa yang terkandung di dalam daun singkong adalah flavonoid rutin. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang mengandung 15 atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6 yaitu cincin benzene yang dihubungkan oleh tiga atom karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga.Flavonoid biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosid. Molekul yang berikatan dengan gula tadi disebut aglikon. Hampir lebih dari 500 aglikon dan kurang lebih 2000 flavonoid yang telah dikenal (Mursyidi, 1989). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa rutin memiliki aksi fisiologis yang luas seperti antiinflamasi, antitumor, antibakteri, dan dapat juga memperbaiki fungsi kapiler yang abnormal dengan mengurangi kebocoran, mengurangi kerusakan kapiler vena karena ketidakcukupan ekstremitas bawah (Ghica & Brett, 2004).

KLT dapat digunakan untuk identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Rf (Retardation faktor) merupakan harga perbandingan titik noda dengan jarak elusi yang ditempuh pada lempeng fase diam (Gandjar & Rohman, 2007). KLT untuk analisis senyawa flavonoid pada prinsipnya sama dengan yang digunakan untuk analisis senyawa organik lain. Pengerjaan KLT pada analisis flavonoid bertujuan untuk mengisolasi flavonoid murni pada skala mikro. Cara analisis ini cukup sederhana, dikerjakan dalam tempo yang singkat, dan dibutuhkan sampel yang sedikit. Sebagai fase diam, selulose mikrokristal, yaitu avicel sangat cocok untuk isolasi flavonoid. Di samping itu dikenal juga fase diam lain yaitu silika dan poliamid (Mursyidi, 1989).

III. BAHAN DAN ALAT

a. BahanBahan-bahan yang digunakan antara lain : aquadest, eter, asam klorida (HCL 2 N), natrium sulfat anhidrat, lempeng selulosa/kertas kromatografi, metanol, amonia, pereaksi sitorobat, fase atas dari campuran n-butanol : asam asetat : air (4:1:5) v/v sebagai eluen.b. AlatAlat-alat yang digunakan antara lain : panci infusa, corong besar, erlenmeyer (50 ml & 250 ml), tabung reaksi, corong pisah (250 ml), cawan porselin, flakon (3), chamber KLT, pipa kapiler, pinset, alat penyemprot, oven, lampu UV366 nm.IV. CARA KERJA1. Isolasi glikosida flavonoid dari Manihot utilissima folium

2. Identifikasi flavonoid dengan kromatografi lapis tipis

V. HASIL PENGAMATANNoPerlakuanHasil pengamatan

1.Simplisia daun singkong ditimbang sebanyak 40 gr

2.Ditambahkan aquades sebanyak 400 ml dan diinfusaInfusa

3.Infusa dimasukan kedaam erlemeyer dan disimpan dalam almari es selama beberapa hariTerbentuk endapan

4.Kertas saring I ditimbang0,44 gram

5.Kertas saring II ditimbang0,787 gram

6.Infusa disaring dan diovenEndapan kering

7.Sedikit endapan dilarutkan dalam metanol:air (50:50)Berwarna agak kehijauan (sari I)

8.Sisa endapan ditambahkan 10 ml HCl 2 NLarutan jernih

9.Larutan direfluks selama 1 jamLarutan berwarna merah muda terdapat endapan

10.Lapisan bawah dikeluarkan dan dipanaskan dalam waterbathLarutan berwarna merah muda tanpa endapan

11. 12.Dimasukan kedalam corong pisah dan ditambahkan n-hekasan 10 ml dikocokTerdapat dua lapisan

13.Lapisan bawah dikeluarkan dan dipanaskan pada waterbathBerwarna jingga (sari III)

14.Lapisan atas disaring dengan menggunakan kertas saring yang sebelumnya sudah ditambahkan 1 gr Na- sulfat anhidrat Berwana bening

15.Diupakan tanpa adanya pemanasan

16.Ditambahkan 2 ml metanol Sari II

17.Disiapkan fase diam (selulosa) fase gerak (n-butanol:asam asetat:air) (4:1:5)

18.Cupliakan sari I,II,III dan laruta standar ditotolakan pada plat KLT

19.Dimasukan kedalam chamber yang sebelumnya sudah dilakukan penjenuhan 7 cm

20.Dideteksi pada sinar UV 366

21.Dilakukan penguapan amonia dan dideteksi dibawah sinar UV 366

22.Disemprotkan pereaksi sitroborat kemudian dipanaskan 110 C selama 5 menit dan diamati dibawah sinar UV 366 1 2 3 4

