MODUL 8Deteksi Fragmen DNA menggunakan Elektroforesis Gel

I. TujuanMemahami cara mendeteksi dan memisahkan fragmen-fragmen DNA melalui elektroforesis gel agarosa.

II. PrinsipPada tahapan ini, loading buffer ditambahkan kedalam suspensi DNA dengan tujuan untuk menambahkan densitas dan mewarnai DNA sehingga memudahkan penandaan migrasi DNA. Suspensi tersebut kemudian dipipet kedalam sumur gel agarosa. Larutan etidium bromide (1/100mL) ditambahkan ke dalam gel agarosa sebelum gel membeku. Visualisasi DNA hasil elektroforesis dilakukan dengan mengamati pita DNA yang terdifusi ke dalam gel agarosa pada trasluminator UV. Berat molekul dan kuantitas jumlah DNA diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap laju migrasi fragmen-fragmen DNA standar (DNA marker).

III. Teori DasarIsolasi atau ekstraksi DNA merupakan pemindahan DNA dari sel dan langkah awal pada proses analisa DNA dengan menggunakan metode elektroforesis atau PCR (Rice, 2010). Sedangkan elektroforesis adalah proses pemindahan makromolekul, terutama protein dan asam nukleat yang berbeda dalam segi ukuran, muatan, atau massa. Ketika molekul bermuatan ditempatkan pada medan listrik maka akan bergerak sesuai dengan muatannya, contohnya protein ada yang bermuatan positif, negatifl atau netral. Berbeda dengan protein, asam nukleat bemuatan negatif yang konsisten maka akan bergerak kearah anoda sesuai dengan bobot massanya (Marks, 2000). Gel yang biasa digunakan pada elektroforesis adalah agarose dan polikrilamida. Pada praktikum digunakan gel agarose yang terbuat dari ganggang laut dengan struktur dasar D-galaktose dan 3,6-anhidro L-galaktosa. Gel agarose dapan memisahkan DNA mulai dari 200 pb sampai 50.000 pb (Sudjadi 2008). Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan migrasi melewati gel elektroforesis. Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis (Lawrence 1989: 156).Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar. (Davisdkk. 1994: 151).Praktikum elektroforesis gel menggunakan gel agarosa.Gel agarosa diperoleh dari rumput laut dan biasanya digunakan dalam konsentrasi 0,5--2%.Alasan memakai agarosa dibandingkan poliakrilamida adalah agarosa mudah untuk disiapkan karena proses pembuatannya mudah.Gel agarosa dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutanbuffer, kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras.Gel agarosa juga bersifat non-toxic(Bowen 2000: 1).Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan sarung tangan (Schleif 1993: 26--29).Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:1. Ukuran Molekul DNAMolekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.2. Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.3. Bentuk molekulMolekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.4. Densitas muatanDensitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.5. Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.6. VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.7. LarutanbufferelektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA. (Wolfe 1993: 127)Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNAfinger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500501)Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil apmlifikasi. Marker DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya (Martin 1996: 77).

IV. Alat dan BahanIV.1BAHAN:1. DNA marker, gene ruler 1Kb (6)2. Suspensi DNA berupa DNA kromosom bakteri, DNA plasmid, dan DNA plasmid hasil restriksi3. Agarosa4. Larutan dapar TAE 1x (242 g Tris-base; 57,1 g asam asetat glasial; 100 mL EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam aquadest hingga 1000mL)5. Aquadest6. Loading dye 6x ( 0.25% bromofenolbiru; 0.25% xylene cyalol FF, sukrosa 40%)7. Etidium bromide IV.2ALAT:

Alat Elekroforesis Gel Gelas Ukur 1000mLKaca Mata UV

Kamera Digital Kertas ParafilmLabu Erlenmeyer 50mL

MikropipetSarung TanganTabung Eppendrof

Tip MikropipetTransluminator UV

V. ProsedurGel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,3 gram agarosa ke dalam larutan dapar TAE 1x hingga 30 mL di dalam erlemeyer. Larutan agarosa kemudian di didihkan hingga larut sempura (jernih). Setelah itu, gel agarosa didiamkan hingga hangat. Baki gel agarosa disiapkan dengan melekatkan selotip dikedua ujung baki,lalu sisir elektroforesis dipasang pada salah satu ujung baki. Setelah gel agarosa hangat, Ditambahkan larutan etidium bromida 0,2 L, goyang erlenmeyer hingga larutan gel menjadi homogen. Larutan Gel dituangkan ke dalam baki gel agarosa, lalu dibiarkan hingga beku. Sisir elektroforesis dicabut dengan hati-hati, lalu selotip pada ujung-ujung baki dilepaskan. Gel agarosa dimasukkan kedalam tangki elektroforesis yang telah diisi larutan dapar TAE 1x dan gel agarosa harus terendam seluruh permukaannya oleh TAE. Setelah itu, Sampel (DNA Kromosom, DNA plasmid Restriksi, DNA plasmid non Restriksi) sebanyak 10 L dan loading dye 2 L dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet secara berulang dengan pemipetan. Campuran DNA masing-masing dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa. Sumur nomor 6 diisi dengan DNA Kromosom,7 dan 8 diisi dengan DNA plasmid Restriksi dan DNA plasmid non-Restriksi. Sedangkan DNA marker disi pada sumur nomor 5. Kabel dari sumber arus dihubungkan ke tangki elektroforesis, dimana kabel yang tersambung ke kutub negatif harus berada didekat sumur. Sumber arus dinyalakan sumber arus, voltase diatur pada 90 volt, kekuatan arus 400mA dan waktu running selama 1 jam 45 menit. Elektroforesis dirunning dengan menekan tombol run pada sumber arus. Setelah elektroforesis selesai, maka sumber arus dimatikan dan baki diangkat dari tangki elektroforesis. Gel dikeluarkan dari baki elektroforesis. Gel diletakkan di atas transluminator UV. Transluminator dinyalakan, kemudian pita DNA yang tervisualisasi diamati. Berat molekul dan kuantitas jumlah DNA diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap laju migrasi fragmen-fragmen DNA marker.

VI. Data PengamatanNo.PerlakuanHasil Pengamatan

1.Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,3 g agarosa ke dalam larutan dapar TAE 1x hingga volume 30 mL dalam erlenmeyer. Kemudian dididihkan hingga larut sempurna.Agarosa larut seluruhnya dan terbentuk larutan agarosa yang jernih

2.Baki gel agarosa disiapkan dengan melekatkan selotip di kedua ujung bakiBaki gel agarosa siap untuk digunakan

3.Diamkan larutan agarosa hingga bersuhu sekitar 50-60 C kemudian ditambahkan larutan etidium bromida 0,2 , goyang erlenmeyer sehingga larutan gel menjadi homogenyLarutan gel agarosa homogen dengan larutan etidium bromida dan berwarna jernih

4.Tuangkan larutan gel ke dalam baki gel agarosa, lalu sisir elektroforesis dipasang pada salah satu ujung kaki , lalu dibiarkan sampai beku. Setelah beku, sisir elektroforesis dicabut dengan hati-hati, lalu selotip pada ujung baki dilepaskanGel membeku dan terbentuk sumur-sumur setelah sisir elektroforesis dicabut

5.Gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi larutan dapar TAE 1x. Seluruh permukaan gel harus terendam dalam TAESeluruh permukaan gel terendam dalam TAE

6.Disiapkan 10 suspensi DNA (DNA marker, DNA kromosom, DNA plasmid, dan DNA plasmid hasil restriksi) dan 2loading dye 6x di tabung eppendorf 1,5 mL. Dihomogenkan campuran tersebut melalui pemipetan berulang dengan mikropipetSuspensi DNA homogen dengan loading dye, dan siap untuk dielektroforesis

7.Campuran DNA masing-masing dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa. Nomor sumur dan jenis suspensi DNA yang dimasukkan dicatat

1 = kosong2 = kosong3 = plasmid nonrestriksi kelompok 14 = plasmid restriksi kelompok 15 = kromosom6 = DNA marker7 = kromosom8 = plasmid restriksi kelompok 29 = plasmid nonrestriksi kelompok 210 = kosong

8.Kabel dari sumber arus dihubungkan ke tangki elektroforesis, dimana kabel yang tersambung ke kutub negatif harus berada di dekat sumur. Elektroforesis dirunning sampai tanda batas yang dibuat.

9.Setelah elektroforesis selesai, baki diangkat, gel dikeluarkan dari baki, kemudian direndam di dalam aquadest selama 15 menitGel siap untuk diamati di bawah transluminator UV

10.Gel diletakkan di atas transluminator UV, diamati pita-pita DNA yangtervisualisasiTerbentuk pita-pita DNA berwarna jingga

11.Berat molekul dan kuantitas jumlah DNA diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap DNA markerDiketahui berat molekul dan kuantitas jumlah DNA

Hasil elektroforesis DNA

Bowen, R. 2000.Principles of gel electrophoresis. 3 Januari 2000: 4 hlm.Tersedia online dihttp://www.vivo.colostate.edu.(Diakses pada 14 Oktober 2013)Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994.Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.Lawrence, E. 1989. Hendersons dictionary of biological terms. 10th ed. John Will & Sons, New York: ix + 637 hlm.Marks D.B, A.D Marks, Collen M.Smith. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis. Penerjemah: Brahm U, terjemahan dari: Basic Medical Biochemistry: Aclicical Approach. Jakarta: EGC.Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi + 175 hlm.Russell, P.J. 1994.Fundamentals of genetics.HarperCollinsCollege Publishers,New York: xvi + 528 hlm.Schleif, R. 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Inc., Belmont: xviii + 1145 hlm.Sujadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.Wolfe, S. L. 1995.Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.