1 2 3 4

23. Ditandai bercak flavonoidKet : 1 : sari I

2 : sari II

3 : standar sari I

4 : standar sari II

24.Dicatat nilai Rf dan warna yan terbentuk

VI. PEMBAHASAN

Ketela pohon atau Manihot utilissima Pohl. Merupakan tumbuhan yang bagian daunnya dikenal mengandung flavonoid. Pada percobaan ini, yang dipelajari adalah melakuakan isolasi glikosida flavonoid dari daun ketela pohon dan kemudian melakukan analisis kualitatif flavonoid dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) serta analisis kuantitatif dengan metode spektofotomerti terhadap isolasi tersebut. Langkah pertama, serbuk simplisia dimasukkan ke dalam panci infusa dan ditunggu sampai mendidih atau suhu panci atas mencapai 900C dan diabiarkan selama 15 menit. Infusa adalah suatu ekstraksi dengan pelarut air pada temperature penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperature terukur 96-980C) selama waktu tertentu (15-20 menit) (Voigt, 1995).

Campuran simplisia yang telah di infusa disaring menggunakan corong Buchner sehingga diperoleh filtrate yang jernih dan dipindahkan ke dalam Erlenmeyer. Disimpan di dalam lemari es selama 1 minggu sehingga terbentuk kristal amorf putih kekuningan. Kristal yang terdapat di dasar Erlenmeyer disaring dengan kertas saring dan kristal dicuci dengan air es agar kemurnian filtrate bertambah dan terbebas dari pengotor-pengotor yang tidak ingin diisolasi, tetapi dengan pencucian ini tidak menyebabkan kristal larut. Kertas saring bersama endapan dikeringkan pada suhu 500C untuk memperoleh hasil rendemen.

Sedikit endapan dilarutkan dalam campuran methanol-air (sari 1) dan sisa endapan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan HCL. Sari 1 ini berisi flavonoid yang masih mengandung glikon dan aglikon (rutin). Flavonoid merupakan senyawa polifenol dan senyawa polihidroksi yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam pelarut polar seperti methanol, etanol, aseton, air, butanol, dimetil formamida. Gugus glikon yang terdapat pada flavonoid menyebabkan flavonoid larut dalam air. Sehingga proses melarutkan sari 1 ke dalam campuran methanol-air untuk melarutkan gugus aglikon dan glikon yang terdapat pada flavonoid rutin. Penambahan HCl dimaksudkan untuk proses hidrolisis agar glikosida flavonoid rutin terhidrolisis sehingga aglikon flavonoid (kuarsetin) terpisah dengan molekul gulanya. Kuarsetin ini termasuk aglikon flavonoid (zat bukan gula) yang berdasarkan strukturnya dapat digolongkan menjadi flavonol. Endapan dilakukan refluks pada penangas air mendidih selama 1 jam dengan ditaruh corong kecil berisi kapas untuk mencegah penguapan. Refluks mengubah warna larutan flavonoid-HCl menjadi merah muda. Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik (Ditjen POM, 2000).

Selanjutnya larutan ini diletakkan di dalam corong pisah kemudian ditambahkan n-heksan. Perlakuan tersebut akan membentuk dua lapisan. Lapisan atas merupakan larutan n-heksan dan lapisan bawah merupakan larutan air. Hal ini menunjukkan terpisahnya glikon dan aglikon. Diantara glikon dan aglikon, senyawa glikon lebih polar daripada aglikon jadi aglikon akan larut pada pelarut nonpolar begitu juga dengan glikon akan larut pada pelarut polar. N-heksan merupakan pelarut nonpolar sehingga akan melarutka aglikon dan air merupakan pelarut polar yang akan melarutkan gula. Lapisan n-heksan berada di atas dikarenakan berat molekul n-heksan lebih kecil daripada air. Kemudian kedua lapisan tersebut dipisahkan. Dilakuakan ekstraksi keduakali dengan penambahan n-heksan lagi untuk menambah kemurnian kedua larutan. Larutan n-heksan disaring melalui kertas saring yang berisi 1 gram natrium sulfat anhidrat ke dalam cawan porselin. Penyaringan melalui natrium sulfat anhidrat dikarenakan untuk menarik air yang masih terikut dalam larutan n-heksana. Kemudian larutan n-heksan diuapkan hingga residu diperoleh dan residu dilarutkan dalam methanol (sari 2). Metanol digunakan untuk melarutkan senyawa aglikon karena aglikon larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilformadida, dan dimetilsukfosida. Larutan air diupakan di atas penangas air sampai cairan tinggal kira-kira 1 ml (sari 3) (Grotewold, 2008).

Analisis kuantitatif dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis. Sebelum dilakukan analisis, dipersiapkan fase diam dan fase gerak (eluen). Fase diam yang digunakan adalah silica yang bersifat polar dan fase gerak berupa n-butanol: asam asetat: air dengan perbandingan (4:1:5) yang bersifat sangat polar karena mengandung air dan mampu memberikan pemisahan terbaik. KLT merupakan suatu metode pemisahan suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusi dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Kepolaran fase diam dan fase gerak hampir sama, tetapi masih lebih polar fase gerak sehingga senyawa flavonoid yang dipisahkan terangkat mengikuti aliran eluen, karena senyawa flavonoid bersifat polar. Eluen yang baik ialah eluen yang bisa memisahkan senyawa dalam jumlah yang banyak yang ditandai dengan munculnya noda. Noda yang terbentuk tidak berekor dan jarak antara noda satu dengan lainnya jelas (Harborne, 1987).

Fase gerak yaitu campuran larutan n-butanol: asam asetat: air didiamkan selama 24 jam sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas yaitu lapisan yang mengandung butanol jenuh air digunakan sebagai fase gerak. Detektor yang digunakan adalah lampu UV366warna/fluoresensi yang terbentuk adalah fluoresensi kuning-kuning kehijauan dibawah sinar UV366 nm (Bohm, 1998), uap ammonia, dan pereaksi sitoborat yang bereaksi dengan flavonoid menghasilkan kompleks berwarna kuning. Sari 1 dan 2 yang telah diperoleh ditotolkan ke plat KLT sebanyak 5 kali, hal ini bertujuan agar senyawa yang di analisis dapat terbaca dengan jelas. Di dalam plat KLT senyawa yang ditotolkan selain sari 1 dan 2 adalah standar rutin dan kuarsetin sebagai pembanding dalam melakukan analisis. Selanjutnya plat KLT dimasukkan ke dalam chamber KLT berisi fase gerak yang telah dijenuhkan. Cara untuk mengetahui bahwa fase gerak tersebut jenuh di dalam chamber dengan menggunakan kertas saring yang di masukkan ke dalam chamber KLT.

Hasil KLT berupa bercak yang terlihat berwarna kuning berasal dari standar rutin sedangkan senyawa yang di analisis tidak menimbulkan bercak karena hidrolisis yang belum sempurna dan pemisahan KLT yang kurang sempurna membuat analisis sulit dilakukan sehingga sulit untuk menghitung nilai Rf senyawa rutin dan kuarsetin. VII. DAFTAR PUSTAKA

Bohm, B, A, 1998, Introduction to Flavonoids, Harwood Academic Publishers, Netherland.

Ditjen POM, 2000,Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat Cetakan Pertama, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Gandjar, G.H., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Ghica and Brett, 2004, Electrochemical Oxidation of Rutin, Departamento de Qu_mica, Faculdade de Ciencias e Tecnologia, Universidade de Coimbra, 3004-535 Coimbra, Portugal, Journal,313-318, (online), (http;//www.Electrochemical Oxidation of Rutin, diakses 02 Juni 2015).Grotewold, E, 2008, The Science of Flavonoids, Springer, USA.

Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia Jilid II, Penerbit ITB, Bandung.

Mursyidi, achmad. 1989. Analisis metabolit sekunder,UGM Press, Yogyakarta.Voight, R., 1995, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, diterjemahkan oleh Soendari Noerono, Gajah Mada University Press, Yogyakarta.Pertanyaan

1. Apakah perbedaan antara infusa dengan dekokta?

Jawab :

Infusa adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia dengan air pada suhu 900 C selama 15 menit sedangkan dekokta adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia dengan air pada suhu 900 C selama 30 menit2. Sebutkan keuntungan dan kerugian penyarian glikosida flavonoid dengan air?Jawab :

Keuntungan :

1. Murah dan sederhana

2. Tidak beracun

3. Tidak mudah menguap4. Tidak mudah terbakarKerugian :

1. Mudah tercemar oleh bakteri dan kapang

2. Tidak stabil bila disimpan dalam waktu yang lama

3. Diperlukan waktu yang lama untuk pengeringan

4. Banyak komponen polar yang larut bersama air

3. Bagaimana dapat diketahui bahwa hidrolisis yang dikerjakan telah sempurna?Jawab :Deteksi warna dapat dilakukan untuk mengetahui bahwa hidrolisis yang dikerjakan telah sempurna. 4. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glokosida) dan aglikonnya?Jawab :Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar, sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atau etanol. Filtrate yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untuk mempercepat pembentukan kristal.Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapat hasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. Terlihat berupa tidak berwarna pada sinar tampak, berwarnabiru keunguan pada sinar UV254nm, biru keunguan pada sinar UV 366nm, dan memberikan fluoresensi berwarna biru terang dengan penampak bercak AlCl3. 5. Apakah dasar pemisahan senyawa dengan metode kromatografi lapis tipis?Jawab:Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama6. Berikan 2 contoh fase gerak lain yang bias digunakan dalam identifikasi flavonoid?Jawab :

1. Air-methanol-asam asetat (1:18:1)

2. Benzene-asam asetat-air (125:75:5)